CN108850704A - 用于南美白对虾的中草药饲料添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中草药饲料添加剂，尤其涉及一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂及其制备方法和应用，以重量百分比计，包括黄芩25‑35％、五味子25‑35％、苏木15‑25％、龙胆草5‑15％、决明子5‑15％。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明在综述了体外抑菌实验基础上，将体外具有抑菌能力的药物添加到饲料中进行进一步的验证，评价对虾体内弧菌数量及机体健康状况后得出的药物组合，实验证实该中草药饲料添加剂既能直接抑菌杀菌，又能较好地提高对虾的抗应激能力。

Description

用于南美白对虾的中草药饲料添加剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中草药饲料添加剂，尤其涉及一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂及其制备方法和应用。

背景技术

南美白对虾是当前世界养殖产量最高的甲壳类养殖品种，适盐度广，可在咸淡水和淡水地区养殖，加之生长迅速、出肉率高，在沿海和内陆地区得到迅速发展。

但是，近年来南美白对虾发病非常严重，而且时间长，损失惨重。特别是从2009年开始，放苗不久即开始发病，排塘率非常高。2013年初，研究人员基本确认了一种特殊的副溶血性弧菌为该病的主要病因，这种特别的副溶血性弧菌中含有的独特的质粒，可以编码出的类杀虫毒素的毒素蛋白，会引起虾类的肝胰腺坏死。因此，抑杀弧菌对于控制对虾的发病非常重要。

目前，迫切需要开发一种能够既能直接抑菌杀菌又能较好地提高对虾抗应激能力的中草药饲料添加剂。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂及其制备方法和应用。

已经知道，在中草药物中有很多抗菌活性成分，可以减少抗生素等化学药物的使用，因此，目前有很多学者进行了多种中药的体外抑菌实验，研究这些中药对弧菌的抑制能力，也得出了例如包括五倍子、大黄等几种在体外有较强杀菌能力的药物。

本发明通过以下方案达到上述目的：

本发明采用黄芩、五倍子、苏木、龙胆草、决明子，按照一定比例合理配伍，将该添加剂添加到南美白对虾饲料中，可以显著降低南美白对虾体内的弧菌含量，同时又能提高对虾对抗缺氧、抗高亚硝酸盐等应激的能力，全面改善对虾养殖的健康状况。

在第一方面，提供一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂，以重量百分比计，包括黄芩25-35％、五倍子25-35％、苏木15-25％、龙胆草5-15％、决明子5-15％。

优选的，一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂，以重量百分比计，包括：黄芩30％、五倍子30％、苏木20％、龙胆草10％、决明子10％。

在上述中草药饲料添加剂中，黄芩、五倍子、苏木具有体外抑制弧菌的功能，单独的这三种中草药的抑菌能力没有五倍子、大黄强，但是将这三种药物联合使用后，抑菌能力显著强于上述五倍子、大黄两种药物，龙胆草、决明子这两种药物具有清热燥湿的作用，实验证实在体内还具有保肝作用。将上述五种组分按照特定配伍后，发挥显著协同作用，对于抑菌杀菌和抗应激能力具有显著效果。

在第二方面，提供一种上述中草药饲料添加剂的制备方法，包括将原料组分混合均匀，超微粉碎过筛，优选过120目筛。

在第三方面，提供一种上述中草药饲料添加剂的应用，所述应用包括在南美白对虾饲料中添加1-1.5％的中草药饲料添加剂。

优选的，以重量百分比计，所述南美白对虾饲料包括：鱼粉16-18％，虾壳粉6-9％，乌贼粉4-7％，豆粕25-31％，花生麸14-18％，高筋面粉18-25％，鱼油0.4-0.6％，磷脂油2.7-3.3％，氯化胆碱0.22-0.27％，磷酸二氢钙1.3-1.7％，食盐0.1-0.3％，对虾用维生素预混料0.18-0.22％，对虾用矿物质预混料0.95-1.05％，抗氧化剂0.015-0.025％，褐藻酸钠0.25-0.35％，防霉剂0.05-0.15％。

优选的，所述鱼粉为进口鱼粉。

在第四方面，提供一种上述中草药添加剂的用途，所述用途包括抑菌和/或杀菌，和/或，提高对虾抗应激能力，和/或，提供对虾养殖成活率。

优选的，所述菌包括弧菌。

优选的，所述抑菌是指抑制南美白对虾体内弧菌。

优选的，所述杀菌是指杀灭南美白对虾体内弧菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明在综述了体外抑菌实验基础上，将体外具有抑菌能力的药物添加到饲料中进行进一步的验证，评价对虾体内弧菌数量及机体健康状况后得出的药物组合，实验证实该中草药饲料添加剂既能直接抑菌杀菌，又能较好地提高对虾的抗应激能力。

2、本发明所述药物可以替代抗生素使用，预防和控制对虾养殖过程中感染弧菌，减少或不用抗生素添加剂等药物，保证对虾食品的绿色、安全。

3、本发明的中草药添加剂能够与食物同源、同体、同用，且取材、加工与给药都比较方便的中草药，这也是保障对虾产业健康发展、对虾产品安全无抗生素残留的有效途径。

4、采用本发明的中草药添加剂，可以减少患病对虾的数量，控制病原菌在体内的增殖，切断病原在虾体间的传播，同时增强对虾的抗应激能力，控制对虾死亡，提高养殖成活率。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的具体描述，但本发明的实施方式不限于此，在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用方法。

实施例1

一种用于南美白对虾的中草药饲料添加剂，以重量百分比计，组分如下：黄芩30％、五倍子30％、苏木20％、龙胆草10％、决明子10％。

中草药饲料添加剂的制备方法，按比例称取上述组分后，混合均匀，超微粉碎过120目筛，即得到该中草药饲料添加剂。

在使用时，实施例1的中草药饲料添加剂在对虾饲料中的添加量为1％。

实施例2

一种用于南美白对虾的中草药饲料添加剂，以重量百分比计，组分如下：黄芩28％、五倍子26％、苏木24％、龙胆草12％、决明子10％。

中草药饲料添加剂的制备方法，按比例称取上述组分后，混合均匀，超微粉碎过120目筛，即得到该中草药饲料添加剂。

在使用时，实施例2的中草药饲料添加剂在对虾饲料中的添加量为1.3％。

试验例1五十四种中草药对副溶血弧菌的药物敏感性实验

申请人在前期查阅大量文献并走访南美白对虾的主要养殖市场，筛选到54种在理论上或实际中具有抑制副溶血弧菌功能的单味中草药物进行体外抑菌实验。具体如下：

1、实验材料及方法

(1)实验菌株

供试副溶血弧菌菌株为海大集团免疫与疾病实验室于2 016年从广州番禺鱼窝头某养殖场患病白虾塘，取10尾虾的肝脏、肠道，分别按重量体积比1:5加灭菌生理盐水，匀浆，匀浆液3500转离心15min，两次，吸取清晰液体层。将稀释好的上清液吸取200ul至平皿中涂布均匀，培养，获得副溶血弧菌。致病性实验结果证明低浓度浸泡感染组的死亡率达到35％。

(2)培养基、试剂、药品

固体培养基为TCBS培养基，即硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基，可以选择性培养弧菌。液体培养基为肉汤培养基。

中草药列表如表1所示：

以上所有中草药材均购自广州清平中药材市场。

(3)中药原液制备

称取100g原药粉碎过60目筛，放入大烧杯中，加入10倍体积的蒸馏水浸泡30min，在电炉上煎煮，水开后文火煮30min，如此重复3次，每次药液经双层纱布过滤，将3次所得药液集合，煎煮浓缩，最后定容至200ml(此时药液浓度为500mg/ml)，冷却后4℃冷藏保存备用。

(4)药敏纸片的制备

用打孔器将滤纸打孔，选用形状规则的纸片，装入青霉素小瓶，每瓶装50片，统一用铅笔编号，小瓶用牛皮纸包扎封口，121℃灭菌15min，之后放烘箱75℃下烘干，在无菌操作台中添加药液，药液在加之前充分摇匀，每瓶加0.5ml药液，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，瓶口上记录药物名称与相应的纸片编号，包扎好牛皮纸放4℃冰箱静置3小时，再在60℃烘箱内干燥，等完全干燥后放入4℃冰箱。

(5)受试菌液的制备

将分离、纯化的菌株活化，接种于10ml肉汤培养基中，在摇床内37℃培养24h，将培养好的肉汤培养基离心，弃去上清液，保留细菌，用生理盐水稀释至浓度为10⁸cfu/ml。

(6)药敏实验方法

用TCBS培养基做平板培养基，在无菌操作台内吸取200ul菌液在平板内，涂布均匀，之后将药敏纸片沿对角线贴在平板上，一块平板贴4-5个纸片。贴完之后将平板包好，放到生化培养箱内37℃培养24h，观察抑菌圈直径。

药敏性的判断标准：根据药敏纸片周围抑菌圈的大小测定其抗菌程度，判断标准是抑菌圈直径大于15mm为高敏，等于15mm为中敏，15mm以下为不敏感。

2、实验结果

(1)单味中草药的体外抑菌实验结果如表2所示。

表2单味中草药的体外抑菌实验(cm)

药物	抑菌圈直径cm	药物	抑菌圈直径cm
				瓜蒌	1.2	黄芩	1.6-1.7
苏木	2.1-2.2	地肤子	1.8-2
				乌梅	1.3-1.4	虎杖	1.2
金银花	1.8-2	火炭母	1.6-1.7
				黄连解毒散	1.2-1.3	佩兰	1.3
紫菀	1.3-1.5	番泻叶	1.3
				地榆	1.9	金樱子	1.5
厚朴	1.9-2	旋复花	1.4
				五倍子	1.7	知母	1.4-1.5
大黄	1.2-1.3	石榴皮	1.9-2
				形成	1.7-1.8	诃子	2.3
淡竹叶	1.4

由表2可知：有11种药物对副溶血弧菌高度敏感，3种药物中度敏感，虽然大多数中草药对副溶血弧菌不敏感，但也有9种药物出现了较小的抑菌圈，还有31种药物没有出现抑菌圈。结果显示：黄芩、苏木、地肤子、金银花、火炭母、地榆、厚朴、五倍子、石榴皮、黄连、诃子这11种药物抑菌圈直径明显，对副溶血弧菌高度敏感。

试验例2药物对抑制南美白对虾肝脏内弧菌的作用

将试验例1中的11种药物添加到南美白对虾饲料中，验证其对南美白对虾肝脏内弧菌含量的影响，并与本发明的复合药物抑菌效果做对比。

1、实验材料与方法

(1)实验药物及饲料制备

本实验选用的药物分别为黄芩、苏木、地肤子、金银花、火炭母、地榆、厚朴、五倍子、石榴皮、黄连、诃子，本发明的中药复合物为实施例1的中草药饲料添加剂，每种组合药物分别以0.8％含量添加到基础饲料中，按照逐级混匀法将原料混合均匀，经小型饲料机挤压加工制成直径1.6mm，长度2.7-3.2mm的颗粒饲料，60℃烘干备用，饲料基础配方见下表3：

表3实验基础料配方表

(2)实验动物与饲养管理

实验对虾为广东海大集团海兴农的虾苗,平均体重为2.39±0.01g，选择体质健壮、规格整齐的900尾试验虾，随机分组进行养殖试验。试验共设7组，每组3个重复，每个重复30尾虾。养殖***为室内反复循环流水式玻璃水族箱养殖***，水族箱养殖水体为0.9m×0.5m×0.4m，箱内放置生物过滤装置和气石，并放置足够数量的网片作为试验虾的隐蔽物和栖息地。试验用水为曝气去氯后的自来水，日换水量约为总水体的1/3，连续充气。每天投饲2次，在08:00、16:00各饱食投饲1次。试验期间，养殖水体温度24.2～29.8℃，pH7.4-8.2，溶氧5.3-7.5mg/L，氨氮0.2-0.31mg/L，锌含量12-18ug/L。试验期20天。

(3)取样分析

实验结束后，每个箱中的虾全部取肝脏，称重，并与等重量的生理盐水混合，匀浆，梯度稀释至10倍，100倍，1000倍，吸取不同的稀释液100ul于TCBS培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18h，计数绿色的弧菌数量。

2、实验结果

实验结果见表4。

表4：各组的体内实验肝脏绿色弧菌数量

从表4中可以看出，石榴皮、黄连、地肤子、金银花、火炭母、地榆、五倍子、诃子的单独添加对抑制肝脏绿色弧菌数量无显著影响，黄芩、苏木、厚朴的单独添加可以较对照组显著降低肝脏绿色弧菌数量，本发明组对肝脏绿色弧菌的抑制作用最强，比对照组低两个数量级，抑菌效果非常显著，比黄芩、五倍子、苏木单独使用时的效果显著增强。

通过以上结果可以发现：体外药敏实验有效药物在体内不一定有很强的抑菌效果，从体外实验到体内实验并不具有直接的指导作用，本发明的实施例1的中草药饲料添加剂具有显著的协同作用效果，本发明的其它中草药饲料添加剂具有相似的技术效果。

试验例3本发明中草药饲料添加剂的使用效果实验

为了验证本发明中草药饲料添加剂在市场上的使用效果，在湛江遂溪地区选点进行中试，白虾来自遂溪徐荣平及隔壁葛老板塘口，相同苗种，同一天放苗，徐老板投喂含有实施例1的饲料，葛老板投喂不含实施例1的普通料，两处的基础饲料配方相同，见表5，水源条件、药品使用、虾子规格、投喂量、水色均相似，包括虾子外观，两个棚子分别采集200只虾回实验室对比。

表5基础饲料配方

对比内容：

(1)白虾规格(全部称重，计算头数)；

(2)对虾血液弧菌数量

(3)体重、体长，计算肥满度；

(4)血淋巴凝固时间：白虾活力指标，时间越短，代表白虾活力越好，越健康；

(5)离水30min成活率：湿毛巾分别包裹40只虾，30min后查看白虾成活率。

(6)高亚盐胁迫实验：每个箱子放100，使用亚硝酸钠试剂配置，自来水，充分曝气，亚盐浓度为20ppm极端水平，每隔一段时间检查一次，统计对虾死亡数量，统计对虾成活率。

上述结果如表6和表7所示。

表6：

表7：

从表6和表7的数据来看，同批苗种，一起放苗，相同投喂量的棚子虾子规格差异为30头，即投喂处理组饲料的棚子虾子规格较大，且肥满度略好。处理组血液弧菌数量比对照组显著降低2个数量级。从活力指标来看，投喂处理组饲料的虾子活力明显好于普通料的虾，具体表现在：血凝巴凝血时间短5秒，抗离水成活率高17％，高亚盐耐受成活率高14％。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂，其特征在于，以重量百分比计，包括黄芩25-35％、五味子25-35％、苏木15-25％、龙胆草5-15％、决明子5-15％。

2.根据权利要求1所述的一种南美白对虾用的中草药饲料添加剂，其特征在于，以重量百分比计，包括：黄芩30％、五味子30％、苏木20％、龙胆草10％、决明子10％。

3.一种权利要求1或2所述的中草药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括将原料组分混合均匀，超微粉碎过筛，优选过120目筛。

4.一种权利要求1或2所述的中草药饲料添加剂的应用，其特征在于，所述应用包括在南美白对虾饲料中添加1-1.5％的中草药饲料添加剂。

5.一种权利要求1或2所述的中草药添加剂的用途，其特征在于，所述用途包括抑菌和/或杀菌，和/或，提高对虾抗应激能力，和/或，提供对虾养殖成活率。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述菌包括弧菌。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抑菌是指抑制南美白对虾体内弧菌。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述杀菌是指杀灭南美白对虾体内弧菌。