CN108845142A - Emc10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了EMC10蛋白的新用途，即EMC10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用。本发明首先保护用于检测EMC10蛋白的物质在制备产品中的应用；产品的功能：诊断或辅助诊断肥胖患者；评估肥胖患者的肥胖严重程度；评价肥胖患者的治疗效果。本发明还保护EMC10蛋白作为标志物的应用；标志物为：诊断或辅助诊断肥胖患者的标志物；评估肥胖患者的肥胖严重程度的标志物；评价肥胖患者的治疗效果的标志物。进一步的，EMC10蛋白可以作为干预和/或治疗肥胖的靶标，抑制EMC10基因表达、抑制EMC10蛋白活性或降低EMC10蛋白含量可实现干预和/或治疗肥胖。

Description

EMC10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治 疗效果评价产品中的应用

技术领域

本发明涉及EMC10蛋白的新用途，具体涉及EMC10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用，进一步来说涉及EMC10蛋白作为肥胖症血清标志物的应用，以及EMC10蛋白作为靶标在干预和治疗肥胖中的应用。

背景技术

受饮食结构、生活方式以及环境等因素的影响，肥胖(Obesity)的发病率逐年增加。肥胖能够大大增加2型糖尿病、心血管疾病以及肿瘤的发病率和致死率，给人类健康和经济发展带来沉重的负担。寻找肥胖发病新的病因以及阐明其中的病理机制，对于开发新的干预和治疗肥胖的药物，遏制和减少肥胖对于人类的危害显得尤为迫切，并具有极其重要的意义。

脂肪是机体能量来源的主要物质之一，脂代谢紊乱是代谢性疾病的严重后果，也是其发病的重要因素。生物体内存在很多激素或分泌性蛋白调节脂代谢，譬如经典的胰岛素、甲状腺激素、肾上腺糖皮质激素以及生长激素等，它们在调节糖脂代谢以及能量稳态中发挥重要作用。近年来，某些非经典的内分泌组织器官也被发现能够分泌一些激素或细胞因子，包括：脂肪分泌的脂肪因子(Adipokines)，譬如瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)、抵抗素(Resistin)、TNFα、IL-6、PAI-1、MCP-1等；肝脏分泌的肝脏因子(Hepatokines)，譬如胎球蛋白A(Fetuin-A)、FGF-21、性激素结合蛋白(SHBG)等；肌肉分泌的肌肉因子(Myokines)，譬如肌生长抑素(Myostatin)、鸢尾素(Irisin)、IL-6、IL-15等；以及心脏分泌的心脏因子(Cardiokines)，譬如心房利钠肽(ANP)；它们在调控糖脂代谢、能量平衡以及肥胖的发病过程中也发挥重要的作用。由于这些激素或因子都可以在血清或血浆中检测得到，因此它们都有望成为肥胖和糖尿病诊断的分子标志物以及治疗的潜在靶点。实践证明，在上述的诸多激素或细胞因子中已经有一些因子可以作为评价肥胖或代谢紊乱有用的分子标志物，譬如瘦素和脂联素，但是真正能用于治疗肥胖或代谢性疾病分子靶点的却很少，因此有必要继续寻找能够用于肥胖或代谢性疾病治疗靶点的新型细胞因子或分泌蛋白。

EMC10蛋白，全称为内质网膜蛋白复合体亚单位10(ER membrane proteincomplex subunit 10)。EMC10蛋白最初从人胰岛素瘤组织的cDNA文库中克隆得到，当时命名为INM02，已将INM02(EMC10)基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列投递到GenBank数据库(登录号为AY194293，linear PRI 19-MAY-2010，VERSION AY194293.2)。EMC10蛋白与任何已知的蛋白或蛋白域均没有明显的同源性，所以EMC10蛋白被认为是一个新的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供EMC10蛋白的新用途，具体来说涉及EMC10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用，进一步来说涉及EMC10蛋白作为肥胖症血清标志物的应用，以及EMC10蛋白作为靶标在干预和治疗肥胖中的应用。

本发明首先保护用于检测EMC10蛋白的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)诊断或辅助诊断肥胖患者；

(b)评估肥胖患者的肥胖严重程度；

(c)评价肥胖患者的治疗效果。

所述产品为试剂盒。

所述用于检测EMC10蛋白的物质为用于检测血清中EMC10蛋白的物质。

本发明还保护一种产品，包括用于检测EMC10蛋白的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)诊断或辅助诊断肥胖患者；

(b)评估肥胖患者的肥胖严重程度；

(c)评价肥胖患者的治疗效果。

所述产品为试剂盒。

所述用于检测EMC10蛋白的物质为用于检测血清中EMC10蛋白的物质。

本发明还保护EMC10蛋白作为肥胖症标志物的应用。

本发明还保护EMC10蛋白作为肥胖症血清标志物的应用。

本发明还保护EMC10蛋白作为标志物的应用；所述标志物为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)诊断或辅助诊断肥胖患者的标志物；

(Ⅱ)评估肥胖患者的肥胖严重程度的标志物；

(Ⅲ)评价肥胖患者的治疗效果的标志物。

本发明还保护EMC10蛋白作为血清标志物的应用；所述血清标志物为如下(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)：

(ⅰ)诊断或辅助诊断肥胖患者的血清标志物；

(ⅱ)评估肥胖患者的肥胖严重程度的血清标志物；

(ⅲ)评价肥胖患者的治疗效果的血清标志物。

本发明还保护一种评估肥胖患者的肥胖严重程度的方法，包括如下步骤：检测待测患者血清中EMC10蛋白的浓度；血清EMC10蛋白浓度高的患者肥胖程度高于血清EMC10蛋白浓度低的患者。

本发明还保护EMC10蛋白作为靶标在干预和/或治疗肥胖中的应用。所述EMC10蛋白为血清中的EMC10蛋白。

本发明还保护用于抑制EMC10基因表达的物质或用于抑制EMC10蛋白活性的物质或用于降低EMC10蛋白含量的物质在干预和/或治疗肥胖中的应用。所述抑制EMC10基因表达为抑制血清中EMC10基因表达。所述抑制EMC10蛋白活性为抑制血清中EMC10蛋白活性。所述降低EMC10蛋白含量为降低血清中EMC10蛋白含量。

以上任一所述EMC10蛋白为人源EMC10蛋白。

人源EMC10蛋白具体如序列表的序列1所示。

以上任一所述EMC10基因为人源EMC10基因。

人源EMC10基因的开放阅读框具体如序列表的序列2第1027-1791位核苷酸所示。

以上任一所述用于检测EMC10蛋白的物质为用于检测EMC10蛋白的化学发光免疫分析试剂组。

以上任一所述用于检测血清中EMC10蛋白的物质为用于检测血清中EMC10蛋白的化学发光免疫分析试剂组。

以上任一所述化学发光免疫分析试剂组包括捕获抗体和检测抗体。所述捕获抗体为抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体6B9。所述检测抗体为抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体1F12。所述检测抗体为经标记物标记的抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体1F12。其中，所述标记物可为辣根过氧化物酶。

以上任一所述化学发光免疫分析试剂组中还含有内质网膜蛋白复合体亚单位10的标准品。

以上任一所述化学发光免疫分析试剂组中还含有EMC10校准品、EMC10酶结合物、EMC10包被抗体板、发光底物液A、发光底物液B和浓缩洗涤液。所述EMC10校准品为内质网膜蛋白复合体亚单位10的标准品。所述EMC10酶结合物为经辣根过氧化酶标记的所述单克隆抗体1F12。所述EMC10包被抗体板为包被有所述单克隆抗体6B9的微孔板。所述发光底物液A为含有0.68mL/L过氧化氢的0.05MTris-HCl缓冲液。所述发光底物液B为含有0.709g/L鲁米诺(Luminol)和0.264g/L对碘酚(p-iodophenol)的0.05MTris-HCl缓冲液。所述浓缩洗涤液为含有体积分数为0.5％的吐温-20的0.02M磷酸盐缓冲液。

所述单克隆抗体1F12由小鼠杂交瘤细胞株1F12分泌产生，所述小鼠杂交瘤细胞株1F12在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.15788。

所述单克隆抗体6B9由小鼠杂交瘤细胞株6B9分泌产生，所述小鼠杂交瘤细胞株6B9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.15789。

本发明的研究结果表明，EMC10蛋白是一个促进肥胖发生的新型分泌因子。EMC10蛋白可作为肥胖症新型的血清标志物，通过检测血清EMC10蛋白水平可以实现对肥胖进行诊断，评估严重程度以及判断治疗的效果。进一步的，EMC10蛋白可以作为干预和/或治疗肥胖的靶标，抑制EMC10基因表达、抑制EMC10蛋白活性或降低EMC10蛋白含量可实现干预和/或治疗肥胖。

保藏说明

参据的生物材料(株)：1F12

科学描述：小鼠杂交瘤细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年5月24日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15788

参据的生物材料(株)：6B9

科学描述：小鼠杂交瘤细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年5月24日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15789

附图说明

图1为采用Dot blot的方法鉴定纯化后EMC10蛋白。采用的抗EMC10的抗体为兔抗人EMC10多克隆抗体。样本说明：初始上样量30ng，依次2倍稀释。1-9的上样量依次为30ng、15ng、7.5ng、3.75ng、1.875ng、0.9375ng、0.46875ng、0.234375ng和0.1171875ng。

图2为采用Western blot的方法鉴定纯化后EMC10蛋白。采用的抗EMC10的抗体为兔抗人EMC10多克隆抗体。

图3为采用Dot blot的方法鉴定纯化后EMC10蛋白。采用的抗EMC10的抗体为另一株兔抗人EMC10多克隆抗体。样本说明：初始上样量30ng，依次2倍稀释。1-9的上样量依次为30ng、15ng、7.5ng、3.75ng、1.875ng、0.9375ng、0.46875ng、0.234375ng和0.1171875ng。

图4为采用Western blot的方法鉴定纯化后EMC10蛋白。采用的抗EMC10的抗体为另一株兔抗人EMC10多克隆抗体。

图5为实施例4的试验一的结果。

图6为实施例4的试验二的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。真核表达载体pRAG2a：上海锐劲生物技术有限公司。HEK 293F细胞：Thermo Fisher,Cat No.R79007。人源EMC10蛋白如序列表的序列1所示(第1-27位氨基酸残基组成信号肽)，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例1、EMC10单抗的制备

一、构建EMC10真核表达重组质粒

构建重组质粒pRAG2a-EMC10：用序列表的序列2第82-762位所示DNA片段替换真核表达载体pRAG2a的酶切位点NheⅠ与XhoⅠ之间的小片段，得到重组质粒pRAG2a-EMC10。

二、转染与表达

(1)培养>1×10⁸HEK 293F细胞备用。

(2)用稀释液(Opti-MEM)将100μg重组质粒pRAG2a-EMC10稀释到1ml，轻轻的混匀。

(3用稀释液(Opti-MEM)稀释200μl Lipofectamine^TM2000脂质体终体积至1ml。轻轻混匀，室温放置5min。

(4)将稀释后的质粒加入到稀释好的Lipofectamine^TM2000脂质体中，使其混合物终体积为2ml，轻轻混匀。

(5)室温孵育30min。

(6)转移1×10⁸HEK 293F细胞到500ml摇瓶中，加入新鲜、预热的ExpressionMedium使其终体积至98ml。

(7)加入2ml孵育后的DNA-Lipofectamine^TM2000混合物。

(8)8％CO₂浓度的培养箱内，37℃、125rpm培养4-5天。

(9)4℃，收集上清。上清中含有切除了信号肽的EMC10成熟蛋白(如序列表的序列1的第28-254位所示)。

三、纯化蛋白及SDS-PAGE鉴定

(1)取步骤二的(9)得到的上清，加入binding buffer(8M尿素，20mM磷酸钠，500mMNaCl，pH 7.8)，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

(2)平衡：5个柱体积的binding buffer平衡镍柱。

(3)上样：步骤(1)得到的滤液上样。

(4)洗杂：5个柱体积binding buffer洗杂，直至流穿无物质流出。

(5)洗脱：5个柱体积elution buffer(8M尿素，20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH 4.0)洗脱，收集洗脱产物。

(6)SDS-PAGE检测。

仅显示一条36KD左右的条带，表明得到了电泳纯的目的蛋白。

四、Dot blot与Western blot鉴定

1、采用Dot blot的方法鉴定步骤三得到的纯化蛋白。采用的抗EMC10的抗体为兔抗人EMC10多克隆抗体(用序列表的序列1所示EMC10蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体)；二抗为山羊抗兔的HRP抗体(Thermo Fisher,Catalog#65-6120)。

结果如图1所示。由图可见，2000倍稀释，样本蛋白稀释到约0.47ng有阳性结果；约0.23ng无阳性结果。

2、采用Western blot的方法鉴定步骤三得到的纯化蛋白。采用的抗EMC10的抗体为兔抗人EMC10多克隆抗体(用序列表的序列1所示EMC10蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体)；二抗为山羊抗兔的HRP抗体(Thermo Fisher,Catalog#65-6120)。

结果如图2所示。由图可见，10ng样本上样，在36KD左右有阳性条带。

3、将步骤1和2中的抗EMC10的抗体替换为兔抗人EMC10多克隆抗体(用序列表的序列1所示EMC10蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体)后，再分别进行Dotblot和Western blot鉴定。

Dot blot鉴定结果如图3所示。由图可见，2000稀释，样本蛋白稀释到约7.5ng有阳性结果；约1.875ng无阳性结果。

Western blot鉴定结果如图4所示。由图可见，10ng样本上样，36KD左右有阳性条带。

Dot blot与Western blot鉴定的结果表明表明EMC10蛋白真核表达成功。

五、动物免疫

选取6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将步骤三得到的纯化蛋白与弗氏完全佐剂体积比1:1混合首次免疫，皮下注射100μg，每2-3周加强免疫一次，采用混合剂皮下注射100μg。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对EMC10蛋白的效价(效价用样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1的血清的最大稀释倍数表示)，待效价大于1：10000，选择1-2只小鼠进行细胞融合安排。

上述间接ELISA法测定血清效价的步骤具体如下：

(1)包板：吸取自行制备的标准品EMC10(在实施例1的步骤三中表达纯化)的溶解在0.1M PBS缓冲液中，制成浓度为1μg/ml的包被溶液。100μl/孔，4℃包被过夜。

(2)洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板2次，每次浸泡1-2分钟，大约200μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

(3)封闭：封闭液250μl/孔，37℃，2h。

(4)洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤(2)。

(5)检测：吸取待测血清溶解在抗体稀释液(0.1M PBS)中，制成稀释倍数为1000、3000、9000、27000倍的工作液，每孔加不同浓度的工作液100μL，注意不要有气泡，加样时加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2h。

(6)洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤(2)。

(7)每孔加入兔抗鼠-HRP 100μL，加上覆膜，37℃温育1小时。

(8)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤(2)。

(9)显色：底物显色A、B液1：1(体积比)混合后，每孔加100μL，酶标板加上覆膜，37℃避光孵育15分钟。

(10)每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

(11)立即用酶标仪在450/630nm双波长测量各孔的光密度(OD值)，并读数。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

(12)结果判断：样品孔OD值/阴性孔(即空白对照孔)OD值≥2.1时为阳性。结果显示血清抗EMC10抗体稀释倍数大于10,000的样品孔为阳性，说明抗体效价大于1：10000。

六、细胞融合

(1)骨髓瘤细胞制备：融合前一周，用含10％FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50ml离心管中，1000rpm，5min离心。弃上清，然后再加入20ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。

(2)脾细胞制备：四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射步骤三纯化后的EMC10蛋白与弗氏完全佐剂体积比1:1混合剂100μg。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min。无菌取脾脏，把脾脏放入内有10ml DMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000rpm离心5min，收集脾细胞计数。

(3)细胞融合：混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50％PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG。把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000rpm 5min离心，弃上清然后加入HAT DMEM培养基。把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养。

融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。

七、融合筛选及亚克隆

(1)融合筛选：在检测的前一天，用PBS包被5μg/ml抗原(步骤三纯化后的EMC10蛋白)于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100μl/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果，判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔(空白对照孔)OD值≥2.1，则判定为阳性孔)。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

(2)亚克隆：吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入4ml DMEM培养基，取100μl细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100μl(约2滴)在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

最终获得8个能够稳定分泌抗EMC10蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别编号为8C11、6B9、1F12、4B12-1、1H11、4C2、4B12-2和8A3。

八、腹水制备及纯化

(1)腹水制备：每只小鼠腹腔内注射0.5ml液体石蜡，7天后30天以内向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞。按每只小鼠注射1×10⁶个细胞的量，注射杂交瘤细胞。7至10天，用注射器针头小心从腹腔采出尽可能多的液体，并间接ELISA法进行效价测定(效价用样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1的血清的最大稀释倍数表示，阴性孔为空白对照)。小鼠在最后一次采集后颈椎脱位法处死。

(2)纯化：将所收集的腹水离心取上清，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水用PBS稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用磷酸盐缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定(效价用样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1的血清的最大稀释倍数表示，阴性孔为空白对照)。

A.定株后细胞株所得腹水ELISA效价如下：

包被抗原：EMC10(步骤三纯化后的EMC10蛋白)

包被浓度：1μg/ml；100μl/孔；

一抗：制得的八种抗EMC10单克隆抗体；

二抗：兔抗鼠-HRP(Santa Cruz,Cat No.sc-358917)。

表1定株后细胞株所得腹水ELISA法测效价结果(OD值)

注：表1中倒数第一行的最后两个数值是空白对照(即阴性孔)。

根据表1可知：阴性孔OD值约为0.01，稀释倍数为2187000时，各样品孔OD值分别为0.126、3.393、0.303、3.405、0.233、2.397。P/N均大于2.1，因此各细胞株所得腹水ELISA效价均大于1:2187000。

B.定株后细胞株所得腹水经纯化后ELISA效价如下：

包被抗原：EMC10(步骤三纯化后的EMC10蛋白)

包被浓度：1μg/ml；100μl/孔；

一抗：制得的八种抗EMC10单克隆抗体；

二抗：兔抗鼠-HRP(Santa Cruz,Cat No.sc-358917)。

表2定株后细胞株所得腹水经纯化后ELISA法测效价结果(OD值)

注：表2中倒数第一行的最后两个数值是空白对照(即阴性孔)。

根据表2可知：阴性孔OD值约为0.14，根据P/N大于2.1为阳性这一判断标准，当OD值大于0.294时为阳性(见表2中黑体加粗数值)。

其中，编号为1F12的小鼠杂交瘤细胞株已于2018年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15788。

编号为6B9的小鼠杂交瘤细胞株已于2018年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15789。

实施例2、EMC10不同抗体配对ELISA双抗夹心法检测人血清中EMC10的含量

一、目的

EMC10ELISA双抗夹心法检测人血清中EMC10的含量。

二、检测原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗EMC10抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗EMC10抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的EMC10呈正相关。酶标仪在450/630nm双波长测量吸光度(OD值)，计算样本浓度。

三、实验仪器

1、主要设备

(1)多功能酶标仪：型号：Model 680；生产厂家：Bio-Rad。

(2)37℃恒温箱：型号：GSP-9160MBE；生产厂家：上海博迅实业有限公司。

2、主要器具

(1)单道移液器：规格：10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。

(2)多道移液器：规格：300μL、100μL。

四、实验材料

1、主要材料

XRI酶标板：货号：59797；生产厂家：深圳市金灿华实业有限公司；批号：2844；备注：常温保存。

2、其它材料

(1)水：级别：蒸馏。

(2)试剂瓶：规格：1L。

(3)EP管：规格：0.5和1.5ml。

五、检测前准备工作

1、配制0.05％的PBST洗液(含有0.05％体积百分含量吐温-20的PBS缓冲液)5L。

2、标准品：加入标准品EMC10(在实施例1的步骤三中表达纯化)根据需要进行倍比稀释，配制成以下浓度：100、33.333、11.111、、3.704、1.235、0.412、0.137、0.046、0.015、0.005、0.002、0ng/mL，样品稀释液(0.1M PBS)直接作为空白孔0ng/mL。如配制33.333ng/mL标准品：取800μL 100ng/mL的上述标准品加入含有1600μL样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。

3、血清样本：

血清样本A：从下述不同人血清样本：585(30')、585(2h)、593(2h)、602(30’)、602(2h)、604(2h)中各取250μl混合使用。

血清样本B：从下述不同人血清样本：598(2h)、600(2h)、584(2h)、586(2h)、593(30')、584(30’)中各取250μl混合使用。

4、生物素标记抗体工作液：使用前10分钟，3种生物素化抗体(6B9-Biotin、4B12-1-Biotin、4B12-2-Biotin；其中，6B9是由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株6B9分泌的单克隆抗体，4B12-1是由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株4B12-1分泌的单克隆抗体，4B12-2是由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株4B12-2分泌的单克隆抗体)均用抗体稀释液(0.1M PBS)稀释为500ng/ml的工作液。当日使用。

5、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素Streptividin-HRP按1：2000倍用抗体稀释液进行稀释。如4μl亲和素标记抗体加7996μl亲和素标记抗体稀释液，轻轻混匀。辣根过氧化物酶标记亲和素EMC10(8C11)-HRP(8C11是由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株8C11分泌的单克隆抗体)稀释至1μg/ml，用抗体稀释液稀释。在使用前10分钟内配妥。

六、洗涤方法

手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液200μL，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

七、操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温30分钟；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1、包板：吸取兔抗人EMC10多克隆抗体(用SEQ ID No.1所示EMC10作为免疫原免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体)，EMC10单克隆抗体(6B9)，EMC10单克隆抗体(4B12-1)，EMC10单克隆抗体(4B12-2)分别溶解在0.1M PBS缓冲液中，制成浓度为1μg/ml的包被溶液。吸取EMC10单克隆抗体(1F12)溶解在0.1M PBS缓冲液中，制成浓度5μg/ml的包被液。100μl/孔，4℃包被过夜。

2、洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板2次，每次浸泡1-2分钟，大约200μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

3、封闭：封闭液(PBS+1％BSA+5％蔗糖，％表示g/100mL)250μl/孔，37℃，2h。

4、洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2。

5、检测：5种EMC10抗体包板的板条，分别设标准品孔、待测样本孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品EMC10(在实施例1的步骤三中表达纯化)或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2h。

6、洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2。

7、加生物素标记抗体工作液：每个孔中加入生物素标记抗体工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

8、洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤七中的2。

9、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素Streptividin-HRP工作液(临用前10分钟内配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

10、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤七中的2。

11、两种方法检测的酶标板同时显色。底物显色A、B液1：1(体积比)混合后，每孔加100μL，酶标板加上覆膜，37℃避光孵育15分钟。

12、每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

13、立即用酶标仪在450/630nm双波长测量各孔的光密度(OD值)，并读数。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

14、实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

八、结果判断

1、每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2、推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。(在线软件“FourParameter Logistic Fit”也比较好用)

3、若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

九、实验结果

1、第一块板(生物素标记抗体用6B9-Biotin)

(1)样品排列顺序如表3所示(单位为ng/ml)。

表3第一块板(生物素标记抗体用6B9-Biotin)的样品排列顺序

注：表中的各浓度为标注品的浓度，A和B分别表示血清样本A和血清样本B。

(2)原始OD值如表4所示。

表4第一块板(生物素标记抗体用6B9-Biotin)的样品的原始OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											A	2.665	0.175	3.457	0.326	3.457	0.185	3.458	0.155	3.458	0.197
B	1.526	0.163	3.462	0.326	3.34	0.169	3.439	0.145	3.458	0.185
											C	0.791	0.143	3.458	0.306	3.414	0.173	3.394	0.143	3.386	0.184
D	0.416	0.16	3.277	0.31	2.992	0.181	2.545	0.158	2.636	0.184
											E	0.263	0.179	2.287	0.793	1.309	0.35	1.129	0.384	1.266	0.361
F	0.219	0.187	1.272	0.457	0.6	0.225	0.478	0.218	0.502	0.244
											G	0.194		0.66		0.328		0.289		0.322
H	0.189		0.448		0.248		0.207		0.237

注：表4中所示的原始OD值对应的加样顺序如表3所示。

(3)标准曲线

第一个：EMC10多抗包板，生物素标记抗体用6B9-Biotin的标准曲线。MSE:0.000118225。R²:0.9998。SS:0.00130048。SYX:0.0136302。a:0.00847709。b:0.877181。c:108.108。d:5.17826。

第二个：EMC10单抗(1F12)包板，生物素标记抗体用6B9-Biotin的标准曲线。MSE:0.00312063。R²:0.9983。SS:0.0343269。SYX:0.0700275。a:0.029948。b:1.34619。c:0.803861。d:3.20718。

第三个：EMC10单抗(6B9)包板，生物素标记抗体用6B9-Biotin的标准曲线。MSE:0.00638516。R²:0.9968。SS:0.0702368。SYX:0.100169。a:0.0586796。b:2.01446。c:1.63825。d:3.25984。

第四个：EMC10单抗(4B12-1)包板，生物素标记抗体用6B9-Biotin的标准曲线。MSE:0.00253437。R²:0.9987。SS:0.0278781。SYX:0.0631077。a:0.0305326。b:1.63975。c:2.10936。d:3.34699。

第五个：EMC10单抗(4B12-2)包板，生物素标记抗体用6B9-Biotin的标准曲线。MSE:0.00132131。R²:0.9993。SS:0.0145344。SYX:0.0455669。a:0.034137。b:1.61639。c:1.94033。d:3.31914。

对以上结果的解释说明：应用软件做四参数法拟合曲线，用于估计剂量反应关系。

MSE(mean-square error)：均方误差。指参数估计值与参数真值之差平方的期望值；MSE可以评价数据的变化程度。R²(coefficient of determination)：判定系数。反映回归直线的拟合程度。SS(sum of squares of deviation from mean)：离均差平方和。计算每个观察值与平均数的差，将其平方后相加。是统计中离散趋势的重要指标之一。SYX：估计标准误差。a：曲线上渐近线估值。d：曲线下渐近线估值。b：曲线的斜率。c：最大结合一半时对应的剂量。c值越小，灵敏度越高。

(4)样品浓度(ng/ml)如表5所示。

表5第一块板(生物素标记抗体用6B9-Biotin)的样品浓度

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											A	100.000	0.015	100.000	0.015	100.000	0.015	100.000	0.015	100.000	0.015
B	33.333	0.005	33.333	0.005	33.333	0.005	33.333	0.005	33.333	0.005
											C	11.111	0.002	11.111	0.002	11.111	0.002	11.111	0.002	11.111	0.002
D	3.704	0	3.704	0	3.704	0	3.704	0	3.704	0
											E	1.235	0.093	1.235	0.212	1.235	0.313	1.235	0.389	1.235	0.287
F	0.412	0.177	0.412	0.071	0.412	<Lower Limit	0.412	0.119	0.412	0.097
											G	0.137		0.137		0.137		0.137		0.137
H	0.046		0.046		0.046		0.046		0.046

注：表5中所示的样品浓度对应的加样顺序如表3所示。

2、第二块板(生物素标记抗体用4B12-2-Biotin，另一种4B12-2包板的用4B12-1-Biotin)

(1)样品排列顺序如表6所示(单位为ng/ml)。

表6第二块板(生物素标记抗体用4B12-2-Biotin，另一种4B12-2包板的用4B12-1-Biotin)的样品排列顺序

注：表中的各浓度为标注品的浓度，A和B分别表示血清样本A和血清样本B。

(2)原始OD值如表7所示。

表7第二块板(生物素标记抗体用4B12-2-Biotin，另一种4B12-2包板的用4B12-1-Biotin)的样品的原始OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.472	0.113	3.453	0.189	3.452	0.11	3.452	0.095	3.455	0.118	3.451	0.212
B	1.413	0.089	3.455	0.147	3.461	0.101	3.395	0.098	3.462	0.113	3.46	0.219
													C	0.731	0.101	3.454	0.136	3.393	0.101	3.349	0.088	3.31	0.112	3.326	0.251
D	0.332	0.089	3.274	0.117	2.341	0.086	2.087	0.076	2.026	0.096	2.379	0.225
													E	0.184	0.086	2.113	0.426	0.869	0.197	0.79	0.238	0.832	0.209	0.982	0.469
F	0.141	0.102	0.977	0.168	0.366	0.121	0.319	0.109	0.353	0.138	0.512	0.19
													G	0.129		0.48		0.199		0.17		0.209		0.346
H	0.123		0.269		0.154		0.123		0.169		0.291

注：表7中所示的原始OD值对应的加样顺序如表6所示。

(3)标准曲线

第一个：EMC10多抗包板，生物素标记抗体用4B12-2-Biotin的标准曲线。MSE0.000167396。R² 0.9997。SS 0.00184136。SYX 0.0162188。a 0.0148881。b 0.899527。c87.6449。d 4.48268。

第二个：EMC10单抗(1F12)包板，生物素标记抗体用4B12-2-Biotin的标准曲线。MSE:0.00455926。R²:0.9978。SS:0.0501519。SYX:0.0846437。a:0.0774159。b:1.48304。c:0.923095。d:3.3951。

第三个：EMC10单抗(6B9)包板，生物素标记抗体用4B12-2-Biotin的标准曲线。MSE:0.00284514。R²:0.9986。SS:0.0312965。SYX:0.066865。a:0.0581838。b:1.78093。c:2.53142。d:3.42743。

第四个：EMC10单抗(4B12-1)包板，生物素标记抗体用4B12-2-Biotin的标准曲线。MSE:0.00411806。R²:0.9979。SS:0.0452987。SYX:0.080444。a:0.0514179。b:1.72431。c:2.89721。d:3.4252。

第五个：EMC10单抗(4B12-2)包板，生物素标记抗体用4B12-2-Biotin的标准曲线。MSE:0.00414401。R²:0.9979。SS:0.0455841。SYX:0.0806971。a:0.0588961。b:1.62647。c:3.03901。d:3.44268。

第六个：EMC10单抗(4B12-2)包板，生物素标记抗体用4B12-1-Biotin的标准曲线。MSE:0.00243536。R²:0.9987。SS:0.026789。SYX:0.0618628。a:0.047415。b:1.69935。c:2.52443。d:3.27712。

(4)样品浓度(ng/ml)如表8所示。

表8第二块板(生物素标记抗体用4B12-2-Biotin，另一种4B12-2包板的用4B12-1-Biotin)的样品浓度

注：表8中所示的样品浓度值对应的加样顺序如表6所示。

综合以上结果：根据标准曲线c值的大小，最终确定，ELISA法“1F12单抗作为捕获抗体，6B9-Biotin单抗作为检测抗体”为最优组合，效果最好，灵敏度最高。

实施例3、EMC10定量检测试剂盒(化学发光法)的制备

一、化学发光免疫分析(CLIA)中1F12单抗和6B9单抗分别作为捕获抗体检测效果比较

基于实施例2所得的结果，在ELISA方法中“1F12单抗作为捕获抗体，6B9-Biotin单抗作为检测抗体”为最优组合，效果最好。发明人先采用化学发光免疫分析(CLIA)“1F12单抗作为捕获抗体，6B9单抗作为检测抗体”的方法定量检测系列人血清待测样本(见表9)中EMC10的含量。具体操作参照以下步骤二相关步骤进行。

但从检测结果可以看出，仍有一部分人血清用该方法检测不到EMC10(表9)。为此发明人对检测方法进行了改进，采用化学发光免疫分析(CLIA)“6B9单抗作为捕获抗体，1F12单抗作为检测抗体”的方法进行检测，结果显示，在CLIA法“1F12单抗作为捕获抗体，6B9单抗作为检测抗体”组合中未被检测到的血清(包括编号为如下的各样本：19#、30#、31#、33#、34#、35#、36#、38#、40#、52#、54#、61#、62#、67#、75#、76#、78#、81#、82#、83#、86#、92#、96#)，在CLIA法“6B9单抗作为捕获抗体，1F12单抗作为检测抗体”组合中均检测到了EMC10的含量，并且其它血清样本中EMC10在后者组合中检测的数值也高于前者组合，最终确定人血清中EMC10的检测方法为“6B9单抗作为捕获抗体，1F12单抗作为检测抗体”组合的化学发光免疫分析(CLIA)的方法。

表9两种CLIA法检测人血清中EMC10蛋白含量的结果比较

注：表中#NUM！表示检测失败，无检测数据。

二、用于定量检测人血清中EMC10的化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒的制备

基于步骤一的检测结果，制备得到用于定量检测人血清中EMC10的化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒，其具体相关信息如下：

1、检验原理

本试剂盒采用双抗体夹心法。首先将一株EMC10单克隆抗体包被于固相载体表面，在微孔板各孔中分别加入标准品或血清样品后，再加入酶标记的另一株EMC10单克隆抗体，温育后即形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。充分洗涤后加入化学发光底物液，其发光强度与EMC10浓度成正比。测定每孔发光值，以各标准品发光值的对数(需减去S0的发光值)为纵坐标(Y轴)，各标准品浓度的对数为横坐标(X轴)作图，得到标准曲线。通过数学模型Log-Log回归处理得到回归直线，样品中EMC10浓度可从标准曲线上查出。

2、主要组份

主要组分见表10。

表10EMC10定量检测试剂盒(化学发光法)的主要组分

其中，各EMC10校准品浓度为：S0：0ng/ml；S1：0.3ng/ml；S2：1.5ng/ml；S3：7.5ng/ml；S4：30ng/ml；S5：120ng/ml。

(1)EMC10校准品：在实施例1的步骤三中表达纯化。

(2)EMC10酶结合物：用辣根过氧化酶标记抗EMC10的单克隆抗体1F12，单克隆抗体1F12为由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株1F12分泌的单克隆抗体。EMC10酶结合物配制方法：将HRP-抗EMC10单抗1F12用酶结合物稀释液(配方：0.02M磷酸盐缓冲液PH7.4、BSA(1％))按1：50000(体积比)稀释为工作液即表12中EMC10酶结合物。

(3)EMC10包被抗体板：抗EMC10的单克隆抗体6B9(单克隆抗体6B9为由实施例1中小鼠杂交瘤细胞株6B9分泌的单克隆抗体。)用包被缓冲液(配方：0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.4)稀释成5μg/mL，100μl/孔加到白色微孔板板孔中，2-8℃过夜放置20-24小时，取出扣干加入150μl/孔的封闭液(配方：0.02M磷酸盐缓冲液pH7.4、BSA(1％)、蔗糖(5％)，％表示g/100mL37℃放置2小时，扣干，晾干备用。

(4)发光底物液A：0.05MTris-HCl缓冲液、过氧化氢(0.68ml/L)。

(5)发光底物液B：0.05MTris-HCl缓冲液、鲁米诺(Luminol)(0.709g/L)、对碘酚(p-iodophenol)(0.264g/L)；

(6)浓缩洗涤液(20×)：0.5％(体积百分含量)TWEEN-20，0.02M磷酸盐缓冲液。

3、试验方法

(1)实验准备

A、在实验进行之前，先将试剂盒及待测样品放在室温环境中使之与外界温度达到平衡，充分混匀。

B、试剂盒内提供的浓缩洗涤液用蒸馏水1：20(体积比)稀释用。

(2)实验操作

1)加样枪分别加入50μl EMC10校准品、质控品(QC1:7.53-9.71-11.88ng/ml,QC2:34.8-52.74-75.16ng/ml；质控品含有一定浓度特定抗原(inomo)，用于评判实验结果是否可靠，三个数值分别是低限-靶值-高限。质控品测值处于低限-高限范围内，表明本次实验结果可靠)或待测血清样本到相应孔中。

2)每孔加入50μl EMC10酶结合物。

3)加样完毕后将微孔板用微量震荡器震荡使各孔内溶液充分混匀后放置在2-8℃冰箱中反应20-24小时。

4)弃去微孔板内液体，每孔加入洗涤液，静置30秒钟后吸干或甩干。如此反复洗涤5次。结束后在纸上将微孔板扣干。

5)将发光底物液A和发光底物液B按照1:1(体积比)比例混合，100μl/孔加入到板孔内。加样完毕后将微孔板震荡混合。

6)在室温(14～28℃)环境下闭光反应10分钟后在96孔板式发光仪上测量各孔发光值。

(3)数据处理

1)联机处理：由电脑自动处理得结果。注意选择适合的处理软件，使用Log-Log，线性拟和方式(本试剂盒推荐使用此拟和方式，但也可根据不同情况采用其它拟和方式)进行数据处理。

2)手工作图：以各标准品发光值(需减去S0的发光值)的对数为纵坐标(Y轴)，各标准品的浓度的对数为横坐标(X轴)作图，得到标准曲线。样品中EMC10浓度可从标准曲线上查出。

3)计算器处理：使用有线性拟和方式的计算器，可以比较方便的计算出样品浓度值，具体操作请查阅计算器使用说明书。

三、用于定量检测人血清中EMC10的化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒的应用实例

1、选择2017年9月至10月在本院健康体检成人样本(体检者知情并同意)，经全身体检，去除存在血检异常的样本。

2、标本收集

清晨空腹采集静脉血2mL，离血清并检测。标本无溶血。收集该740例样本相应的BMI、血压、血常规、尿常规、肝功能、肾功能、电解质、血脂、血糖等指标

3、检测方法

CLIA法测定血清EMC10浓度，具体操作参见步骤二。

4、数据分析

应用SPSS 20软件进行数据分析，对血清EMC10的值进行统计，确定参考范围。

5、结果

对数据进行开四次方处理，P>0.05，符合正态分布。成人血清EMC10正常参考值(95％)0.56-37.72ng/ml。

另外，发明人采用CLIA法“6B9单抗作为捕获抗体，1F12单抗作为检测抗体”对人丙种球蛋白、血清白蛋白、兔血清以及牛血清白蛋白分别进行检测，结果都是阴性的，证明本发明所提供的CLIA试剂盒特异性强。

实施例4、EMC10蛋白作为肥胖症血清标志物的应用

一、试验一

采用实施例3的步骤二中记载的试剂盒以及操作方法对正常体重人群、超重人群以及肥胖人群中各个个体的血清EMC10蛋白浓度进行检测。

正常体重人群：26例(均为知情同意的志愿者)，判断标准“BMI＜25kg/m²”；

超重人群：20例(均为知情同意的志愿者)，判断标准“25≤BMI≤29.9kg/m²”；

肥胖人群：160例(均为知情同意的志愿者)，判断标准“BMI＞29.9kg/m²”。

正常体重人群、超重人群以及肥胖人群中，各个个体的血清EMC10蛋白浓度见图5A，各人群的平均血清EMC10蛋白浓度见图5B。图5中，*P<0.05,****P<0.0001。

正常体重人群的平均血清EMC10蛋白浓度为5.78ng/mL，超重人群的平均血清EMC10蛋白浓度为13.63ng/mL，肥胖人群的平均血清EMC10蛋白浓度为21.84ng/mL。统计学分析显示，肥胖人群和超重人群的血清EMC10蛋白浓度均显著高于正常体重人群。

上述人群(包括正常体重、超重和肥胖人群)的肥胖相关临床指标与血清EMC10浓度的相关性分析结果见表11。

表11

其中，r为相关系数，正值为正相关，负值为负相关；P为统计学参数，P<0.05代表统计学上有显著性差异。

相关性分析结果表明：人血清中EMC10蛋白的浓度与体重(r＝0.341)、体重指数(BMI)(r＝0.363)、腰臀比(WHR)(r＝0.569)、空腹血清胰岛素浓度(r＝0.363)、腹部脂肪面积(r＝0.597)和皮下脂肪面积(r＝0.719)以及游离脂肪酸浓度(r＝0.539)显著正相关，上述临床指标均是肥胖相关的重要代谢指标，说明血清EMC10蛋白浓度越高，肥胖程度越严重。相关性分析结果表明：血清EMC10蛋白浓度与葡萄糖输注率(GIR)呈显著负相关(r＝-0.821)，高胰岛素正血糖钳夹实验是评估胰岛素敏感性的金标准，葡萄糖输注率越小，说明胰岛素敏感性越低，胰岛素抵抗也越严重，说明血清EMC10蛋白浓度越高，胰岛素抵抗越严重。

二、试验二

95例肥胖病人，判断标准“BMI＞29.9kg/m²”，均为知情同意的肥胖症患者。

检测肥胖病人进行干预前后血清EMC10蛋白浓度的变化情况。干预为如下①或②：①减重手术；②饮食和运动。减重手术组，49例病人，均进行①，减重手术前作为干预前，减重手术12个月后作为干预后。饮食运动干预组，46例病人，均进行②，持续时间为12个月，饮食和运动干预前作为干预前，持续饮食和运动干预12个月后作为干预后。采用实施例3的步骤二中记载的试剂盒以及操作方法检测血清EMC10蛋白浓度。

结果见图6。

减重手术组，减重手术12个月后体重指数下降了31.56％，伴随着血清EMC10蛋白浓度下降了51.11％。饮食运动干预组，虽然体重指数只下降了3.94％，血清EMC10蛋白浓度明显下降了20.19％。

(干预后体重指数-干预前体重指数)/干预前体重指数＝△体重指数。(干预后血清EMC10蛋白浓度-干预前血清EMC10蛋白浓度)/干预前血清EMC10蛋白浓度＝△血清EMC10蛋白浓度。相关性分析显示(Y＝1.017*X-17.64；P＝0.0023)，肥胖病人的BMI下降与血清EMC10蛋白浓度的下降呈显著正相关。

上述结果强烈提示，EMC10蛋白是一个肥胖症新型的血清标志物，通过检测血清EMC10蛋白水平可以实现对肥胖进行诊断，评估严重程度以及判断治疗的效果。

<110> 上海伦泽生物科技有限公司

<120> EMC10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用

<130> GNCYX181169

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Thr Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Met Ala Val Ala Ala Pro Ser Arg Ala Arg Gly Ser Gly Cys Arg Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Ala Arg Gly Ala Gly Ala Glu Gly Arg Glu Gly Glu Ala

35 40 45

Cys Gly Thr Val Gly Leu Leu Leu Glu His Ser Phe Glu Ile Asp Asp

50 55 60

Ser Ala Asn Phe Arg Lys Arg Gly Ser Leu Leu Trp Asn Gln Gln Asp

65 70 75 80

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Gln Arg Gln Leu Ser Glu Glu Glu Arg Gly

85 90 95

Arg Leu Arg Asp Val Ala Ala Leu Asn Gly Leu Tyr Arg Val Arg Ile

100 105 110

Pro Arg Arg Pro Gly Ala Leu Asp Gly Leu Glu Ala Gly Gly Tyr Val

115 120 125

Ser Ser Phe Val Pro Ala Cys Ser Leu Val Glu Ser His Leu Ser Asp

130 135 140

Gln Leu Thr Leu His Val Asp Val Ala Gly Asn Val Val Gly Val Ser

145 150 155 160

Val Val Thr His Pro Gly Gly Cys Arg Gly His Glu Val Glu Asp Val

165 170 175

Asp Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser Val Gln Leu Gln Pro Pro Thr Thr

180 185 190

Ala Pro Gly Pro Glu Thr Ala Ala Phe Ile Glu Arg Leu Glu Met Glu

195 200 205

Gln Ala Gln Lys Ala Lys Asn Pro Gln Glu Gln Lys Ser Phe Phe Ala

210 215 220

Lys Tyr Trp His Ile Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Leu Thr Ala Leu

225 230 235 240

Arg Pro Ala Ala Pro Gly Pro Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala

245 250

<210> 2

<211> 765

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcggcag ccagcgctgg ggcaacccgg ctgctcctgc tcttgctgat ggcggtagca 60

gcgcccagtc gagcccgggg cagcggctgc cgggccggga ctggtgcgcg aggggctggg 120

gcggaaggtc gagagggcga ggcctgtggc acggtggggc tgctgctgga gcactcattt 180

gagatcgatg acagtgccaa cttccggaag cggggctcac tgctctggaa ccagcaggat 240

ggtaccttgt ccctgtcaca gcggcagctc agcgaggagg agcggggccg actccgggat 300

gtggcagccc tgaatggcct gtaccgggtc cggatcccaa ggcgacccgg ggccctggat 360

ggcctggaag ctggtggcta tgtctcctcc tttgtccctg cgtgctccct ggtggagtcg 420

cacctgtcgg accagctgac cctgcacgtg gatgtggccg gcaacgtggt gggcgtgtcg 480

gtggtgacgc accctggggg ctgccggggc catgaggtgg aggacgtgga cctggagctg 540

ttcaacacct cggtgcagct gcagccgccc accacagccc caggccctga gacggcggcc 600

ttcattgagc gcctggagat ggaacaggcc cagaaggcca agaaccccca ggagcagaag 660

tccttcttcg ccaaatactg gcacatcatc ctgggggggg ccgtgttgct cacagccctg 720

cgtcctgctg cgccagggcc cgcgccaccg ccacaggagg cctga 765

Claims (10)

1.用于检测EMC10蛋白的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、

(b)或(c)：

(a)诊断或辅助诊断肥胖患者；

(b)评估肥胖患者的肥胖严重程度；

(c)评价肥胖患者的治疗效果。

2.一种产品，包括用于检测EMC10蛋白的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)诊断或辅助诊断肥胖患者；

(b)评估肥胖患者的肥胖严重程度；

(c)评价肥胖患者的治疗效果。

3.如权利要求1所述的应用或如权利要求2所述的产品，其特征在于：所述用于检测EMC10蛋白的物质为用于检测血清中EMC10蛋白的物质。

4.EMC10蛋白作为肥胖症标志物的应用。

5.EMC10蛋白作为肥胖症血清标志物的应用。

6.EMC10蛋白作为标志物的应用；所述标志物为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)诊断或辅助诊断肥胖患者的标志物；

(Ⅱ)评估肥胖患者的肥胖严重程度的标志物；

(Ⅲ)评价肥胖患者的治疗效果的标志物。

7.EMC10蛋白作为血清标志物的应用；所述血清标志物为如下(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)：

(ⅰ)诊断或辅助诊断肥胖患者的血清标志物；

(ⅱ)评估肥胖患者的肥胖严重程度的血清标志物；

(ⅲ)评价肥胖患者的治疗效果的血清标志物。

8.一种评估肥胖患者的肥胖严重程度的方法，包括如下步骤：检测待测患者血清中EMC10蛋白的浓度；血清EMC10蛋白浓度高的患者肥胖程度高于血清EMC10蛋白浓度低的患者。

9.EMC10蛋白作为靶标在干预和/或治疗肥胖中的应用。

10.用于抑制EMC10基因表达的物质或用于抑制EMC10蛋白活性的物质或用于降低EMC10蛋白含量的物质在干预和/或治疗肥胖中的应用。