CN107998397A - Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用 - Google Patents

Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107998397A
CN107998397A CN201711284133.6A CN201711284133A CN107998397A CN 107998397 A CN107998397 A CN 107998397A CN 201711284133 A CN201711284133 A CN 201711284133A CN 107998397 A CN107998397 A CN 107998397A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
emc10
albumen
improved
maintained
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711284133.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107998397B (zh
Inventor
王宣春
周玉传
吴斐
熊祖泉
陈匡阳
王新茹
曹心怡
李燕良
茅善华
丁强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huashan Hospital of Fudan University
Original Assignee
Huashan Hospital of Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huashan Hospital of Fudan University filed Critical Huashan Hospital of Fudan University
Priority to CN201711284133.6A priority Critical patent/CN107998397B/zh
Publication of CN107998397A publication Critical patent/CN107998397A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107998397B publication Critical patent/CN107998397B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用。实验证明，提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质可以预防男性不育、治疗男性不育、促进***和卵子受精、促进***和去透明带的卵子受精、提高***与胞膜融合的能力、治疗***功能障碍、促进***的成熟、促进***在附睾中的成熟、提高***的运动能力、提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平、促进***的获能、提高***的顶体反应能力、修复***异常形态、恢复钠/钾‑APT酶的活性、维持***内离子平衡、维持***内Na+平衡、维持***内HCO3‑平衡、维持***内pH值平衡、提高男性生育能力。本发明具有重大的应用价值。

Description

EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及EMC10蛋白作为标志物在诊断男性不育中的应用。
背景技术
人类首次发现内质网膜蛋白复合物(ER Membrane Protein Complex，EMC)是在酵母中，是由内质网中与蛋白折叠有关的6个亚基(即Emc1蛋白-Emc6蛋白)构成的复合物。后来在应用蛋白组学研究内质网相关的蛋白降解过程中，发现在动物中EMC是由10个亚基(即EMC1蛋白-EMC10蛋白)构成的复合物。EMC是一个多功能、进化保守的蛋白复合物，它被认为在内质网降解、内质网-线粒体锚定、多跨膜蛋白组装过程中发挥了多种作用。譬如，EMC6蛋白可能参与了线虫体内特异性蛋白在内质网的降解，也可能参与调节人体内细胞的自噬。另外，EMC1蛋白被发现与整体发育延迟、肌张力低下、脊柱侧弯与小脑萎缩有关。虽然，这些研究增加了我们对EMC生物学方面的认识，但是EMC的功能还远未完全阐明。
EMC10蛋白是多个物种(包括植物、无脊椎动物、哺乳动物等)进化上高度保守的蛋白之一。本发明的发明人第一次从人胰岛素瘤的cDNA库克隆出了EMC10蛋白的编码基因，并命名为INM02基因。因为EMC10蛋白与任何已知的蛋白或蛋白域均没有明显的同源性，所以EMC10蛋白被认为是一个新的蛋白质。目前，已经有数项研究揭示了EMC10蛋白的多种生物学功能。本发明的发明人利用ELISA方法，在国际上首次报导了EMC10蛋白是一个在人血清中可以被检测得到的分泌蛋白，并且发现在小鼠胰岛β细胞中编码EMC10蛋白的基因(即Emc10基因)的表达受葡萄糖的调控，提示它在糖代谢中可能发挥重要的作用。此后，另一个研究小组报道了从人纯化的造血干细胞中克隆到了EMC10蛋白的编码基因，该研究小组将其命名为HSS1基因，并将其另一个剪切异构体命名为HSM1基因；同时他们在体外研究发现，EMC10蛋白(HSS1基因)能够抑制胶质瘤细胞株的增殖、迁移、侵袭，同时也能够抑制内皮细胞的新生血管形成，因此他们认为EMC10蛋白是治疗恶性胶质母细胞瘤潜在的靶点。还有研究发现，在一个精神***小鼠模型中，升高的Mrita22基因(人EMC10基因的小鼠同源基因)能够抑制神经元细胞树突和脊突的发育，通过降低Mrita22基因的水平能够完全挽救上述小鼠模型海马椎体神经元树突和脊突发育的缺陷，提示EMC10蛋白在小鼠神经元树突和脊突形成过程中发挥重要的作用。尽管研究结果较多，但EMC10蛋白的生物学作用和发挥作用的机制在很大程度上仍旧不清楚。
***不育是全球范围内较严重的公共健康问题，15％的育龄夫妇存在着***不育的问题，其中男性不育占50％。现有研究表明，许多基因都参与了雄性不育的发病机制。然而，大多数的潜在原因仍然不清楚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防和/或治疗男性不育。
为解决上述技术问题，本发明首先保护提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
本发明还保护EMC10蛋白作为药物靶点在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
本发明还保护EMC10蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
上述任一所述的应用中，所述产品可为药物。
本发明还保护EMC10蛋白的应用，可为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
为解决上述技术问题，本发明还保护一种产品，其可含有EMC10蛋白或提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质；所述产品的功能可为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
所述产品具体可为药物。
本发明还保护如下X1)或X2)：
X1)用于检测EMC10蛋白的物质在制备诊断男性不育的产品中的应用；
X2)用于检测EMC10蛋白的物质在诊断男性不育中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还保护一种用于诊断男性不育的试剂盒，可包括用于检测EMC10蛋白的物质。
上述任一所述“用于检测EMC10蛋白的物质”可为检测EMC10蛋白表达量的物质。
上述试剂盒中还可包括记载有判断标准的载体；所述判断标准可为：如果待测者***中EMC10蛋白的表达量低于对照***中EMC10蛋白的表达量，则所述待测者为或疑似为男性不育患者；如果待测者***中EMC10蛋白的表达量不低于对照***中EMC10蛋白的表达量，则所述待测者不为或疑似不为男性不育患者；所述对照***为具有正常男性生育能力的***。
上述任一所述低于为统计学上的低于。
本发明还保护如下Y1)或Y2)：
Y1)EMC10蛋白作为生物标志物在开发诊断男性不育的试剂中的应用；
Y2)EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用。
上述任一所述***可为b1)或b2)：b1)小鼠***；b2)人***。
上述任一所述人***具体可为人通过***获取的***。
上述任一所述小鼠***具体可为小鼠位于附睾尾部中的***。
上述任一所述小鼠可为C57BL/6j小鼠。
实验证明，Emc10基因敲除导致小鼠雄性不育、抑制***和卵子受精、抑制***和去透明带的卵子受精、降低***与胞膜融合的能力、抑制***的成熟、抑制***在附睾中的成熟、降低***的运动能力、降低***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平、抑制***的获能、降低***的顶体反应能力、导致***异常形态、导致***内离子失衡、降低男性生育能力。提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质可以预防和/或治疗男性不育。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为实施例2和实施例3中步骤一的实验结果。其中，Wt为Emc10+/+小鼠，Ko为Emc10-/-小鼠，8-12w表示生长至8-12周龄，8-10m表示生长至8-10月龄。
图2为实施例3中步骤二的实验结果。其中，Wt为Emc10+/+小鼠，Ko为Emc10-/-小鼠，F为F模式，B为B模式，AR为AR模式，Con表示未处理(对照)，A23187为顶体反应诱导剂A23187，PG为孕酮。
图3为实施例3中步骤三的实验结果。其中，Wt为Emc10+/+小鼠，Ko为Emc10-/-小鼠，Te表示睾丸，Cap表示附睾头部，Prox.Cor表示附睾近体部，Distal Cor表示附睾远体部，Cau表示附睾尾部。
图4为实施例4中步骤一的实验结果。其中，Wt为Emc10+/+小鼠，Ko为Emc10-/-小鼠，Translation为翻译，Translational initiation为翻译启动，Cilium morphogenesis为纤毛形态形成，Spermatogenesis为***发生，Cilium assembly为纤毛装配，Intraciliarytransport为纤毛内运输，Protein folding为蛋白折叠，Cell projection organization为细胞突组装，Cell-cell adhesion为细胞间黏附，Protein transport为蛋白运输，tRNAcharging为氨基酸结合转运RNA，EIF2Signaling为EIF2信号，RAN Signaling为RAN信号，Regulation of eIF4Signaling为调控eIF4信号，Protein Ubiquitination为蛋白泛素化，Unfolded protein response为未折叠蛋白反应，Aldosterone Signaling为醛固酮信号，mTOR Signaling为mTOR信号，PI3K/AKT Signaling为PI3K/AKT信号，HypoxiaSignaling为缺氧信号，Asparagine Biosynthesis I为天冬酰胺生物合成I，eNOSSignaling为eNOS信号，GDP-L-fucose Biosynthesis I为GDP-L-岩藻糖生物合成I，Endoplasmic Reticulum Stress为内质网应激，Fertility为生殖，Sperm disorder为***功能紊乱，Cell death of germ cells为生殖细胞死亡。
图5为实施例4中步骤二的实验结果。其中，Wt为Emc10+/+小鼠，Ko为Emc10-/-小鼠，Ko+B为8Br-cAMP，Ko+I为IBMX。
图6为实施例5的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所有动物实验均由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所动物看护和使用委员会同意批准(许可证号：SYXK2007-0017)。
下述实施例中的所有小鼠均在上海模式生物研究中心饲养和繁殖，且实验过程中水和食物可自由获取。
制备兔抗人ATP1A4的抗体的步骤具体如下：(1)人工合成多肽(多肽的氨基酸序列为(从N端到C端)：CYDEIRKLLIRQHPDGWVERETYY)；此多肽为人ATP1A4蛋白的一部分；(2)用步骤(1)制备的多肽免疫健康的大耳白兔，收集血清，得到兔抗人ATP1A4的抗体。
EKRB培养液的溶质及其浓度为120mM NaCl、4.8mM KCl、1.0mM CaCl2、1.2mMMgSO4、1.2mM KH2PO4、5mM葡萄糖、21mM乳酸钠、0.25mM丙酮酸钠、25mM NaHCO3和3mg/mLBSA；溶剂为蒸馏水；pH值自然；115℃灭菌20min。其中，NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、KH2PO4、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、NaHCO3和BSA均为Sigma公司生产的最高纯度级的产品。
下述实施例中的统计学分析为用SigmaPlot12.5软件对数据进行T检验，P<0.05被认为具有统计学意义。
实施例1、EMC10蛋白的表达、纯化和EMC10多克隆抗体的制备
1、载体构建
将EMC10基因和载体pET32a连接，得到重组载体pPROEX HT-EMC10。
对重组载体pPROEX HT-EMC10进行测序。根据测序结果，对重组载体pPROEX HT-EMC10 进行结构描述如下：向载体pET32a的EcoRI和HindⅢ酶切位点之间***EMC10基因的核苷酸序列。
2、EMC10蛋白的表达
(1)将重组载体pPROEX HT-EMC10导入大肠杆菌ROSSET(DE3)中，得到重组大肠杆菌，命名为ROSSET(DE3)/pPROEX HT-EMC10。
(2)完成步骤(1)后，将ROSSET(DE3)/pPROEX HT-EMC10单菌落接种于5mL YTA培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm为1.0-2.0，得到菌液甲。
(3)将菌液甲接种至500mL YTA培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm为1.0-2.0，得到菌液乙。
(4)取菌液乙，加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，然后25℃诱导表达3h，得到菌液丙。
(5)取菌液丙，4℃、4000rpm离心20min，弃上清，收集菌体。
(6)取步骤(5)收集的部分菌体，超声裂解，离心，得到菌体破碎沉淀和上清液。将菌体破碎沉淀和上清液进行SDS-PAGE。
结果表明，菌体破碎沉淀中在分子量约32kd处有一浓集条带，而上清液中表达量低。因此，EMC10蛋白在包涵体中表达。
3、EMC10蛋白的纯化
(1)取步骤2中(5)收集的剩余菌体，加入BugBuster(Novagen公司的产品)并超声裂解细菌，离心，收集沉淀。
(2)取步骤(1)收集的沉淀，加入含8M尿素的1×binging buffer溶解，然后将溶解的上清加入经NiSO4处理好的resin柱，洗涤后用1×elute buffer置换柱中EMC10蛋白，得到纯化的EMC10蛋白。
1×binging buffer、1×elute buffer均为…公司的产品。
4、EMC10多克隆抗体制备
(1)将步骤3得到的纯化的EMC10蛋白进行SDS-PAGE电泳，再将凝胶放入考马斯亮兰染液染色4h，取出凝胶放入脱色液中脱色4～8h，用无菌手术刀片割下目的条带，然后用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤2次，4℃保存备用。
(2)采用新西兰大白兔作为免疫动物。白兔作免疫接种前采集血样以作为阴性对照。将含100μg EMC10蛋白的凝胶碾碎，与弗氏完全佐剂乳化，在白兔背部刮毛后，分散24－36位点注射，初次免疫后分别在第4周、第7周、第9周和第11周以等量的抗原与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫。末次免疫后心脏采血，用Western Blot方法检测抗体效价。末次免疫后第10天颈动脉放血，分离出免疫血清，免疫血清加NaN3至终浓度0.02％，分装于1.5mL离心管，-80℃保存备用。采用Western Blot方法检测抗体滴度和质量。
(3)向免疫血清中加入Binding/Washing Buffer(体积比1：1)得到血清稀释液。向空吸附柱中加入1mL的Protein A Resin悬浊液，待树脂沉淀后，排干缓冲液，加入5mLBinding/Washing Buffer洗一遍树脂，向装好的吸附柱中缓慢加入血清稀释液(过柱流量为1mL/min)，样品完全过柱后，加30mL Binding/Washing Buffer洗柱子，向吸附柱中加入10mL Elution Buffer洗脱抗体，收集洗脱液，立即向洗脱液中加入1M的Tris-HCl，调整pH至7.4～8.0，即得到EMC10多克隆抗体。
实施例2、Emc10基因敲除导致小鼠雄性不育
1、打靶载体的获得
采用细菌同源重组技术，将两个loxp片段***到Emc10基因(Ensembl号：ENSMUSG00000008140)第2号外显子的两侧，再将抗新霉素元件***到第2号和第3号内显子之间，得到打靶载体。打靶载体的构建方法参考如下文献：Pentao Liu，Nancy A.，Jenkinsand Neal G.Copeland.A highly efficient recombineering-based method forgenerating conditional knockout mutations.Genome Res.2003Mar；13(3):476-84.Chan W，Constantino N，Lee SC，Su Q，Melvin D，Court DL，Liu P.A recombineeringbased approach for high-throughput conditional knockout targeting vectorconstruction.Nucleic Acids Res.2007；35(8)：e64.Epub 2007Apr 10.
2、Emc10基因敲除纯合子小鼠的获得
(1)将步骤1得到的打靶载体线性化，电穿孔导入129Sv/Ev小鼠胚胎干细胞(SCR012，Chemicon Ltd.)，然后分离并扩增抗新霉素的胚胎干细胞。
(2)完成步骤(1)后，将抗新霉素的胚胎干细胞微注射至雌性C57BL/6J小鼠的囊胚，再移植到假孕雌鼠的子宫，分娩，得到嵌合小鼠。
(3)完成步骤(2)后，将嵌合小鼠与C57BL/6j小鼠交配，得到杂合子小鼠。
(4)完成步骤(3)后，将杂合子小鼠与FLp重组小鼠(003800，Jackson lab)杂交，得到去除抗新霉素基因的小鼠。
(5)完成步骤(4)后，将去除抗新霉素基因的小鼠与EIIa-Cre小鼠杂交(003314，Jackson lab)(目的为去除flox基因)，得到Emc10基因敲除杂合子小鼠。
(6)完成步骤(5)后，将Emc10基因敲除杂合子小鼠互相交配，得到Emc10基因敲除纯合子小鼠(以下简称Emc10-/-小鼠)和野生型小鼠(以下简称Emc10+/+小鼠)。
观察并统计Emc10-/-小鼠和Emc10+/+小鼠的生长发育情况。结果表明，Emc10-/-小鼠与Emc10+/+小鼠的生存率、外形和总体行为上没有区别；但雄性Emc10-/-小鼠完全不育(图1中A)，雌性Emc10-/-小鼠的生育能力下降。
上述结果表明，Emc10基因敲除导致小鼠雄性不育，雌性生育能力下降。
实施例3、Emc10基因敲除导致小鼠雄性不育的表型研究
一、Emc10基因可能参与受精卵的受精过程
1、取6只雄性Emc10-/-小鼠，与若干只雌性野生型小鼠交配3个月。交配期间观察雌性野生型小鼠生殖道是否存在精栓。
实验结果如下：雌性野生型小鼠生殖道中存在精栓，说明交配正常；但没有后代出生。
2、体外受精实验一
(1)向成熟雌性野生型小鼠腹腔注射5个单位的怀孕母马血清***。
(2)完成步骤(1)后第48h，向所述成熟雌性野生型小鼠腹腔注射10个单位的hCG。
(3)完成步骤(2)后第13h，将所述成熟雌性野生型小鼠处死，然后取出输卵管并置于含人输卵管液的培养皿(规格为35mm)，最后分离出卵丘***。
(4)取待测***(Emc10-/-小鼠***或Emc10+/+小鼠***)，用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次。
(5)将完成步骤(4)的待测***和步骤(3)分离的卵丘***混合，然后5％CO2、37℃孵育60min。
(6)取完成步骤(5)的混合液，用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液充分洗涤(目的为去除未结合的***)，然后5％CO2、37℃培养24h。
将完成步骤(6)的溶液置于显微镜下观察，并计算授精后两细胞胚胎的数量。
实验结果见图1中B和D。结果表明，Emc10-/-小鼠***授精的受精卵均不能发育到两细胞胚胎的阶段，而Emc10+/+小鼠***授精的受精卵则可发育到两细胞胚胎的阶段。
3、体外受精实验二
(1)同步骤2中(1)。
(2)同步骤2中(2)。
(3)同步骤2中(3)。
(4)取步骤(3)分离的卵丘***，去透明带，得到去透明带的卵丘***。
(5)同步骤2中(4)。
(6)将完成步骤(5)的待测***和步骤(4)得到的“去透明带的卵丘***”混合，然后5％CO2、37℃孵育60min。
(7)取完成步骤(6)的混合液，用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液充分洗涤(目的为去除未结合的***)，然后5％CO2、37℃培养24h。
将完成步骤(7)的溶液置于显微镜下观察，并计算授精后两细胞胚胎的数量。
实验结果见图1中B。结果表明，Emc10-/-小鼠***无法使去透明带的卵丘***受精，而Emc10+/+小鼠***可使去透明带的卵丘***受精。因此，Emc10-/-小鼠***不具备与胞膜融合并激活受精的能力。
4、胞浆内单精注射和生育实验
(1)同步骤2中(1)。
(2)同步骤2中(2)。
(3)同步骤2中(3)。
(4)取待测***(Emc10-/-小鼠***或Emc10+/+小鼠***)，用Piezo驱动的吸管(Piezoelectric actuator，PrimeTech公司的产品)分离待测***的头部和尾部，然后将待测***的头部注射到步骤(3)分离的卵丘***内，再将受精的卵丘***在KSOM培养液中孵育，待胚胎发育到两细胞阶段，植入假孕雌鼠的输卵管内，观察***雌鼠的生育情况。
实验结果见图1中C。结果表明，Emc10-/-小鼠***和Emc10+/+小鼠***均可使野生型小鼠的卵丘***受精，且均发育成正常的胚胎。
上述结果表明，Emc10-/-小鼠的***发生功能正常且携带了完整的单倍体基因组。Emc10基因可能参与受精卵的受精过程。
二、Emc10基因敲除导致***功能障碍
待测小鼠为雄性Emc10-/-小鼠或雄性Emc10+/+小鼠。
1、Emc10基因敲除不影响***发生且不影响睾丸和附睾的发育
观察待测小鼠的睾丸和附睾形态结构，测量待测小鼠体重和睾丸重量，收集成年待测小鼠位于睾丸、附睾头部、附睾近端、附睾远端或附睾尾部的***并检测***数量。
结果如下：雄性Emc10-/-小鼠和雄性Emc10+/+小鼠的体重无显著差异；生长至8-12周龄时，与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠睾丸重量和附睾内***数量明显较少；生长至8-10月龄时，与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠睾丸重量和附睾内***数量则无显著差异；将睾丸重量标准化后，任何年龄段的雄性Emc10-/-小鼠和雄性Emc10+/+小鼠单位睾丸重量的***数均不存在显著差异；与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠睾丸和附睾形态结构无明显差异。上述结果表明，Emc10基因敲除不影响***发生且不影响睾丸和附睾的发育。
2、EMC10对***在附睾中的成熟具有重要的作用
***离开睾丸以后，在与卵子相互作用之前，必须在附睾中经历功能性成熟。这个过程包括***运动能力的获得、***的获能和顶体反应能力的获得。
(1)Emc10基因敲除导致***的运动能力显著下降
将成年待测小鼠位于附睾尾部中的***置于EKRB培养液中，37℃孵育；然后在室温条件下采用HTM-TOX IVOS***运动分析仪(Hamilton-Thorn Research公司的产品)分析***的运动情况，即第0min(成年待测小鼠位于附睾尾部中的***置于EKRB培养液时)、孵育第30min、孵育第60min、孵育第90min和孵育第120min分析***的运动情况。HTM-TOXIVOS***运动分析仪的参数设置如下：温度37℃，最小细胞体积两个像素，最小对比度50，最低静态对比25，低VAP切点值20，低VSL切点值30，阈值直线度50％，静态头部尺寸0.3-1.95，静态头部强度0.5-1.3，放大率0.81，以60Hz的帧速率获取30帧。整个分析过程中使用回放功能以检测方法的精确性。
实验结果表明，与Emc10+/+小鼠相比，Emc10-/-小鼠***的运动能力显著下降：包括总运动能力(图2中A)、路径速度(图2中B)、线速度(图2中C)和轨道速度(图2中D)在内的主要运动参数均显著下降；但Emc10+/+小鼠和Emc10-/-小鼠的***活力相似(94.0±1.0％vs93.7±1.1％)。
(2)Emc10基因敲除导致***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化功能受损
***在附睾尾部的正常获能表现为时间依赖的一系列蛋白酪氨酸磷酸化水平的增加。
取成年待测小鼠位于附睾尾部中的***，从***中抽提总蛋白，在12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶上电泳分离，再转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用酪氨酸磷酸化(Millipore 4G10克隆，1：10000稀释)抗体孵育，二抗采用辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔抗体(Sigma公司的产品)，最后通过ECL Plus(Amersham)化学发光显示目的条带。
实验结果见图2中E。结果表明，将成年雄性Emc10-/-小鼠位于附睾尾部中的***置于EKRB培养液中孵育后，获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平并没有随着时间的延长而增加；而将成年雄性Emc10+/+小鼠位于附睾尾部中的***置于EKRB培养液中孵育后，获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平则随着时间的延长而增加。因此，Emc10基因敲除导致***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化功能受损。
(3)Emc10基因敲除导致***的获能和顶体反应能力受到抑制
a、取成年待测小鼠位于附睾尾部中的***，用金霉素(CTC)染色，然后根据染色结果评估***的获能情况和顶体反应。整个实验至少评估了300个***不同的CTC染色方式：F模式是指整个头部均有荧光染色，代表具备完整顶体但未获能的***；B模式是指除了顶体后部，其它头部区域均有荧光带，代表具有完整顶体且已获能的***；AR模式是指整个***头部均没有荧光染色，代表获能且发生顶体反应的***。三个阶段均可看到在***体部有明亮的荧光染色。
实验结果见图2中F：与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠未获能的***(F模式)显著增加，获能***(B模式)的比例显著减少，自发性顶体反应(AR模式)的***数量也显著减少。结果表明，成年雄性Emc10-/-小鼠位于附睾尾部中的***的获能受到抑制，这一结果与步骤(2)中获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平没有随着时间的延长而增加的结果完全一致。
b、完成步骤a后，用顶体反应诱导剂A23187或孕酮刺激AR模式的***。
实验结果见图2中G。结果表明，成年雄性Emc10+/+小鼠***对A23187或孕酮的反应良好，而成年雄性Emc10-/-小鼠***对顶体反应诱导剂A23187或孕酮没有反应。
上述结果表明，EMC10对***在附睾中的成熟具有重要的作用。
三、Emc10基因敲除导致***形态学的异常
收集成年待测小鼠位于睾丸、附睾头部、附睾近端、附睾远端或附睾尾部的***，在显微镜下观察。待测小鼠为雄性Emc10-/-小鼠或雄性Emc10+/+小鼠。
实验结果如下：雄性Emc10-/-小鼠和雄性Emc10+/+小鼠位于睾丸中的***在形态学上没有差异(图3中A)；雄性Emc10-/-小鼠位于附睾头部或近体部的***在***体部和尾部的结合处出现明显的弯曲(图3中B和C)，雄性Emc10+/+小鼠则没有出现这一现象；雄性Emc10-/-小鼠位于附睾远体部或尾部的***有很多在体尾的结合部存在发夹样的折叠(图3中D和E)，雄性Emc10+/+小鼠则没有出现这一现象；雄性Emc10-/-小鼠位于附睾尾部的***中，56％在形态学上出现了发夹样的折叠(图3中E)，而雄性Emc10+/+小鼠***几乎没有出现发夹样的折叠。结果表明，与雄性Emc10+/+小鼠的***相比，雄性Emc10-/-小鼠存在发夹样的畸形***，并且在睾丸向附睾的移行过程中逐渐增加。可见，Emc10基因敲除会导致小鼠***形态上的异常，同时提示EMC10对维持***从睾丸移动到附睾的过程中的正常形态具有重要作用。
实施例4、Emc10基因敲除导致小鼠雄性不育的分子机制研究
一、Emc10基因敲除导致***的蛋白质组表达谱发生显著改变
因为成熟***丧失基因转录的能力，本发明的发明人采用TMT标记的定量分析法在蛋白组学水平进行了无偏移筛选分析。具体步骤如下：取生长至8-12周龄待测小鼠(雄性Emc10-/-小鼠或雄性Emc10+/+小鼠)17只，抽提总蛋白，胰蛋白酶消化蛋白质，消化后的肽段用TMT(Tandem Mass Tag)6-plex试剂(Pierce Biotechnology公司的产品)标记，然后用Aquity UPLC***(Waters Corporation公司的产品)将混合标记的多肽用高pH值分离，再用Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司的产品)分析。最后用ProteomeDiscoverer software、Mascot、Scaffold Q+、gene ontology(GO)term enrichmentanalysis和Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行数据处理和量化分析。
结果如下：与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠有327个蛋白质的表达发生了1.5倍以上的显著改变。热点图和火山图显示，这327个显著改变的蛋白质中，有96.6％(316/327)的蛋白质在雄性Emc10-/-小鼠***中表达是上调的，仅有3.4％的蛋白质在雄性Emc10-/-小鼠***中表达是下调的(图4中A)。应用DAVID生物信息学(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对这327个蛋白质进行了分析，以明确哪一个GO生物学过程在雄性Emc10-/-小鼠***中发生了显著改变。R-Script图显示在雄性Emc10-/-小鼠***中显著改变的前五个生物学过程(图4中C)，分别是翻译、翻译启动、纤毛形态形成、***发生和纤毛装配。另外，IPA通路富集分析发现，雄性Emc10-/-小鼠***中EIF2和PI3K/Akt信号通路被显著激活，而eNOS通路则被显著抑制(图4中D)。IPA模块分析显示，Emc10基因敲除会引起一系列与促进生育、抑制***异常和抑制生殖细胞凋亡相关蛋白表达的上调，上述反应均能够提高雄性生育能力(图4中E)。同时还发现，一系列抑制细胞凋亡相关蛋白的表达在雄性Emc10-/-小鼠***中的表达是上调的，这意味着EMC10基因敲除提高了细胞的存活率。理论上说，生育能力的激活和***存活率的提高均有利于雄性Emc10-/-小鼠的生育，上述蛋白组学的研究结果与雄性Emc10-/-小鼠不育的表型相互矛盾，本发明的发明人认为上述蛋白组学发现的有利于生育的一系列表现是对EMC10基因敲除导致不育的代偿反应。为了探究雄性Emc10-/-小鼠不育的直接分子机制，必须研究那些下调的蛋白以寻找雄性Emc10-/-小鼠***功能紊乱的驱动因素。
与雄性Emc10+/+小鼠相比，在雄性Emc10-/-小鼠***中仅检测到极少数(3.4％)蛋白质下调，并且在这些蛋白中，只有组成Na/K-ATP酶的ATP1A4蛋白(Na/K-ATP酶的α亚基)和ATP1B3蛋白(Na/K-ATP酶的β亚基)的表达量减少了3倍以上(图4中B)。提示EMC10基因可能对Na/K-ATP酶活性的调节发挥了重要的作用，而Na/K-ATP酶对维持细胞内低钠状态具有重要作用。
二、Emc10基因敲除导致***细胞内离子失衡
待测小鼠为雄性Emc10-/-小鼠或雄性Emc10+/+小鼠。
1、EMC10调控***内Na/K-ATP酶的表达
取成年待测小鼠位于附睾尾部中的***，从***中抽提到总蛋白，在12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶上电泳分离，再转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用ATP1A1(Proteintech，1：5000稀释)、ATP1A4(1：1000稀释)、ATP1B3(Abcam，1：1000稀释)、酪氨酸磷酸化(Millipore 4G10克隆，1：10000稀释)或α肌动蛋白(Sigma，1：20000稀释)抗体孵育，二抗采用辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔抗体(Sigma)和山羊抗小鼠抗体(Millipore)(稀释度均是1：10000)，最后通过ECL Plus(Amersham)化学发光显示目的条带。
结果表明，ATP1A4蛋白和ATP1B3蛋白在雄性Emc10-/-小鼠***中几乎没有表达(图5中A和B)，而在雄性Emc10+/+小鼠***中的表达量较高；ATP1A1蛋白(Na/K-ATP酶的另一个α亚基)在雄性Emc10+/+小鼠和雄性Emc10-/-小鼠***中的表达量无显著差异(图5中A)。
2、Emc10基因敲除导致***细胞内离子失衡
待测小鼠***为成年雄性Emc10-/-小鼠位于附睾尾部的***或成年雄性Emc10+/+小鼠位于附睾尾部的***。
测定待测小鼠***的Na+浓度。具体步骤如下：(1)取待测小鼠***，置于含20μMSBFI-AM和0.2％(v/v)普鲁康酸的pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液中，然后5％CO2、37℃培养60min；(2)取完成步骤(1)的体系，用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次，然后加入不含BSA的EKRB培养液(不含BSA的EKRB培养液与EKRB培养液的区别仅在于不含有BSA)，得到悬浮液；(3)用荧光光度计(BioTek公司的产品)检测悬浮液在340nm或380nm波长激发时产生的荧光信号，用OD340nm/OD380nm的荧光比值计算Na+浓度。
测定待测小鼠***的pH值。具体步骤如下：(1)取待测小鼠***，置于含1.2μMBCECF-AM的pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液中，然后5％CO2、37℃培养15min；(2)取完成步骤(1)的体系，用pH7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次(目的为去除游离的BCECF-AM)；然后加入不含HCO3-的EKRB培养液(EKRB培养液与不含HCO3-的EKRB培养液的区别仅在于将EKRB培养液中25mM NaHCO3替换为25mM NaCl；(3)用荧光光度计(BioTek公司的产品)检测完成步骤(2)的体系在500nm或439nm波长激发时产生的荧光信号；(4)通过软件(FeliX，version1.41)将OD500nm/OD439nm激发波长的荧光读数转化为pH值。
结果如下：与雄性Emc10+/+小鼠相比，雄性Emc10-/-小鼠附睾尾部的***的Na+水平显著升高(图5中C)；当用不含HCO3 -的培养液孵育Emc10-/-和野生型***时，二者细胞内的pH值没有明显的差异，但是在含有HCO3 -的培养液孵育之初和***获能后的1h，HCO3 -诱导的pH值升高在Emc10-/-***显著被抑制了(图5中D)，上述结果提示EMC10参与了***细胞中的Na+和HCO3 -转运。
诸多研究显示cAMP可以促进缺乏HCO3 -培养液中***的酪氨酸磷酸化，为了明确雄性Emc10-/-小鼠附睾尾部的***中蛋白酪氨酸磷酸化的下降是否由于HCO3 -诱导的pH值增加导致，本发明的发明人将雄性Emc10-/-小鼠附睾尾部的***在含有8Br-cAMP(一种具有生物活性的cAMP类似物)或者IBMX(一种可以阻止cAMP被环核苷酸磷酸二酯酶降解的抑制剂)的获能培养基中孵育，图5中E显示雄性Emc10-/-小鼠附睾尾部的***中蛋白酪氨酸磷酸化水平的下降可以被8Br-cAMP或IBMX完全挽救，进一步说明Emc10-/-***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化功能障碍是由于HCO3 -诱导的pH值升高受损导致。
上述研究结果表明，Emc10基因敲除导致***细胞内离子失衡。EMC10对于维持***细胞内Na+和HCO3-的平衡发挥着重要作用。
实施例5、***内EMC10蛋白水平与人***的运动能力呈正相关
本实施例遵照1964年赫尔辛基宣言及其后修正案中的伦理标准，并得到了复旦大学附属华山医院伦理委员会的审核批准。本实施例中的实验均是在本人知情同意的前提下进行的，且均签署知情同意书。
一、弱精症患者***的获取
共纳入2017年3月1日到4月30日在华山医院男性科门诊的27名弱精症患者，且排除了生殖***器质性病变患者、未经治疗的内分泌紊乱患者、两年内有药物或酒精滥用的患者以及有影响***运动力生活习惯的患者。
弱精症患者***取精，分别收集***，然后组成低运动***组。
二、正常男性***的获取
正常男性***取精，分别收集***，然后组成正常运动***组(作为对照)。
除了***的运动能力以外，低运动***组和正常运动***组的参数(包括年龄、***体积、***数量以及***形态等)均无明显差异(表1)。
正常运动***定义为：A级+B级≥50％,低运动***定义为：A+B＜50％。
表1.临床***样品的特征性参数
低运动***组 正常运动***组 P值
数量 20 7 -
年龄 30.45±3.29 29.57±4.47 0.601
***(mL) 4.63±1.73 4.00±1.07 0.396
存活率(％) 55.50±8.65 62.14±9.20 0.110
A级(％) 12.25±5.80 23.57±2.26 ＜0.001
B级(％) 17.75±3.70 30.00±0.00 ＜0.001
A级+B级(％) 30.00±8.51 53.57±2.26 ＜0.001
C级(％) 23.00±6.96 17.14±2.47 0.046
D级(％) 47.00±6.40 29.29±1.75 ＜0.001
***计数(106) 55.88±26.81 70.14±30.10 0.270
形态正常率(％) 53.00±6.40 58.57±6.39 0.068
EMC10蛋白水平 0.18±0.30 0.65±0.38 0.004
注：“－”表示不存在。
三、western印记法
从低运动***组和正常运动***组中的***中抽提总蛋白，在12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶上电泳分离，再转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用EMC10多克隆抗体(1:5000稀释)和α肌动蛋白抗体(Sigma，1:20000稀释)孵育，二抗采用辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔抗体(Sigma)和山羊抗小鼠抗体(Millipore)(稀释度均是1:10000)，最后通过ECL Plus(Amersham)化学发光显示目的条带。
结果表明，EMC10蛋白表达水平与***的运动能力呈正相关性(图6中A和B)；统计学分析显示与正常运动***组(A+B>50％)相比，低运动***组(A+B<50％)的***中EMC10蛋白的水平明显减少(图6中C，P<0.01)。上述结果表明，EMC10蛋白可以调节人***运动能力，并且***中EMC10蛋白水平的降低是男性不育的原因之一。

Claims (10)

1.提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
2.EMC10蛋白作为药物靶点在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
3.EMC10蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
4.EMC10蛋白的应用，为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
5.一种产品，其含有EMC10蛋白或提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质；所述产品的功能为如下A1)至A19)中的至少一种：
A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)促进***和卵子受精；A4)促进***和去透明带的卵子受精；A5)提高***与胞膜融合的能力；A6)治疗***功能障碍；A7)促进***的成熟；A8)促进***在附睾中的成熟；A9)提高***的运动能力；A10)提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平；A11)促进***的获能；A12)提高***的顶体反应能力；A13)修复***异常形态；A14)恢复钠/钾-APT酶的活性；A15)维持***内离子平衡；A16)维持***内Na+平衡；A17)维持***内HCO3-平衡；A18)维持***内pH值平衡；A19)提高男性生育能力。
6.X1)或X2)：
X1)用于检测EMC10蛋白的物质在制备诊断男性不育的产品中的应用；
X2)用于检测EMC10蛋白的物质在诊断男性不育中的应用。
7.一种用于诊断男性不育的试剂盒，包括用于检测EMC10蛋白的物质。
8.如权利要求6所述的应用或权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述“用于检测EMC10蛋白的物质”为检测EMC10蛋白表达量的物质。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括记载有判断标准的载体；
所述判断标准为：如果待测者***中EMC10蛋白的表达量低于对照***中EMC10蛋白的表达量，则所述待测者为或疑似为男性不育患者；如果待测者***中EMC10蛋白的表达量不低于对照***中EMC10蛋白的表达量，则所述待测者不为或疑似不为男性不育患者；所述对照***为具有正常男性生育能力的***。
10.Y1)或Y2)：
Y1)EMC10蛋白作为生物标志物在开发诊断男性不育的试剂中的应用；
Y2)EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用。
CN201711284133.6A 2017-12-07 2017-12-07 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用 Active CN107998397B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711284133.6A CN107998397B (zh) 2017-12-07 2017-12-07 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711284133.6A CN107998397B (zh) 2017-12-07 2017-12-07 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107998397A true CN107998397A (zh) 2018-05-08
CN107998397B CN107998397B (zh) 2020-09-04

Family

ID=62057014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711284133.6A Active CN107998397B (zh) 2017-12-07 2017-12-07 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107998397B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108707586A (zh) * 2018-06-19 2018-10-26 上海伦泽生物科技有限公司 抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体及其应用
CN108802372A (zh) * 2018-06-19 2018-11-13 上海伦泽生物科技有限公司 检测人血清中内质网膜蛋白复合体亚单位10的试剂盒
CN108845142A (zh) * 2018-06-19 2018-11-20 上海伦泽生物科技有限公司 Emc10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用
CN107998397B (zh) * 2017-12-07 2020-09-04 复旦大学附属华山医院 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012032A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Protein complex
CN1414975A (zh) * 1999-12-07 2003-04-30 圭尔夫大学 性染色体特异性蛋白质,种特异性和***特异性蛋白质以及它们的鉴定和分离方法
CN102127163A (zh) * 2010-01-20 2011-07-20 复旦大学附属华山医院 核因子tdrp1的克隆、蛋白表达、多抗制备以及应用
CN103630678A (zh) * 2013-03-29 2014-03-12 中国科学院城市环境研究所 男性不育的生物标志物及其应用
CN103776914A (zh) * 2013-10-10 2014-05-07 中国科学院城市环境研究所 原因不明性***的生物标志物及其应用方法
CN104846087A (zh) * 2015-05-04 2015-08-19 四川大学华西第二医院 一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法
CN106442770A (zh) * 2016-09-05 2017-02-22 南京医科大学 与特发性男性不育相关的***代谢小分子标志物及其检测方法和应用
WO2017035176A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method of preventing or treating obesity with an emc10 inhibitor

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998397B (zh) * 2017-12-07 2020-09-04 复旦大学附属华山医院 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012032A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Protein complex
CN1414975A (zh) * 1999-12-07 2003-04-30 圭尔夫大学 性染色体特异性蛋白质,种特异性和***特异性蛋白质以及它们的鉴定和分离方法
CN102127163A (zh) * 2010-01-20 2011-07-20 复旦大学附属华山医院 核因子tdrp1的克隆、蛋白表达、多抗制备以及应用
CN103630678A (zh) * 2013-03-29 2014-03-12 中国科学院城市环境研究所 男性不育的生物标志物及其应用
CN103776914A (zh) * 2013-10-10 2014-05-07 中国科学院城市环境研究所 原因不明性***的生物标志物及其应用方法
CN104846087A (zh) * 2015-05-04 2015-08-19 四川大学华西第二医院 一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法
WO2017035176A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method of preventing or treating obesity with an emc10 inhibitor
CN106442770A (zh) * 2016-09-05 2017-02-22 南京医科大学 与特发性男性不育相关的***代谢小分子标志物及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANASTASIA DIAMANTOPOULOU ETAL: "Loss-of-function mutation in Mirta22/Emc10 rescues specific schizophrenia-related phenotypes in a mouse model of the 22q11.2 deletion", 《PNAS》 *
DAN WANG ETAL: "A new sperm-specific Na+/H+ Exchanger required for sperm motility and fertility", 《NATURE CELL BIOLOGY》 *
TAMARA JIMENEZ ETAL: "Na,K-ATPase α4 isoform is essential for sperm fertility", 《PNAS》 *
周幸来等主编: "《现在疑难病特色疗法丛书——男科疑难病症特色疗法》", 31 January 2006, 军事医学科学出版社 *
赵庆国: "GGNBP1和GGN2在小鼠睾丸中的表达及相互作用研究", 《解放军军事医学科学院（博士学位论文））》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998397B (zh) * 2017-12-07 2020-09-04 复旦大学附属华山医院 Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用
CN108707586A (zh) * 2018-06-19 2018-10-26 上海伦泽生物科技有限公司 抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体及其应用
CN108802372A (zh) * 2018-06-19 2018-11-13 上海伦泽生物科技有限公司 检测人血清中内质网膜蛋白复合体亚单位10的试剂盒
CN108845142A (zh) * 2018-06-19 2018-11-20 上海伦泽生物科技有限公司 Emc10蛋白检测物在制备肥胖症诊断和程度评估以及肥胖治疗效果评价产品中的应用
CN108802372B (zh) * 2018-06-19 2021-05-11 上海伦泽生物科技有限公司 检测人血清中内质网膜蛋白复合体亚单位10的试剂盒
CN108707586B (zh) * 2018-06-19 2022-03-15 上海伦泽生物科技有限公司 抗内质网膜蛋白复合体亚单位10的单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107998397B (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107998397A (zh) Emc10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用
Kashir et al. Oocyte activation, phospholipase C zeta and human infertility
Hamburgh Analysis of the postnatal developmental effects of “reeler,” a neurological mutation in mice. A study in developmental genetics
KANT et al. Cation-impermeable inside-out and right-side-out vesicles from human erythrocyte membranes
CN100381570C (zh) 滑膜细胞蛋白质
WO2010137547A1 (ja) 中枢神経細胞の増殖及び分化に係る中核因子を含む医薬組成物
Dutt et al. Versican V0 and V1 guide migratory neural crest cells
US8999714B2 (en) Mitochondrial enhancement of cells
Sells Animal experimentation in snake venom research and in vitro alternatives
CN105112448A (zh) Stch基因敲除动物模型的构建方法及应用
CN110833542A (zh) 褪黑素在制备用于改善***质量药物中的应用
Chen et al. Studies on the developmental potentiality of cultured cell nuclei of fish
Abdulsamad et al. The therapeutic and diagnostic potential of phospholipase C zeta, oocyte activation, and calcium in treating human infertility
Bonte et al. Unraveling the causes of failed fertilization after intracytoplasmic sperm injection due to oocyte activation deficiency
CN106929511B (zh) 一种hLeg1基因及其应用和药物
CN106456674A (zh) 转基因猪胰岛和其用于治疗糖尿病的用途
CN111066727B (zh) 在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法
CN106883294A (zh) 一种hLeg1蛋白及其应用和药物
CN106699867A (zh) 一种Leg1蛋白、Leg1基因及其在非人类中的应用
CN102321600B (zh) 一种修饰的β-分泌酶及其应用
Koana et al. Effects of the sex ratio organism on in vitro differentiation of Drosophila embryonic cells
Fujino et al. Generation and mutational analysis of a transgenic murine model of the human MAF mutation
KR101032335B1 (ko) 포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법
Kashir et al. The mammalian sperm factor phospholipase C zeta is critical for early embryo division and pregnancy in humans and mice
Jones et al. Do aluminium and/or glutamate induce Alz-50 reactivity? A light microscopic immunohistochemical study

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant