CN108841974A - 提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法 - Google Patents

提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，包括样本收集、16s‑rRNA基因测序、测序数据分析、肠道微生物成熟度及肠道菌龄计算、用户报告推送等过程。首次提出肠道微生物成熟度这一监测指标，肠道微生物成熟度是指婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物在构成上的相似性，成熟度越高，认为菌群发育越好，该指标可反应婴幼儿的免疫力水平，本发明经过实验研究和数据分析，在室温环境下，通过检测粪便样本16s rRNA V3‑V4高可变区的方法，实现婴幼儿肠道微生物的评估，其采样便捷、分析速度快、成本低，且评估结果与现有研究一致，使消费级肠道微生物检测成为可能。

Description

提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的 方法
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，具体为提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法。
背景技术
人类肠道微生物定植在肠道中，其数量超过人体自身细胞的10倍以上，对营养物质代谢、人体自身发育、免疫及疾病的产生等方面都起到极其重要的作用。对婴幼儿肠道微生物的研究发现，早期肠道微生物构成对后期肠道微生物的发育及个人健康至关重要，婴幼儿时期肠道微生物的破坏将导致哮喘、糖尿病、自闭症、哮喘等多种疾病产生。此外多篇研究报道，婴幼儿肠道微生物随着年龄的增长呈现非随机性的转变。通过利用16s rRNA测序技术全面分析人类粪便中肠道微生物样本，发现婴幼儿肠道微生物在0-3岁之间不断成长发育，最终其肠道微生物构成趋向于成人。Fredrik等人利用宏基因组鸟枪法测序技术分析粪便样本，发现与新生儿和4月龄婴儿相比，12月龄婴儿的长的肠道微生物与他们的妈妈更为相像。该研究还发现，不同生产方式（如刨妇产和顺产）和喂养方式（母乳喂养、配方奶粉喂养等）对婴幼儿肠道微生物发育有重要影响。Derrick等人从孕妇及她们4-6周龄婴儿身体的不同部位（肠道、口腔、鼻孔、皮肤和***）采集微生物样本，经过分析发现，新生儿不同身体部位的肠道微生物构成呈现很强的同源性。然而6周之后，微生物构成和功能呈现大幅度的扩增和多样性。这一现象表明，从婴儿出生到4到6周之间，婴儿微生物构成将出现发幅度变化，是微生物定植的重要时间段。
目前，肠道微生物检测方法主要有两种：16s rRNA 以及宏基因组。16s rRNA编码基因序列共有9个保守区和9个高可变区，通过对9个高可变区测序分析，可做细菌多样性分析以及代谢通路分析。宏基因组则将样本中所有微小生物的基因全部测序，测序数据经过拼接后，与参考菌群数据库比对并注释，进而进行细菌多样性分析及代谢通路分析。
本发明首次提出肠道微生物成熟度这一监测指标。肠道微生物成熟度是指婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物在构成上的相似性。成熟度越高，认为菌群发育越好，该指标可反应婴幼儿的免疫力水平。尽管肠道微生物对婴幼儿健康的影响和复杂疾病的发生已有诸多研究和文献报道，但绝大多数研究仍处在实验室层面，很难形成商业产品的转化。与实验室研究不同，商业产品需要解决用户在家便捷采样、样本稳定保存、缩短运输时间以及测序和数据分析时间及成本。其中，选择合适的肠道微生物检测方式就是挑战之一。虽然宏基因组检测方法可以捕捉到样本中所有可能存在的微生物，但是相比较16s rRNA来说，宏基因组物种注释信息仅在属水平上多于16s rRNA，而16s rRNA可在门、纲、目、科、属水平上获得更多信息。除此之外，宏基因组检测方法测序成本高、测序时间长、计算复杂等均导致该方法很难在商业中应用。
发明内容
本发明的目的在于提供提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，为兼顾成本和检测精度，在室温环境下通过检测16s rRNA V3-V4高可变区域分析婴幼儿肠道菌群构成，计算肠道微生物成熟度，以解决上述背景技术中提出在室温环境下，通过高通量二代测序检测粪便样本中16s rRNA，分析婴幼儿肠道菌群构成，并对肠道微生态成熟度进行持续监测，评估婴幼儿肠道微生物发育状况及身体免疫力情况的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，包括以下步骤：
S1：用户向公司申请项目检测；
S2：公司对用户信息进行审核，并向用户寄送样本检测器；
S3：用户收到样本检测器，进行粪便样本采集、样本绑定和问卷填写；
S4：用户将粪便样本快递寄回公司的样本检测中心；
S5：公司样本检测中心进行DNA提取，建立数据库；
S6：利用测序平台Illumima MiSeq测序仪进行V3-V4高变区测序；
S7：采用QIIME v1.7.0软件对16s rRNA原始下机数据进行分析；
S8：肠道微生物成熟度计算，并生成检测报告；
S9：将检测报告以电子版形式发送到用户手机端，便于查看报告。
优选的，样本收集包括2000对母子，共4000个粪便样本及对应的调查问卷，每个用户将收到公司寄出的粪便样本采集器，一个为宝宝准备，一个为母亲准备，此外需要用户扫描采集器上的二维码进行样本绑定以及调查问卷填写，整个样本的采集及运输均在常温下进行，无需使用冰盒及冷链运输。
优选的，所述步骤S5中DNA提取采用磁珠法DNA纯化技术。
优选的，所述步骤S7中具体方法包括：
S701：原始数据预处理：去除样本接头序列，并将双端测序序列拼接成单条序列，根据barcode序列区分不同样本序列，过滤低质量序列；
S702：OTU（操作分类单元）分类和统计：采用聚类方法，按照序列97%的相似性阈值将序列划分为不同OTU，每个OTU被视为一个微生物物种，并使用SILVA数据库进行物种注释，此外，对每个样本测序数量和OTU数目进行统计；
S703：多样性分析：分析每个样本的α多样性（chao1, observed species, Shannon多样性指数,Simpson多样性指数 ）；
S704：功能及代谢通路预测：采用宏基因组预测方法（Tax4Fun-r软件包）对16s rRNA进行功能性预测。
优选的，所述步骤S8中用婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物相似性代表成熟度指数（Jaccard相似性系数），具体计算公式如下：
Jaccard(A,B)表示肠道微生物成熟度，A 表示婴幼儿OTU数目，B 表示母亲OTU数目；根据2000例大样本数据，构建线性拟合模型，通过肠道微生物成熟度预测婴幼儿真实肠道菌龄：
Age表示婴幼儿肠道菌龄，x表示系数， Jaccard(A,B) 表示肠道微生物成熟度。
优选的，所述报告内容包括宝宝肠道年龄、成熟度指数、检测到的菌属以及每种菌属的丰度、有益菌有害菌含量及人群横向比较，益生菌含量及人群横向比较，重要菌属如何影响宝宝健康，蛋白质、脂质、碳水化合物代谢能力，以及根据报告给出的宝宝健康养育方案和饮食建议。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次提出肠道微生物成熟度这一监测指标，肠道微生物成熟度是指婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物在构成上的相似性，成熟度越高，认为菌群发育越好，该指标可反应婴幼儿的免疫力水平，本发明经过实验研究和数据分析，在室温环境下，通过检测粪便样本16s rRNA V3-V4高可变区的方法，实现婴幼儿肠道微生物的评估，其采样便捷、分析速度快、成本低，且评估结果与现有研究一致，使消费级肠道微生物检测成为可能。
附图说明
图1为本发明的采样流程及数据分析流程图；
图2为本发明的手机端电子报告图；
图3为本发明的婴幼儿年龄与肠道微生物成熟度的关系图；
图4为本发明的婴儿不同月龄组人群以及母亲组与4种α多样性之间的关系图；
图5为本发明的不同生产方式与肠道微生物成熟度以及4种α多样性之间的关系；
图6为本发明不同生产方式的两对母子肠道微生物数据进行比较关系图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明具体实施例中：参阅图1，
首先，样本收集；收集2000对母子，共4000个粪便样本及对应的调查问卷；每个用户将收到公司寄出的粪便样本采集器，一个为宝宝准备，一个为母亲准备，用户在家用提供的拭子沾取绿豆大小粪便装入含有保存液的采集管中，快递方式寄回样本中心，此外需要用户扫描采集器上的二维码进行样本绑定以及调查问卷填写，整个样本的采集及运输均在常温下进行，无需使用冰盒及冷链运输，调查问卷问题见表1：
表1：问卷数据
问卷问题 问题个数 详细描述
婴儿个人信息 5 性别、月龄、身高、体重、断奶年龄等
母亲个人信息 3 年龄、居住城市、怀孕周期等
生产方式 1 剖腹产、顺产
喂养方式 6 母乳喂养、配方奶粉喂养、混合喂养（奶粉+母乳）、桌餐、桌餐食物种类、是否喝酸奶等
健康状况 13 哮喘、鼻炎、过敏、炎症性肠炎、流感、腹泻、消化不良、贫血等
用药情况 7 抗生素、感冒药、金双歧、妈咪爱、思密达、感冒药等
生活环境 3 居住人群、是否有兄弟姐妹、卫生习惯
粪便特征 4 排便次数、大便颜色、大便性状等。
步骤二：16s-rRNA 基因测序；粪便中细菌DNA提取采用磁珠法DNA纯化技术；测序片段：V3-V4高变区，测序平台Illumima MiSeq测序仪；
步骤三：测序数据分析：16s rRNA原始下机数据采用QIIME v1.7.0软件进行分析：包括：
（1）原始数据预处理：去除样本接头序列，并将双端测序序列拼接成单条序列，根据barcode序列区分不同样本序列，过滤低质量序列；
（2）OTU（操作分类单元）分类和统计：采用聚类方法，按照序列97%的相似性阈值将序列划分为不同OTU，每个OTU被视为一个微生物物种，并使用SILVA数据库进行物种注释，此外，对每个样本测序数量和OTU数目进行统计；
（3）多样性分析：分析每个样本的α多样性（chao1, observed species, Shannon多样性指数,Simpson多样性指数 ）；
（4）功能及代谢通路预测：采用宏基因组预测方法（Tax4Fun-r软件包）对16s rRNA进行功能性预测；
步骤四：肠道微生物成熟度及肠道菌龄计算：用婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物相似性代表成熟度指数（Jaccard相似性系数），具体计算公式如下：
Jaccard(A,B)表示肠道微生物成熟度，A 表示婴幼儿OTU数目，B 表示母亲OTU数目；根据2000例大样本数据，构建线性拟合模型，通过肠道微生物成熟度预测婴幼儿真实肠道菌龄：
Age表示婴幼儿肠道菌龄，x表示系数， Jaccard(A,B) 表示肠道微生物成熟度；
步骤五：用户报告推送：16s rRNA测序分析完成之后，整合分析问卷数据、母亲肠道微生物数据以及孩子肠道微生物数据，即可生成报告；检测报告将推送至母亲手机APP，用户可在手机端查看报告；报告内容包括宝宝肠道年龄，成熟度指数，检测到的菌属以及每种菌属的丰度，有益菌有害菌含量及人群横向比较，益生菌含量及人群横向比较，重要菌属如何影响宝宝健康，蛋白质、脂质、碳水化合物代谢能力，以及根据报告给出的宝宝健康养育方案和饮食建议；部分报告展示见图2；
综上：发明结果总结：
（1）肠道微生物成熟度与月龄关系：通过对2000例不同月龄婴幼儿肠道微生物成熟度分析，结果表明，肠道微生物成熟度随着年龄的增长不断增长，且在0-12个月龄增长快速，12个月龄以后增长逐渐变缓，最终趋于平滑，具体结果见图3（其中横坐标表示婴幼儿月龄，纵坐标表示肠道微生物成熟度）；
对对2000对母子肠道微生物α多样性分析，发现4种α多样性指数随着婴幼儿年龄增长而增长，并逐渐靠近母亲肠道微生物的α多样性；具体结果见图4（横坐标表示五组人群，分别为婴幼儿0-3月龄、4-8月龄、9-12月龄、13-37月龄以及母亲，纵坐标表示4个不同α多样性指数）；
（2）为了确定生产方式是否显著影响肠道微生物，选区0-3月龄样本进行分析协方差分析；样本中26.32%为剖腹产，73.68%为顺产；结果表明，不同生产方式显著影响肠道微生物成熟度指标（p=0.04），剖腹产婴儿的肠道微生物成熟度均值为0.27，比顺产婴儿低0.04，但这个现像在其他四类α多样性指标中并未体现；具体结果见图5（横坐标表示不同生产方式（C-section:剖腹产，Vaginally born：顺产），A图纵坐标表示肠道微生物成熟度，BCDE图分别表示4类α多样性指数）；
（3）两对母子肠道微生物数据比较：选取不同生产方式的两对母子肠道微生物数据进行比较（见图6）；宝宝实际月龄均为2月龄，其中一个是剖腹产生产（图6-B），其肠道微生物成熟度为0.25；另外一个是顺产生产（图6-A），其肠道微生物成熟度为0.38，两个宝宝在该指标上呈现显著差异；图6中间圆圈表示肠道微生物属层面的分类，4个样本菌属并集个数为130个；红色柱状图表示婴儿在该菌属上的丰度，蓝色柱状图表示母亲在该菌属上的丰度；两组样本横向比较，很显然顺产宝宝比剖腹产宝宝的菌属数目要更多一些；最外层圆圈不同颜色表示细菌不同门层面的信息，其中所有样本占比最大的是厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），这与其他文献报道一致。
此外，我们展示了4个样本丰度排名最靠前的5个菌属，结果表明，无论是剖腹产还是顺产，宝宝菌属丰度最大的是双歧杆菌属，但是顺产宝宝双歧杆菌属丰度为75.26%，剖腹产宝宝则为44.10%，远小于顺产。双歧杆菌作为婴幼儿肠道重要的菌属，起着抗过敏、抗感染、调整肠道功能、改善营养、提升免疫力等重要作用。而剖腹产宝宝双歧杆菌过低，表明其身体免疫力以及肠道健康要比顺产宝宝低很多，这与现阶段文献研究一致，说明本发明可以很好地监测宝宝免疫力水平。
综上所述：本发明首次提出肠道微生物成熟度这一监测指标，肠道微生物成熟度是指婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物在构成上的相似性，成熟度越高，认为菌群发育越好，该指标可反应婴幼儿的免疫力水平，目前对婴幼儿肠道微生物评估多局限于菌属丰度、有益菌含量、有害菌含量等多维度指标，从不同方向对肠道菌群进行评估，尚无一个能够代表和概括性的，且可持续检测和度量的指标来反应婴幼儿肠道菌群发育和身体免疫力水平，经过实验研究和数据分析，本发明首次提出肠道微生物成熟度检测指标，在室温环境下，通过检测粪便样本16s rRNA V3-V4高可变区的方法，实现婴幼儿肠道微生物的评估，其采样便捷、分析速度快、成本低，且评估结果与现有研究一致，使消费级肠道微生物检测成为可能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用户向公司申请项目检测；
S2：公司对用户信息进行审核，并向用户寄送样本检测器；
S3：用户收到样本检测器，进行粪便样本采集、样本绑定和问卷填写；
S4：用户将粪便样本快递寄回公司的样本检测中心；
S5：公司样本检测中心进行DNA提取，建立数据库；
S6：利用测序平台Illumima MiSeq测序仪进行V3-V4高变区测序；
S7：采用QIIME v1.7.0软件对16s rRNA原始下机数据进行分析；
S8：肠道微生物成熟度计算，并生成检测报告；
S9：将检测报告以电子版形式发送到用户手机端，便于查看报告。
2.如权利要求1所述的提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，样本收集包括2000对母子，共4000个粪便样本及对应的调查问卷，每个用户将收到公司寄出的粪便样本采集器，一个为宝宝准备，一个为母亲准备，此外需要用户扫描采集器上的二维码进行样本绑定以及调查问卷填写，整个样本的采集及运输均在常温下进行，无需使用冰盒及冷链运输。
3.如权利要求1所述的提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，所述步骤S5中DNA提取采用磁珠法DNA纯化技术。
4.如权利要求1所述的提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，所述步骤S7中具体方法包括：
S701：原始数据预处理：去除样本接头序列，并将双端测序序列拼接成单条序列，根据barcode序列区分不同样本序列，过滤低质量序列；
S702：OTU（操作分类单元）分类和统计：采用聚类方法，按照序列97%的相似性阈值将序列划分为不同OTU，每个OTU被视为一个微生物物种，并使用SILVA数据库进行物种注释，此外，对每个样本测序数量和OTU数目进行统计；
S703：多样性分析：分析每个样本的α多样性（chao1, observed species, Shannon多样性指数,Simpson多样性指数 ）；
S704：功能及代谢通路预测：采用宏基因组预测方法（Tax4Fun-r软件包）对16s rRNA进行功能性预测。
5.如权利要求1所述的提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，所述步骤S8中用婴幼儿肠道微生物与其母亲肠道微生物相似性代表成熟度指数（Jaccard相似性系数），具体计算公式如下：
Jaccard(A,B)表示肠道微生物成熟度，A 表示婴幼儿OTU数目，B 表示母亲OTU数目；根据2000例大样本数据，构建线性拟合模型，通过肠道微生物成熟度预测婴幼儿真实肠道菌龄：
Age表示婴幼儿肠道菌龄，x表示系数， Jaccard(A,B) 表示肠道微生物成熟度。
6.如权利要求1所述的提取粪便样本16s rRNA在婴幼儿肠道微生态成熟度监测的方法，其特征在于，所述报告内容包括宝宝肠道年龄、成熟度指数、检测到的菌属以及每种菌属的丰度、有益菌有害菌含量及人群横向比较，益生菌含量及人群横向比较，重要菌属如何影响宝宝健康，蛋白质、脂质、碳水化合物代谢能力，以及根据报告给出的宝宝健康养育方案和饮食建议。
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