CN108864038A - 3-酰胺基-n-芳基苯甲酰胺类化合物及制备和应用 - Google Patents

3-酰胺基-n-芳基苯甲酰胺类化合物及制备和应用 Download PDF

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CN108864038A CN201810603824.6A CN201810603824A CN108864038A CN 108864038 A CN108864038 A CN 108864038A CN 201810603824 A CN201810603824 A CN 201810603824A CN 108864038 A CN108864038 A CN 108864038A
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徐层林
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崔孙良
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    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants

Abstract

本发明提供3‑酰胺基‑N‑芳基苯甲酰胺类化合物及其可药用的盐，采用汇聚式合成路线，将化合物的合成分为不同合成彻块，通过对接组合，可以快速批量制备目标化合物。经实验证实，本发明提供的化合物能显著延长戊四唑诱导的癫痫发作潜时，降低癫痫发作等级和死亡率；能显著抬高最大电休克诱导的癫痫发作阈值，降低死亡率；还能显著地抬高难治性癫痫的发作阈值；并且没有明显的毒副作用，表明能缓解或控制癫痫发作，甚至对传统药物治疗无效的难治性癫痫有一定的治疗效果，可在制备抗癫痫药物中的应用。本发明的化合物合成所需原料易得，操作简便，工艺可放大性强，适于工业化生产，为癫痫治疗提供了新的药物。通式I的结构：

Description

3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及制备和应用
技术领域
本发明属于医药领域，提供3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及其可药用的盐及制备，和医药用途，尤其是在抗癫痫药物中的应用。
背景技术
癫痫(epilepsy)是临床常见的神经***疾病，其发病率约为1％。目前全球约有七千万癫痫患者，而中国的癫痫患者就有一千多万。癫痫的特征是脑内神经元异常同步化放电引起的癫痫发作(epileptic seizures)。癫痫发作如不加以控制，会对患者的生活质量甚至生命安全造成严重的危害。目前临床主要采用药物来控制癫痫发作。传统的抗癫痫药主要作用于神经元上的离子通道或者是γ-氨基丁酸受体来起到降低脑内的兴奋性，但目前临床仍有约三分之一的患者经历多种不同药物的治疗仍无效，被称为难治性癫痫或顽固性癫痫。难治性癫痫目前尚缺乏有效的治疗手段。手术切除病灶等疗法也只能对部分患者有效，并且极有可能会产生后遗症。因此，迫切需要寻找治疗癫痫的新结构实体化合物。
发明人前期筛选出一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物对于癫痫模型具有较好的治疗效果，为癫痫治疗提供了新的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及其药学上可接受的盐或者溶剂化合物，具有良好的抗癫痫作用。
本发明所提供的3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物具有通式I：
其中：
R1任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，Cl，F,羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基， C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6烷氧基取代的烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基， C3-6杂环烷基，C2-6烯基，C2-6羟基取代的烯基，C2-6炔基，C2-6羟基取代的炔基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
R2选自C5-6芳基或C5-6杂芳基，其中，所述各C5-6芳基或C5-6杂芳基，任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，F，Cl，Br，羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基，C1-6烷基，ORa，SRa和 NRaRb的取代基所取代；
Ra和Rb独立选自H，D，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，其中所述各C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C5-6芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；当Ra和Rb与同一个氮原子连接时，R a， Rb和与他们连接的氮原子一起还可以任选地形成取代或非取代的3-7个原子组成的杂环基；
R3任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，Cl，F,羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基， C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6烷氧基取代的烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基， C3-6杂环烷基，C2-6烯基，C2-6羟基取代的烯基，C2-6炔基，C2-6羟基取代的炔基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
R4选自H，D,C1-20烷基，C1-20卤代烷基，C1-20羟基取代的烷基，C1-20烷氧基取代的烷基，C1-20杂烷基，C3-8环烷基，C3-8杂环烷基，C3-8环烷基和C3-8杂环烷基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代。
所述3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物优选为：
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯(代号5a)；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯(代号5b)；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯(代号5c)；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯(代号5d)；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯(代号5e)；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯(代号5f)；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸(代号CZL-80)；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸(代号6b)。
本发明的第二个目的是提供所述3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：
各类3-氨基苯甲酸(1)与R2取代的酰氯反应得到化合物3-酰胺苯甲酸(2)，各类3-氨基苯甲酸(3)与各类醇(R4OH)在浓硫酸催化下得到化合物3-氨基苯甲酸酯(4)，3-酰胺苯甲酸(2)与3-氨基苯甲酸酯(4)在缩合剂存在的条件下反应得到目标化合物5，经过重结晶得到纯品；化合物5可以经NaOH水解得到目标化合物6。所述缩合剂选用二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并***等。所述各类醇优选甲醇、乙醇、异丙醇。反应式如下：
反应式中各取代基R1、R2、R3、R4、Ra、Rb的定义与通式相同，其中R4不等于H。
本发明的第三个目的是提供所述3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及其可药用的盐在制备抗癫痫治疗药中的应用。本发明提供的化合物在对体外癫痫相关酶活性有抑制作用。尤其八个优选化合物在对体外癫痫相关酶活性有显著的抑制作用。尤其在制备戊四唑诱导的癫痫、最大电休克诱导的癫痫、海人藻酸诱导的慢性癫痫自发和难治性癫痫药物中的应用。对几种癫痫常见实验动物模型(急性戊四唑模型，最大电休克模型，海人藻酸慢性癫痫自发模型以及耐苯妥英钠难治性癫痫模型)的作用表现为：可以显著地抑制戊四唑引起的最高癫痫发作等级，延长发作潜时，降低死亡率；可以显著地抬高最大电休克诱导的癫痫发作阈值，减少发作持续时间，降低死亡率；可以显著的减少海人藻酸慢性癫痫自发模型的癫痫发作次数；还能有效地抬高对苯妥英钠耐受的难治性癫痫模型的发作阈值。同时离体电生理实验发现该化合物可以直接抬高海马锥体神经元兴奋的阈值。且长期给药并没有严重的毒副作用和不良反应。
所述药物由本发明提供的3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及其光学异构体或其药学上可接受的盐、溶剂合物为活性组分，与药学上可接受的载体或赋形剂制成。
所述的药物至少包含一种活性组分或者一种以及多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述的组分可以是本发明的3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物、所述化合物的光学异构体、所述化合物或其光学异构体或其药学上可接受的盐、及其溶剂合物中的任意一种或任意多种。
本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)本发明首次发现3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物对体外癫痫相关酶活性具有较好抑制作用，对经典的体内癫痫急慢性发作模型具有较好的治疗效果，能降低癫痫发作的严重程度并且减少死亡率；(2)本发明首次发现3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物对经典的类似于临床难治性癫痫病人的耐苯妥英钠癫痫模型具有较好的治疗效果，能有效地抬高难治性癫痫动物的癫痫发作阈值；(3)本发明首次发现3- 酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物长期给药无严重的毒副作用。本发明提供的3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物能显著延长戊四唑诱导的癫痫发作潜时，降低癫痫发作等级和死亡率；能显著抬高最大电休克诱导的癫痫发作阈值，降低死亡率；能显著的降低海人藻酸诱导的慢性癫痫自发的次数；还能显著地抬高难治性癫痫的发作阈值；并且没有明显的毒副作用。(4) 本发明制备方法采用汇聚式合成路线，将化合物的合成分为不同合成彻块，通过对接组合，可以快速批量制备目标化合物，具有路线简捷高效、原料易得、工艺可放大性强的优点。
附图说明
图1.化合物5a的核磁共振谱图，A为氢谱图，B为碳谱图。
图2.优选化合物CZL80的核磁共振谱图，A为氢谱图，B为碳谱图。
图3.CZL80等优选化合物均能显著降低体外癫痫相关酶活性，与对照组相比，** p<0.01，***p<0.001。
图4.优选化合物CZL80抬高最大电休克模型的全身性大发作阈值，与对照组相比，* p<0.05。
图5.优选化合物CZL80减少最大电休克模型全身性大发作的持续时间，与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6.优选化合物CZL80降低最大电休克模型的死亡率，与对照组相比，***p<0.001。
图7.优选化合物CZL80降低急性戊四唑模型的最高发作等级，与对照组相比，** p<0.01。
图8.优选化合物CZL80延长急性戊四唑模型到达全身性大发作的潜时，与对照组相比，**p<0.01，***p<0.001。
图9.优选化合物CZL80降低急性戊四唑模型的死亡率，与对照组相比，***p<0.001。
图10.优选化合物CZL80减少慢性海人藻酸模型癫痫自发次数，与给药前相比，* p<0.05，与给药后相比，#p<0.05。
图11.优选化合物CZL80抬高难治性癫痫大鼠的阈值变化率，与溶剂组相比，* p<0.05，***p<0.001，与苯妥英钠组相比，#p<0.05，###p<0.001。
图12.优选化合物CZL80抬高对难治性癫痫大鼠的治疗有效率，与溶剂组相比，* p<0.05，***p<0.001，与苯妥英钠组相比，#p<0.05，###p<0.001。
图13.优选化合物CZL80抬高慢性癫痫小鼠离体脑片海马CA1区锥体神经元动作电位发放的阈值，与给药前相比，***p<0.001。
图14.优选化合物CZL80对清醒小鼠海马CA3的正常脑电节律没有影响，与基线相比，p>0.05。
图15.优选化合物CZL80慢性给药不影响旷场实验中小鼠的运动能力。与对照组相比，p>0.05。
图16.优选化合物CZL80慢性给药不改变小鼠的肝肾组织形态学。
具体实施方式
本发明结合附图和实例作进一步的说明。以下的实施例是说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
本发明所用原料及试剂如无特殊说明，均为商业购买。
实施例1 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯
步骤A：将噻吩-2-甲酸(1.024g，8mmol)加入25mL单口瓶中，加入二氯亚砜(5mL)，升温至回流反应1小时。反应结束后减压除去二氯亚砜，油泵抽干，加入无水四氢呋喃溶解，缓慢滴入用无水四氢呋喃溶解的3-氨基苯甲酸(1a)(1.097g，8mmol)和三乙胺(0.808g，8mmol)，室温反应2小时。反应结束后减压除去四氢呋喃，残余物加水后用10mL乙酸乙酯萃取3次，有机相用10mL饱和食盐水洗3次，有机相减压除去乙酸乙酯后，油泵抽干得白色固体3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酸(2a)，收率95％。
步骤B：将3-氨基苯甲酸(1a)(1.097g，8mmol)溶于10mL甲醇中，在0℃下滴加浓硫酸(0.098克，1mmol)，升温至回流反应1小时。反应结束后减压除去甲醇，油泵抽干得油状物3-氨基苯甲酸甲酯(4a)，收率96％。
步骤C：将3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酸(2a)(0.247g，1mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.191g，1mmol)，1-羟基苯并***(HOBt)(0.135 g，1mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.0122g，0.1mmol)用N，N-二甲基甲酰胺溶解，常温下搅拌30分钟，再加入用N，N-二甲基甲酰胺溶解的3-氨基苯甲酸甲酯(4a)(0.1812g，1.2mmol)，升温至50℃反应过夜。反应结束后加水用10mL乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗3次，有机相减压除去乙酸乙酯后，得到的剩余物用石油醚：乙酸乙酯＝1:1重结晶得到白色固体5a，收率83％。
化合物5a核磁数据(核磁谱图见图1)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.80(s，1H)， 9.73(s，1H)，8.52(s，1H)，8.36(s，1H)，8.18(d，J＝7.8Hz，1H)，8.07(d，J＝8.0Hz，1H)， 8.02(m，1H)，7.80(m，3H)，7.50(m，2H)，7.22(m，1H)，3.91(s，3H)；13CNMR(100MHz, DMSO-d6)δ166.09,165.63,160.03,139.72,139.52,138.94,135.21,132.18,130.01,129.32,129.13,128.78,128.17,124.73,124.25,123.45,122.72,120.79,119.87,52.21；ESI-MS:m/z＝ 381[M+1+]。
实施例2 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯
合成步骤参考实施例一，以3-氨基苯甲酸、乙醇、噻吩-2-甲酸为原料合成5b。
化合物5b核磁数据1HNMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.81(s,1H),9.73(s,1H),8.51(s,1H),8.36 (s,1H),8.19(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(d,J＝8.0Hz,1H),7.99(d,J＝3.6Hz,1H),7.79(m,3H), 7.51(m,2H),7.28–7.12(m,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR (100MHz,Acetone-d6)δ166.58,166.37,160.98,141.08,140.62,140.24,136.73,132.48,132.01, 129.75,129.44,128.77,125.35,125.31,124.06,123.44,121.81,120.32,61.54,14.60；ESI-MS:m/z ＝395[M+1+]。
实施例3 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯
合成步骤参考实施例一，以3-氨基苯甲酸、异丙醇、噻吩-2-甲酸为原料合成5c。
化合物5c核磁数据1HNMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.80(s,1H),9.72(s,1H),8.48(s,1H),8.35(s, 1H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),8.06(d,J＝8.1Hz,1H),7.99(d,J＝3.4Hz,1H),7.81(d,J＝4.8Hz, 1H),7.77(d,J＝7.7Hz,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,2H),7.25(m,1H),5.35–5.07(m,1H),1.37(d,J ＝6.2Hz,6H)；13CNMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.35,166.08,160.96,141.08,140.58,140.25, 136.75,132.48,132.39,129.75,129.70,129.43,128.77,125.34,125.26,124.03,123.42,121.81, 120.31,68.99,22.10；ESI-MS:m/z＝409[M+1+]。
实施例4 3-(3-((5-氯噻吩)-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯
合成步骤参考实施例一，以3-氨基苯甲酸、甲醇、5-氯-噻吩-2-甲酸为原料合成5d。
化合物5d核磁数据1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.54(s,1H),10.52(s,1H),8.48(s,1H),8.28 (s,1H),8.10(dd,J1＝8.2,J2＝1.0Hz,1H),8.00(m,2H),7.77(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(d,J＝7.7 Hz,1H),7.54(m,2H),7.29(d,J＝4.1Hz,1H),3.89(s,3H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6) δ166.59,166.04,159.48,140.01,139.36,139.13,135.76,134.69,130.53,129.85,129.58,129.32, 128.84,125.25,124.76,123.98,123.46,121.34,120.43,52.67；ESI-MS:m/z＝415[M+1+]。
实施例5 3-(3-((5-氯噻吩)-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯
合成步骤参考实施例一，以3-氨基苯甲酸、乙醇、5-氯-噻吩-2-甲酸为原料合成5e。
化合物5e核磁数据1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),10.52(s,1H),8.45(t,J＝1.7Hz, 1H),8.28(t,J＝1.7Hz,1H),8.12(dd,J1＝8.2,J2＝1.1Hz,1H),8.05-7.94(m,2H),7.77(d,J＝7.8 Hz,1H),7.72(d,J＝7.8Hz,1H),7.54(m,2H),7.29(d,J＝4.1Hz,1H),4.35(q,J＝7.1Hz,2H), 1.35(t,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.09,166.03,159.47,139.98,139.36, 139.12,135.76,134.69,130.82,129.83,129.54,129.31,128.85,125.21,124.75,123.95,123.45, 121.33,120.43,61.28,14.66；ESI-MS:m/z＝429[M+1+]。
实施例6 3-(3-((5-氯噻吩)-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯
合成步骤参考实施例一，以3-氨基苯甲酸、异丙醇、5-氯-噻吩-2-甲酸为原料合成5f。
化合物5f核磁数据1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),10.53(s,1H),8.42(s,1H),8.29 (s,1H),8.12(m,1H),8.01(d,J＝4.2Hz,2H),7.77(d,J＝7.7Hz,1H),7.70(d,J＝7.7Hz,1H), 7.53(m,2H),7.29(d,J＝4.1Hz,1H),5.17(m,1H),1.35(d,J＝6.3Hz,6H)；13CNMR(100MHz, DMSO-d6)δ165.55,165.10,159.00,139.47,138.89,138.65,135.28,134.20,130.68,129.39, 129.00,128.82,128.37,124.70,124.26,123.47,122.97,120.86,119.96,68.20,21.68；ESI-MS:m/z ＝443[M+1+]。
实施例7 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸(CZL-80)
步骤A、步骤B、步骤C同实施例1，步骤D：将3.8克的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯(5a)溶解于10mL的甲醇中，加入0.4克的NaOH，室温反应8小时，加入2N的HCl调pH至3，随后浓缩该甲醇溶液；用30mL二氯甲烷溶解，水洗有机相并干燥有机相；浓缩溶剂得到目标化合物6a(CZL-80)，收率96％。
化合物CZL-80核磁数据(核磁谱图见图2)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.01(s,1H), 10.49(s,1H),10.46(s,1H),8.43(s,1H),8.27(s,1H),8.09(d,J＝4.0Hz,1H),8.06-8.01(m,2H), 7.89(d,J＝4.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(m,2H),7.25(m, 1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.09,162.11,160.43,150.50,147.88,140.33,138.84, 138.34,133.15,131.59,130.44,129.32,128.38,124.81,123.59,120.37,117.72,117.55；ESI-MS: m/z＝367[M+1+]。
实施例8 3-(3-((5-氯噻吩)-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸
合成步骤参考实施例七，以3-氨基苯甲酸、异丙醇、5-氯-噻吩-2-甲酸为原料合成6b。
化合物6b核磁数据1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.98(b,1H),10.55(s,1H),10.49(s,1H), 8.45(s,1H),8.27(s,1H),8.07(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(t,J＝5.6Hz,2H),7.77(d,J＝7.6Hz,1H), 7.71(d,J＝7.6Hz,1H),7.53(m,2H),7.29(d,J＝4.0Hz,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ 167.70,166.03,159.50,139.87,139.38,139.14,135.86,134.71,131.74,129.87,129.39,129.34, 128.87,125.01,124.94,123.96,123.48,121.64,120.45；ESI-MS:m/z＝401[M+1+]。
实施例9 CZL80等优选化合物对实验性癫痫模型的作用
1.CZL80等优选化合物对体外癫痫相关酶活性的作用：首先将八个优选化合物溶于DMSO制成5mg/ml的母液，再用水稀释到终浓度50μM，用检测试剂盒进行癫痫相关酶活性的测定。将9μL 2x Reaction和1μL酶的底物混合后加入384孔板中，之后再加入9μL抑制剂溶液和1μL重组酶，37摄氏度孵育1小时后利用酶标仪检测荧光强度。阴性对照组荧光强度设为100％。结果显示八个优选化合物均能明显降低癫痫相关酶活性(图3)。
2.优选化合物CZL80对最大电休克癫痫发作模型的作用：采用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重25-30g。将小鼠按照体重随机分组：溶剂组(9例)、3mg/kg(9例)、10mg/kg(8例)和30mg/kg(8例)组。实验时分别腹腔注射溶剂或药物，给药30分钟后，将最大电休克仪的刺激夹以生理盐水浸湿后，分别夹住小鼠两耳耳廓，给以电刺激，刺激频率为50Hz,刺激持续时间为0.2s，刺激电流强度从6mA开始，之后间隔1分钟增加1mA，直至所给电流能使小鼠产生强直阵挛癫痫发作：先肢体强直性弯曲，随即后肢强直性伸展，最后出现阵挛性癫痫发作。此时所用的电流强度即为其发作阈值，并记录强直阵挛发作持续的时间，统计死亡率。结果显示CZL80可以显著抬高强直阵挛性发作的阈值(图4)；缩短发作持续时间(图 5)以及降低死亡率(图6)。
3.优选化合物CZL80对戊四唑急性癫痫发作模型的作用：采用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重25-30g。将小鼠按照体重随机分组：溶剂组、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg组。以上每组均为9例。实验时分别腹腔注射溶剂或药物，30分钟后腹腔注射80mg/kg PTZ，之后立即开始观察并记录小鼠的癫痫发作情况，观察时间为30分钟。癫痫行为学等级评价分级标准为：0级：无明显反应；1级：失神呆滞，耳朵和面部抽动；2级：全身抽动，无前肢抬起；3级：一侧或双侧前肢抬起；4级：一侧身体侧倒伴抽搐；5级：背部着地倒地，或全身强直阵挛发作；6级：强直后死亡。记录各小鼠癫痫发作的等级，及从给药开始到5级发作的时长并统计死亡率。发现CZL80可以显著降低小鼠的最大癫痫发作等级(图7)；延长到达大发作所需的潜时(图8)；并且降低死亡率(图9)。
4.优选化合物CZL80对海人藻酸慢性癫痫模型的作用：采用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重25-30g，腹腔注射400mg/kg水合氯醛麻醉后，将其固定于立体定位仪上，随后用1μL的微量注射器将0.6μL的海人藻酸溶液(0.5μg/μL)注射到右侧海马(AP:-2.0mm；ML:-1.3mm； V:-1.6mm)。术后小鼠头皮缝合并分笼饲养。KA注射两个月后，存活的小鼠按上述步骤麻醉并固定后，将双股电极植入小鼠右侧海马(AP:-2.9mm；ML:-3.0mm；V:-3.2mm)用于记录海马脑电，所用电极均为双股螺旋不锈钢电极，电极顶端分叉0.5mm，末端剥去包被绝缘层剥离0.5mm。电极为Teflon绝缘，直径为0.12mm。术后小鼠休息7天，然后利用Powerlab***记录其自由活动时的脑电图，每天记录8h(9:00-17:00)。只有监测到癫痫自发样放电的小鼠方可进行后续实验。具备癫痫自发能力的小鼠连续记录5天脑电作为基线(Pre)，随后5天的同一时间点(9:00-10:00a.m.)每天一次腹腔注射30mg/kg CZL80，同时记录相应脑电，最后5天撤去药物记录撤药后脑电(Post)。该慢性癫痫模型是经典的模拟临床癫痫患者癫痫自发的动物模型。共记录10例具备慢性自发能力的小鼠，发现CZL80可以显著减少小鼠的癫痫自发次数(图10)。
5.优选化合物CZL80对耐苯妥英钠难治性颞叶癫痫模型的作用：采用成年雄性Wistar 大鼠，体重220-250g。成年Wistar大鼠先进行立体定位电极植入手术，方法为：腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后将头部固定于立体定位仪。所有实验大鼠在右侧杏仁核 (AP:-2.4mm,ML:-4.8mm,DV:-8.8mm)，立体定位垂直植入双股刺激电极，术后动物休息 7天。然后在杏仁核进行癫痫电点燃。所需电刺激通过恒流电刺激仪给予，并且用Neuroscan 脑电记录***记录脑电。随后测定大鼠的后放电阈值。测定阈值的刺激参数与后续刺激的参数均为：单向方波，60Hz，1ms波宽，刺激总时长为1s。测定阈值的刺激强度从10μA开始，间隔1min逐次增加20％，直到某个强度的电流刺激可以在杏仁核诱发至少5s的后放电棘波。该电流强度即定为阈值，点燃过程的刺激强度均为此阈值。第二天开始每天一次，一周7天的杏仁核电点燃刺激，同时记录杏仁核的癫痫发作脑电。计算后放电时长。电点燃癫痫发作行为学根据Racine标准进行分级：1)面部抽搐并伴有咀嚼；2)点头；3)单侧前肢阵挛发作；4)双侧前肢阵挛和站立；5)双侧前肢阵挛，站立以及倒地。当大鼠出现连续3次的5 级发作被认为是完全点燃。完全点燃的大鼠对阈值进行重新测定。测定方法同初始阈值，测定后间隔2天，再重复测定，直至连续两次测定的阈值相同，即为稳定的阈值。之后用苯妥英钠进行筛选。筛选方法为：先腹腔注射相同体积的溶剂，1h后测定阈值，刺激电流条件同前，起始电流强度为稳定阈值的58％，每隔1分钟，增加起始电流强度的20％，直至某个电流强度能诱发超过5s的后放电，这时的电流强度即为对照阈值。1天后腹腔注射苯妥英钠(75mg/kg)，1h后测定阈值，电流条件同前，起始电流强度为58％的对照阈值，每隔1分钟，增加起始电流强度的20％，直至某个电流强度能诱发超过5s的后放电，这时的刺激电流即为给药后阈值。隔4-6天后再重复此过程，共进行三轮苯妥英钠筛选。三轮筛选结束后，根据给药后阈值与对照阈值比值的不同，分为以下三组。苯妥英钠有效组：三次筛选中给药后阈值均大于等于145％对照阈值；苯妥英钠无效组：三次筛选中给药后阈值均小于等于120％对照阈值；其余为苯妥英钠效果变异组。其中苯妥英钠无效组被认为该动物罹患了难治性颞叶癫痫。该模型是经典的国际公认的模拟临床多药耐药难治性癫痫患者的动物模型。随后分别在苯妥英钠无效组大鼠腹腔注射3mg/kg和10mg/kg的CZL80，每组动物为8例，30分钟后，分别测定各个大鼠的给药后阈值并计算与对照阈值的比值，方法同上。相比于溶剂组和苯妥英钠组，CZL80可以显著抬高难治性癫痫大鼠的阈值变化率(图11)，还可以显著抬高治疗有效率(图12)。
6.优选化合物CZL80对慢性海人藻酸癫痫小鼠海马脑片锥体神经元动作电位阈值的作用：具备海人藻酸诱导的癫痫自发能力的小鼠用***麻醉后，活体迅速取脑，并分离左右半脑，之后冰冻振动切片，获得海马脑片(400μm)，放入人工脑脊液中孵育1小时。人工脑脊液含119mM NaCl,1mM KCl,2.5mM CaCl2,1.3mM MgSO4,1mM NaH2PO4,26.2mM NaHCO3,11mM D-glucose。记录时将脑片置于界面式实验槽，控制槽内温度25～30℃，通以经水浴加温湿润的95％O2/5％CO2混合空气(1～2mL/min)。灌流人工脑脊液，灌流速度一般控制在1～3ml/min。在电流钳模式下用玻璃微电极(灌充钾内液，阻抗为2-6兆欧)对海马CA1区锥体神经元的动作电位发放阈值进行记录，方法为注入电流从5pA开始每隔1s递增5pA，直到诱发出动作电位，则该电流强度为动作电位诱发阈值。考察CZL80(100μM) 对该阈值的作用。共记录到9例细胞。发现CZL80可以显著抬高海马锥体神经元动作电位发放的阈值(图13)。
实施例10 CZL80毒副作用的测定
1.优选化合物CZL80对成年小鼠清醒状态下海马脑电(Electroencephalogram,EEG)节律的影响：成年C57BL/6J小鼠(体重25-30g)经戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后，将头部固定于立体定位仪，于右侧海马CA3(AP:-2.9mm,L:-3.0mm,V:-3.0mm)垂直植入双股电极。所有电极均为双股螺旋不锈钢电极，电极顶端分叉0.5mm，末端剥去包被绝缘层剥离0.5mm。电极为Teflon绝缘，直径为0.12mm，电极另一端与微型插座焊接，用牙科水泥固定于颅骨上。实验时先使记录动物提前30分钟适应记录环境，然后在清醒状态下利用Neuronscan***记录30分钟的基础状态EEG，之后腹腔给以30mg/kg CZL80，并立即记录给药后EEG 1h。记录采样率为2k/s，滤波范围为0.3-500Hz。分析EEG采用Neuroscan***自带软件包傅里叶变换对记录的EEG进行分析，计算各频段的能量。并比较给药前和给药30min后脑电各节律能量的变化，本实验共记录7例小鼠的脑电。给药后各频段脑电节律与给药前没有显著性差异(图14)。
2.优选化合物CZL80长期给药后对旷场运动能力的影响：成年的C57BL/6J小鼠每天腹腔注射溶剂和CZL80(30mg/kg)，持续三周。完成整个给药过程后第二天进行该试验，以评价其运动功能。首先将待测小鼠放入测试环境中提前适应至少1h。随后将待测小鼠面朝一固定方向轻轻放入旷场箱中间，旷场箱是一个长×宽×高：45cm×45cm×45cm的顶部开口的方形盒子，让小鼠在其中自由探索15min。同时利用Video Track 3.10软件自动追踪小鼠的运动轨迹，并分析其运动路程、静止不动的时间比例等参数。为保证实验的准确性，每次实验后都清理掉小鼠的***物，并用70％酒精消除上一只小鼠的气味。结果显示，CZL80旷场实验的运动距离和不动时间比例两个指标均没有明显改变，每组动物为6例(图15)。
3.优选化合物CZL80长期给药后对血常规指标的影响：上述三周连续给药并测定旷场实验后的小鼠，委托给浙江大学动物实验中心的药物安全评价平台测定血常规指标，包括：白细胞计数、嗜中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞平均体积、平均红细胞血红蛋白量、平均细胞血红蛋白浓度。CZL80长期给药对血常规影响见表1，每组动物为6例，长期给药后小鼠血常规各项指标均处于正常范围。
表1优选化合物CZL80慢性给药对小鼠血常规的影响
4.优选化合物CZL80长期给药后对肝肾组织切片的影响：上述三周连续给药后的小鼠，除摘眼球取血外，同时解剖取肝，肾等主要脏器，首先用肉眼检查肝，肾的色泽，外形、体积等，随后将其置于4％多聚甲醛溶液中固定48h，进行常规石蜡包埋，切片，HE染色，最后在光学显微镜做作组织病理学检查。主要评价长期使用CZL80后是否会见因药物长期毒性引起的病理改变。病理切片显示CZL80对小鼠肝肾没有明显的毒副作用(图16)。

Claims (6)

1.一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，结构通式(Ⅰ)如下：
其中：
R1任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，Cl，F,羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6烷氧基取代的烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C2-6烯基，C2-6羟基取代的烯基，C2-6炔基，C2-6羟基取代的炔基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
R2选自C5-6芳基或C5-6杂芳基，其中，所述各C5-6芳基或C5-6杂芳基，任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，F，Cl，Br，羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基，C1-6烷基，ORa，SRa和NRaRb的取代基所取代；
Ra和Rb独立选自H，D，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，其中所述各C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C5-6芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；当Ra和Rb与同一个氮原子连接时，Ra，Rb和与他们连接的氮原子一起还可以任选地形成取代或非取代的3-7个原子组成的杂环基；
R3任选地被1、2、3或4个独立自选H，D，Cl，F,羟基，氰基，酯基，酰胺基，硝基，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6烷氧基取代的烷基，C1-6杂烷基，C3-6环烷基，C3-6杂环烷基，C2-6烯基，C2-6羟基取代的烯基，C2-6炔基，C2-6羟基取代的炔基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，C5-6芳基，C5-6杂芳基，C5-6杂芳基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
R4选自H，D,C1-20烷基，C1-20卤代烷基，C1-20羟基取代的烷基，C1-20烷氧基取代的烷基，C1-20杂烷基，C3-8环烷基，C3-8杂环烷基，C3-8环烷基和C3-8杂环烷基还可以任选地被羟基，烷基，烷氧基，胺基，烷胺基，酰胺，磺酰胺，酯基，氟，氯，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
上述化合物包括其可药用的盐。
2.根据权利要求1所述的一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，所述化合物选自：
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸甲酯；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸乙酯；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸异丙酯；
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸；
3-(3-(5-氯噻吩-2-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯甲酸；
上述化合物包括其可药用的盐。
3.根据权利要求1或2所述的一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，所述可药用的盐为3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺衍生物盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐。
4.一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
3-氨基苯甲酸(1)与R2取代的酰氯反应得到化合物3-酰胺苯甲酸(2)，3-氨基苯甲酸(3)与R4OH在浓硫酸催化下得到化合物3-氨基苯甲酸酯(4)，3-酰胺苯甲酸(2)与3-氨基苯甲酸酯(4)在缩合剂存在的条件下反应得到目标化合物5，经过重结晶得到纯品；化合物5经NaOH水解得到目标化合物6；反应式如下：
其中取代基R1、R2、R3、R4、Ra、Rb的定义同权利要求1，其中R4不等于H。
5.根据权利要求4所述的一种3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选用二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并***。
6.根据权利要求1或2所述的3-酰胺基-N-芳基苯甲酰胺类化合物及其可药用的盐在制备抗癫痫药物中的应用。
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