CN102770154B - 与分泌者血型状态相符的益生双歧杆菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。本发明还涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。

Description

与分泌者血型状态相符的益生双歧杆菌组合物
技术领域
本发明涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。本发明还涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。此外，本发明涉及益菌素(prebiotic)、分子化合物或额外的支持性细菌菌株用于扩大肠内双歧杆菌的生长和/或功能性的应用。本发明还涉及个体的分泌者状态作为补充富含双歧杆菌的益生菌的标准的应用。本发明还涉及通过确定个体的分泌状态来评估该个体对补充富含双歧杆菌的益生菌的需求的方法。另外，本发明涉及用于治疗和/或预防诸如炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或遗传性过敏症或过敏症等疾病的益生菌组合物。
背景技术
双歧杆菌构成婴儿的主要肠内微生物丛，而它们在成人群体中也很丰富，构成正常肠内微生物丛的最多10%，但其数量在老年人中开始下降。每个个体中通常寄居有1～4种双歧杆菌物种(M等，JApplMicrobiol2004;98:459-470)。除了个体间差异外，双岐杆菌物种的组成在不同年龄群中也有所不同。长双歧杆菌婴儿生物变体、短双歧杆菌以及两歧双歧杆菌是婴儿中最普遍的物种，而长双歧杆菌长生物变体、青春双歧杆菌、两歧双岐杆菌和链状双岐杆菌是成人中最普遍的物种。此外还报导了双岐杆菌的数量(Mueller等，ApplEnvironMicrobiol2006;72:1027-1033)和物种组成(M等，2004)在各地理区域间的变化。通常认为，双歧杆菌是促进健康的细菌，通常使用肠中双歧杆菌的数量增加来作为使用以肠健康为目的的产品(例如益生菌和益菌素)的干预性研究的终点。
双岐杆菌属的菌株被用作益生菌。然而，由于该属的稳定性方面的技术难题，目前市面上仅能获取到很少的特殊物种和菌株，主要为动物双歧杆菌乳亚种。双岐杆菌或含有双岐杆菌的菌株混合物在例如减轻以下病症的症状方面已显示出很有前景的结果：肠易激综合征(Brenner和Chey，RevGastroenterolDisord.2009;9:7-15)、炎性肠病(Macfarlane等，CritRevClinLabSci.2009;46:25-54)、腹泻(Chouraqui等，JPediatrGastroenterolNutr.2004;38:242-3)、特应性湿疹(Yoo等，ProcAmThoracSoc2007;4:277-282)和感冒(deVrese等，ClinNutr.2005;24:479-480)。除了上述的稳定性问题外，另一个难题是下述事实：一部分研究受试对象通常对测试益生菌或益菌素无应答(Fuccio等，JClinGastroenterol2009;43:506-513；Fuimori等，J.GastroenterolHepatol2007;22:1199-1204)。这些个体通常被称作“非应答者”。非应答性背后的原因尚不知晓。
双歧杆菌的主要拓殖部位是结肠，但其也存在于口腔中；而且，已从人乳中分离出双岐杆菌(Martin等，ApplEnvironMicrobiol.2009,75:965-969)。双岐杆菌的主要能量源是不可消化的食用糖和内源性粘液。双歧杆菌能够降解作为底物的包括人乳寡糖在内的各种寡糖以及存在于粘液中的复合糖。已显示数种双歧杆菌粘附于肠粘液(He等，MicrobiolImmunol2001,45,259-262)。据显示，通过补充岩藻糖可增强两歧双歧杆菌与粘液的粘附(Guglielmetti等，CurrMicrobiol.2009;59:167-172)。哺乳动物(包括人)肠中的大量多样的微生物株和物种，以及证明了肠中微生物物种组成并不会直接预示其功能性效果的发现，已表明难以预测单一益生菌或正常菌群物种的功能(Tap等，EnvironmMicrobiol2009,11,2574-2584)。生态***的复杂性实在过高。对宿主遗传因素在决定正常肠微生物丛组成中的作用也知之甚少。
已报道了细菌和病毒的某种单一病原性物种与血型抗原的结合。特别而言，幽门螺杆菌与胃中的Lewisb(Leb)抗原结合(Boren等，Science1993;262:1892-1895)，诺洛病毒(Norovirus)与ABHjaLeb抗原结合(Huang等，JVirol.2005;79:6714-6722)。肺炎链球菌能够结合A和B血型抗原并利用聚糖(Higgins等，JMolBiol.2009;388:299-309)。
血型抗原并不存在于所有个体的粘液中。这些据称具有“非分泌者”血型的个体不具有在合成分泌血型抗原时所需的功能性FUT2基因(Henry等，VoxSang1995;69(3):166-182)，因此并不分泌分泌物中和粘膜上的ABH抗原。而具有血型“分泌者”的那些个体则具有粘膜上的抗原。在多数群体中，非分泌者个体的频率远低于分泌者状态的频率，约15%～26%的斯堪的纳维亚人属于非分泌者类别(Eriksson等，AnnHumBiol.1986;13(3):273-85)。可以将分泌者/非分泌者状态看成是正常血型***，且能够用标准血液采集操作规程(Henry等，1995)来确定该表型。已鉴定出了如下基因型：在欧洲人群体中引起非分泌者(NSS)表型的FUT2基因大突变(Silva等，Glycoconj2010;27:61-8)。已表明非分泌者表型在遗传上与下述现象相关：例如，克罗恩氏病风险增加(McGovern等，HumMolecGenet2010;19:3468-76)，血液中的高维生素B12水平(Tanaka等，AmJHumGenet2009;84:477-482)，对HIV病毒感染的易感性(Ali等，JInfectDis2000;181:737-739)，实验性***念珠菌病(Hurd和DominoInfectionImmunit2004;72:4279-4281)，哮喘风险增加(Ronchetti等，EurRespirJ2001;17:1236-1238)，泌尿道感染风险增加(Sheinfeld等，NEnglJMed1989;320:773-777)，ETEC引起的腹泻的风险增加(Ahmed等，InfectImmun.2009;77:2059-2064)，和动物出血性疾病病毒(Guillon等，Glycobiology2009;19:21-28)。
发明内容
本发明的目的涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。本发明的另一个目的涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。此外，本发明的一个目的是益菌素、分子化合物或额外的支持性细菌菌株用于提高所述微生物组合物或益生菌组合物在肠内的数量和/或扩大其在肠内的生长和/或功能性的应用。
本发明的又一个目的是个体的分泌者血型状态作为补充富含双歧杆菌的益生菌的标准的应用。本发明的再一个目的涉及通过确定个体的分泌状态来评估该个体对补充富含双歧杆菌的益生菌的需求的方法。
本发明的又一目的是个体的分泌者血型状态在估算得到想要的效果所需的双歧杆菌补充剂量中的应用。本发明的再一个目的是提供通过确定个体的分泌状态来鉴定该个体具有罹患胃肠病症的风险的方法。
本发明的其他目的是用于治疗和/或预防诸如炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或遗传性过敏症/过敏症等疾病的益生菌组合物。据认为，这些疾病或病症与个体中不平衡的粘膜微生物丛有关。
本发明是基于以下观察做出的：与具有分泌者表型的个体相比，具有非分泌者血型表型的个体的肠内细菌种群中的双歧杆菌的量和多样性均有所减少。此外，本发明还基于以下观察：非分泌者个体的双歧杆菌种群显示出变化了的功能性，例如，在上胃肠道环境的严酷条件中存活率降低。可以将这些观察用作对个体中特别是非分泌者个体中的双歧杆菌肠内种群进行靶向调节的基础，从而得到更高多样性和/或更多量的双歧杆菌物种或菌株。换言之，所述调节的目的在于使非分泌者的双歧杆菌的多样性和/或量与分泌者个体中通常所见的多样性和/或量相似。因此，本发明提供一种用于优化益生菌组合物中的细菌尤其是双岐杆菌的含量的新颖且有效的方法。这种组合物在用于非分泌者血型表型个体中时特别有效。
本发明的目的是通过独立权利要求中所述的方法和应用来实现的。从属权利要求中描述了本发明的优选实施方式。
本发明的其他目的、细节和优点将从以下附图、详细说明和实施例中变得明显。
附图说明
图1显示了7个非分泌者个体和7个分泌者个体的粪便样品中的双歧杆菌多样性的DGGE凝胶图像。M=标记物。每条泳道表示单一样品。
图2图示了基于对双歧杆菌信息的DGGE分析的三维PCA图。
图3图示了显示出DGGE条带位置的双歧杆菌DGGE信息的PCA双标图，所述条带位置对第一和第二主成分的贡献最大，第一和第二主成分一起解释了方差的56.3%。***图示出了条带位置，其对主成分的贡献最大。点表示非分泌者样品，星表示非分泌者样品，方块则表示分泌者状态未知的样品。
图4图示了分泌者个体和非分泌者个体之间的基于双歧杆菌DGGE信息检验的香农(Shannon)多样性指数。显示了非分泌者个体和分泌者个体之间的P值和t检验。
图5图示了根据对序列的Blast搜索得到的双歧杆菌DGGE凝胶的条带位置的身份。用数字标注了已切出且经测序的条带。粗体字显示了条带位置，其在非分泌者中要么缺失要么很少检出。条带位置的身份用箭头示于凝胶旁边，数字的颜色表示了属于同一条带位置且具有相同序列的条带：条带位置26.6%(青春双歧杆菌)包括经测序的条带15、24、27和29；条带位置29.7%(两歧双岐杆菌)包括经测序的条带6、16、20和32；条带位置53.5%(长双歧杆菌)包括经测序的条带1、3、7、9、12、21和33；条带位置55.0%(双歧杆菌物种)包括经测序的条带4和18；条带位置62.2%(未经培养的双歧杆菌)包括经测序的条带1、5、13、19、25、31和37；条带位置63.7%(链状/假链状双歧杆菌)包括经测序的条带22和34。基于单一序列的条带位置的身份如下(黑色)：8=双歧杆菌物种(链状双歧杆菌)，11=青春双歧杆菌，17=未经培养的双歧杆菌(反刍双歧杆菌)，30=未经培养的双歧杆菌(青春双歧杆菌)，36=未经培养的双歧杆菌(反刍双歧杆菌)。括号中的菌株名称表示与所示序列的亲缘关系最接近的可培养菌株(如果存在)。
图6显示了非分泌者个体、分泌者个体和分泌者状态未知的个体的归一化后的DGGE信息图。灰色框中的数字和垂直线表示条带位置，垂直线上的星形符号表示被分级划入这些条带位置的条带。
图7图示了双歧杆菌DGGE信息的PCA图，其显示了对来自非分泌者个体(n=14)和分泌者个体(n=57)的样品的聚类(左)以及对第一和第二主成分贡献最大的DGGE条带(右)。来自非分泌者个体的样品在分泌者样品中形成了独立的聚类(由圆圈表示)。
图8图示了非分泌者个体和分泌者个体中的双歧杆菌的多样性(A)和丰度(B)。表明了使用ANOVA测得的非分泌者个体和分泌者个体之间的显著差异。该分析排除了未发生双歧杆菌扩增的样品(1个非分泌者个体和6个分泌者个体)。
图9图示了用qPCR定量的非分泌者个体(14)和分泌者个体(57)中的细菌、双歧杆菌和双歧杆菌群的检出频率(左)和箱线图(右)。表明了Wilcoxon检验中非分泌者和分泌者之间的显著差异。
具体实施方式
由于双歧杆菌构成婴儿的主要肠内微生物丛，并且在成人群体中也很丰富，因此认为双歧杆菌对保持和/或促进个体的健康而言必不可少。肠中高度的双歧杆菌多样性对个体健康是有益的，这是因为双歧杆菌能够例如防止有害微生物粘附在肠上皮上并防止这些微生物在肠中拓殖。其还可以调节宿主的免疫应答。
本发明基于以下发现：非分泌者个体的肠内细菌种群中的双歧杆菌的多样性有所减少并且缺乏若干种双歧杆菌物种/基因型。此外，本发明还基于以下发现：非分泌者个体的双歧杆菌种群具有变化了的功能性，例如，在上胃肠道条件下的存活率。可以用这些发现来作为使用富含存在于分泌者个体中的物种/基因型的益生菌组合物来对非分泌者个体的双歧杆菌种群进行目的性调节的基础，以及作为补充富含双歧杆菌的益生菌的标准。另外，可以将这些发现用于设计用来治疗和/或预防诸如炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或遗传性过敏症/过敏症等疾病或它们的症状的益生菌组合物。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种可选方法，用来检测不同细菌基因型在谱或丰度上的差异。在该方法中，设计了特异性PCR引物，从而使得在每个实验设定中仅对所需的细菌群进行分析。条带位置差异和/或条带的出现和/或强度上的差异表示了粪便样品间在细菌组成上的差异。经PCR扩增的片段的碱基组成决定了该片段在变性梯度凝胶中的解链情况，并由此决定了该片段在变性梯度凝胶中的迁移率。该片段在凝胶中的最终位置因此由该片段的DNA序列、所施加的变性梯度和电泳运行条件来具体确定。实施例中描述了本发明中所用的针对细菌群的凝胶优化运行条件和变性梯度。使用标准样来归一化每种片段在不同的凝胶运行之间的位置(即“条带位置”)。条带位置以相对于凝胶长度的方式来表示，顶部为0%，底部边缘为100%。
根据本发明，术语DGGE基因型和细菌基因型指的是在有关DGGE分析中具有相同的“条带位置”的那些菌株。可以将每种基因型或一组亲缘关系接近的基因型呈现为一个“条带位置”。在本发明中，当用上述方法进行分析时，每个条带位置是指给定%值的条带位置±1%单位，即25.30%是指24.30%和26.30%之间的任何值。应注意的是，根据确切的条件，名义%值可以变化；重要的是条带相对于有关标准样的位置。表1中列出了经发现在分泌者个体中存在且在非分泌者个体中确实或至少不常见的双歧杆菌DGGE基因型。条带位置详见图6。
表1.经发现在分泌者个体中存在而在非分泌者个体中缺失或至少不常见的双歧杆菌基因型
下表2中列出了至少在一个非分泌者个体中存在的双歧杆菌DGGE基因型。条带位置详见图6。
表2.经发现至少在一个非分泌者个体中存在的双歧杆菌基因型
根据DGGE基因型和分离出的菌株，本发明人能够鉴定出非分泌者个体和分泌者个体中更详细的双歧杆菌组成，即，鉴定出物种和诊断性16SrRNA核苷酸序列的条带位置。简言之，本发明人从显示粪便样品信息的DGGE凝胶中切出条带位置，对条带中的DNA片段进行测序，并在序列数据库中为它们寻找亲缘关系最接近者。此外，为了筛选出与所观察到的粪便样品的DGGE条带具有相似的16SrRNA基因片段解链行为(即，序列)的菌株，在DGGE中对从非分泌者个体和分泌者个体的粪便样品中分离出的菌株进行了分析。根据DGGE条带中的序列和具有对应条带的双歧杆菌菌株，将条带并进一步将条带位置与双歧杆菌物种关联起来。表3和表4分别示出了在非分泌者个体中和仅在分泌者个体中检测到的基因型的双歧杆菌物种和诊断性16SrRNA片段序列。
下表3中列出了经发现至少在一个非分泌者个体中存在的双歧杆菌菌株。
表3.经发现至少在一个非分泌者个体中存在的双歧杆菌菌株
表4中列出了经发现在分泌者个体中存在而在非分泌者个体中缺失的双歧杆菌菌株。
表4.经发现在分泌者个体中存在而在非分泌者个体中缺失的双歧杆菌菌株
本文中的术语“益生菌”是指具有健康支持效果的任何细菌物种、菌株或其组合，并不限于目前被接受的菌株或肠内效果。本文中的术语“益菌素”是指作为单一添加剂或作为混合物与益生菌一起或不与益生菌一起添加的任何化合物、营养物或额外微生物，从而增强所需的益生菌健康效果或刺激消化***中被认为对身体健康有益的细菌的生长和活性。
本发明涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体的肠内不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。在一个实施方式中，所述微生物组合物或益生菌组合物包含至少一种表4所列的菌株。在另一个实施方式中，所述益生菌组合物包含两种以上表4所列的菌株。因此，本发明的可选实施方式是包含例如三种或四种表4所列的菌株的益生菌组合物。在又一个实施方式中，所述益生菌组合物包含两歧双歧杆菌和一种以上表4所列的菌株。因此，本发明的可选实施方式是包含两歧双歧杆菌和例如两种或三种表4所列的菌株的益生菌组合物。
在另一个实施方式中，本发明的微生物组合物或益生菌组合物包含至少一种表1所列的菌株。在再一个实施方式中，所述益生菌组合物包含两种以上表1所列的菌株。因此，本发明的可选实施方式是包含例如三种、四种或五种表1所列的菌株的益生菌组合物。在另一个实施方式中，所述益生菌组合物包含两歧双歧杆菌和一种以上表1所列的菌株。因此，本发明的可选实施方式是包含两歧双歧杆菌和例如两种、三种或四种表1所列的菌株的益生菌组合物。
在本发明中，短语“在非分泌者个体中不常见的双歧杆菌基因型”是指通常不在非分泌者个体的肠内拓殖和/或通常不会在非分泌者个体的肠内发现的双歧杆菌物种或菌株。在本发明中，术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10%，例如5%～10%。
本发明还涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不存在的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。
本发明的微生物组合物或益生菌组合物和包含该组合物的益生菌补充剂在用于但不限于提高非分泌者个体的肠内双歧杆菌多样性时特别适合和有效。在本发明的一个实施方式中，含双歧杆菌的补充剂还额外包含针对双歧杆菌菌株的生长刺激或粘附而优化的至少一种益菌素。该发明基于以下原理：由于发现非分泌者的双岐杆菌多样性有所减少，即，其缺乏某些物种，因此该补充剂特别富含在非分泌者中缺乏但在分泌者中存在的那些物种。据已报道，非分泌者状态和较低的双岐杆菌多样性使对某些疾病的易感性升高(Blackwell,FEMSMicrobiologyImmunology1989;47:341-350)，本发明中所定义的补充剂导致的多样性增加将具有对宿主而言想要的效果。因此，平衡且多样的有益双歧杆菌种群对非分泌者特别重要。
在本发明的一个实施方式中，为非分泌者型婴儿定制了益生菌组合物或包含该组合物的补充剂。
本发明还涉及用于治疗和/或预防炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或遗传性过敏症/过敏症的益生菌组合物。
在一个实施方式中，本发明涉及用于预防和/或治疗炎性肠病(IBD)或其症状的益生菌组合物。IBD对于本发明是良好的靶标疾病，这是因为，不仅其患者具有变化的微生物丛组成(Sokol等，InflammBowelDis.2006;12:106-11)已被报道，还已知含有双歧杆菌益生菌组合物具有治疗潜力(Macfarlane等，ClinRevClinLabSci2009,46,25-54)。此外，已确定非分泌者表型(即FUT2基因缺陷)带来对IBD的遗传易感性(McGovern等，HumMolecGenet2010;19:3468-3476)。因此，可合理认为本发明的组合物在IBD中特别有效，因为该组合物的目的在于将非分泌者个体的双歧杆菌组成向分泌者个体中常见的双歧杆菌组成调节。治疗的目的可以是缓解IBD症状、预防IBD复发和/或提高患IBD时的整体生活质量。其还可与其他目前已知的针对IBD的药物一起施用。一个实施方式中的组合物的针对具有非分泌者表型的那些IBD患者。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于预防和/或治疗微生物感染(即腹泻和呼吸道感染)的益生菌组合物，还涉及含双歧杆菌的益生菌在这些适应证中的治疗潜力(Chouraqui等，JPediatrGastroenterolNutr.2004;38:242-243；deVrese等，ClinNutr.2005;24:479-480)；在非分泌者个体中的升高的频率已有所描述(Ahmed等，InfectImmun.2009;77:2059-64；Raza等，BMJ.1991,303:815-818)。在一个实施方式中，由于已描述了IBS中的双歧杆菌水平下降(M等，FEMSImmunolMedMicrobiol.2005;43:213-222)和含双歧杆菌的益生菌产品的潜力(Kajander等，AlimentPharmacolTher.2008;27:48-57)，本发明涉及用于预防和/或治疗肠易激综合征(IBS)的益生菌组合物。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于预防和/或治疗儿童中的过敏症和/或遗传性过敏症的益生菌组合物。已确定，发展出过敏症的婴儿在生命第一年期间其肠道内的双歧杆菌水平降低(等，JAllergyClinImmunol.2001;108:516-520)。此外已显示，在乳汁中检测到了双歧杆菌，而且过敏母亲的乳汁中的双歧杆菌物种组成与非过敏母亲的不同(等，ClinExpAllergy.2007;37:1764-1772)。含双歧杆菌的产品已在预防特应性湿疹方面显示出潜力(Yoo等，ProcAmThoracSoc2007;4,277-282)。
在另一个实施方式中，为其母乳喂养母亲为非分泌者血型类型的婴儿定制了益生菌组合物或包含该组合物的补充剂，而不论该婴儿的分泌者表型。可以将益生菌组合物或包含该组合物的补充剂用来增强平衡的肠内微生物丛组成的发展。具有非分泌者母亲的婴儿更容易受到感染，因为母亲的乳汁不含岩藻糖基化聚糖，而岩藻糖基化聚糖因其结合病原体而具有重要的保护作用。可以将作为益菌素的岩藻糖基化聚糖与或不与本发明的双歧杆菌补充剂一起补充到具有非分泌者母亲的婴儿的饮食中。向本发明的组合物中添加益菌素的目的是：帮助添加到组合物中但在个体中不常见的那些双歧杆菌物种存活，从而进一步增强益生菌组合物的功效。常见的益菌素成分是在口腔-胃肠道的上部中不可消化的寡糖/多糖。这些寡糖包括但不限于寡聚果糖或菊糖、寡聚半乳糖、大豆寡糖、抗性淀粉和聚葡萄糖。据显示特别适合于双歧杆菌的实例是乳-N-二糖I(lacto-N-bioseI)(Kiyohara等，BiosciBiotechnolBioChem2009;73:1175-1179)。益菌素通常是从天然来源(例如菊苣根或乳汁)加工制得的，作为另一选择，其也可以化学合成。达到益菌素效果所需的每日剂量通常是每日数克，但可以有很大不同。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及以老年个体为目标的益生菌组合物，用于支持益生菌多样性和丰度的保持。
如上设计出的益生菌组合物和补充剂对人的健康和/或幸福可以具有有益效果，并且可以是例如食品、胶囊、片剂或粉末形式。可以将所述组合物配制成乳品工业或饮料工业的产品、功能食品或营养补充剂以及胶囊、乳液或粉末。
常见的益生菌成分是每克通常含有1010～1012个活的益生细菌细胞的冻干粉末。此外，其通常包含冻干载体，例如脱脂奶、短链糖(诸如蔗糖或海藻糖等寡糖)。作为另一选择，可以使用例如海藻酸盐、淀粉、黄原胶作为载体来封装培养制备物。常见的益生菌补充剂或胶囊制备物在每个胶囊中包含约109～1011活的益生细菌细胞，所述益生细菌为单一菌株或多菌株组合。
常见的益生菌食品(其可以是发酵乳产品、基于发酵乳的产品或果汁等等)的每日剂量包含约109～1011个活的益生细菌细胞。益生菌作为益生菌成分(冷冻团粒或冻干粉末)混入产品中，或在发酵过程中在产品(例如酸奶酪、凝乳和/或酸乳中)培养。
含双歧杆菌的组合物或补充剂还可选地包含为了刺激所选的双歧杆菌菌株生长而优化的至少一种益菌素。
本发明还提供定制和/或优化或者加强带有根据本发明选出的至少一种双歧杆菌菌株的已有益生菌产品和/或共生产品的方法，从而提高该产品在非分泌者中应答性和/或效果。
本发明还涉及个体的分泌者状态在评估对补充富含双歧杆菌的益生菌的需求中的应用。本发明还涉及通过确定个体的分泌者状态来评估该个体对补充富含双歧杆菌的益生菌的需求的方法。
本发明还涉及个体的分泌者状态在估算得到想要的效果所需的双歧杆菌补充剂量中的应用。通常，具有非分泌者表型的个体应当比具有分泌者表型的个体需要更高剂量的益生菌。
本发明还涉及通过确定个体的分泌者状态来鉴定所述个体具有罹患胃肠病症的风险的方法。该状态可以使用标准血型确定方法从例如唾液样品确定，或通过确定FUT2基因的足够突变来从个体的基因组DNA确定(Silva等，GlycoconjugateJournal2010;27:61-68)。
已观察到，在微生物丛受到严重干扰后，肠内细菌种群尤其是双歧杆菌种群的稳定化被推迟了(M等，2008)。因此，本发明提供个体的分泌者状态和双歧杆菌物种多样性在追踪上述剧烈干扰后的微生物丛稳定化中的应用。
本发明的结果表明，非分泌者的肠内双歧杆菌多样性比分泌者个体的更低。在双歧杆菌菌株中，有些菌株在非分泌者的肠内更常见。非分泌者缺乏或者携带有数量很少或不可检测的几种双歧杆菌基因型(例如菌株青春双歧杆菌和链状/假链状双歧杆菌的基因型)，而这几种双歧杆菌基因型常见于分泌者中(表4)。此外，在非分泌者中两歧双歧杆菌以及某些青春双歧杆菌和链状/假链状双歧杆菌基因型比在分泌者个体中更稀少(表3和表6)。在最频繁检出的双歧杆菌菌株中，仅有长双歧杆菌在分泌者个体和非分泌者个体中一样常见。因此，一些双歧杆菌存在于几乎所有人的胃肠道中，但非分泌者缺乏这些双歧杆菌菌株中的一些或许多，即，所有人都有一些相同的双歧杆菌物种，但非分泌者缺乏在分泌者中常见的很多双歧杆菌物种。基于这些发现，本发明的益生菌组合物和/或补充剂特别包含在具有分泌者表型的个体中丰度高的那些双歧杆菌物种或菌株。
现将通过以下实施例对本发明进行更详细地描述。不应将这些实施例解读为以任何方式限制权利要求。
实施例
材料和方法
此处描述的材料和方法在实施例1～7中相同。
本研究招募了59位健康成人志愿者(52位女性和7位男性)。采集了这59位志愿者的粪便样品和血样。这些志愿者的年龄为31～61岁，平均45岁。在排便后5小时内将粪便样品冷冻。使用SPIN土壤用试剂盒(Qbiogene)从0.3g粪便物中提取出DNA。用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC(Satokari等，ApplEnvironmMicrobiol2001,67,504-513)对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增。用寄居在人肠道的最常见的双歧杆菌菌株(青春双歧杆菌E-981074、两歧双歧杆菌E-97795、乳双歧杆菌E-97847、长双歧杆菌E-96666、角双歧杆菌DSM20098和链状双歧杆菌DSM16992)和代表常见人肠道细菌的43种其他细菌菌株来检验上述引物的特异性。用45%～60%的变性梯度，在8%DGGE凝胶中分离经扩增的PCR片段。在70V使DGGE凝胶电泳进行960分钟。用SYRBSafe对DGGE凝胶染色30分钟，并且用SafeImagerBluelight表(Invitrogen)和AplhaImagerHP(Kodak)成像***记录结果。
将数字化的DGGE凝胶图像导入Bionumerics程序v5.0(AppliedMaths)以进行归一化和条带检测。用从双歧杆菌菌株构建的标记物样品对条带进行归一化。用Bionumerics所提供的工具执行了条带搜索和条带匹配。对条带和条带匹配进行人工检查和更正。
将这些条带从双歧杆菌DGGE凝胶中切出。通过将条带在50μl无菌H2O中于+4℃过夜温育来将DNA从条带中洗脱出。扩增条带中的DNA并使扩增片段与原始样品一起在DGGE中进行电泳，从而检验了仅每条切出条带的正确位置和纯度。在EurofinsMWG(德国)中对在凝胶中仅产生单一条带且处在正确位置的条带进行测序。针对不确定碱基对序列进行修剪、人工检查和更正，随后用ClustalW进行比对。使用Blast和NCBInr数据库为这些序列搜索亲缘关系最接近者。使用所比对序列的距离矩阵来比较序列间的相似性。
实施例1
使用芬兰红十字血液服务中心(FinnishRedCrossBloodService)的标准内部血型确定操作规程，从血样确定分泌者状态。确定了59个个体的分泌者状态，其中48个为分泌者，7个为非分泌者。4个样品的分泌者状态未能确定。
实施例2
如在上文的材料和方法中所述，进行了针对粪便双歧杆菌种群的DGGE分析。DGGE凝胶图像显示，获自非分泌者个体的样品中的条带数量比来自分泌者个体的样品中的少，这表明存在于非分泌者中的双歧杆菌基因型比分泌者个体中的少。平均而言，在双歧杆菌的DGGE信息中，非分泌者具有2.5(最多4)个条带，而分泌者具有5.2个条带(最多11个条带)。在五个样品中未检测到双歧杆菌(1个非分泌者样品，4个分泌者样品)。所有非分泌者个体的双歧杆菌信息以及分泌者个体的选定双歧杆菌信息示于图1中。
实施例3
如上文所述，进行了针对粪便双歧杆菌种群的DGGE分析。使用Bionumerics软件包中所提供的工具进行了主成分分析(PCA)。使用基于DGGE所检测到的条带的强度的PCA来为样品建立坐标并发现对主成分贡献最大的条带。使用Bionumerics分析DGGE凝胶图像，从而在样品间进行统计学分析。基于DGGE凝胶中条带的强度的PCA显示，获自非分泌者的样品聚成一组。第一和第二主成分解释了56.3%的总方差。结果示于图2中。
实施例4
如上文所述，进行了针对粪便双歧杆菌种群的DGGE分析。使用基于双歧杆菌DGGE所检测到的条带的强度的PCA来为样品建立坐标并发现对主成分贡献最大的条带。在PCA双标图中，第一和第二主成分贡献了56.3%的总方差。位于位置26.6%、53.3%、62.2%和63.7%的条带对上述成分的贡献最明显。这些条带是在样品中最常检出的条带(表5)。基于双歧杆菌DGGE信息的PCA双标图示于图3中。
实施例5
如上文所述，进行了针对粪便双歧杆菌种群的DGGE分析。使用基于条带强度的香农多样性指数来概括样品中的双歧杆菌多样性。进行了该指数的计算和t检验。香农指数基于物种丰度和均匀度来描述多样性，其显示出非分泌者个体中的双歧杆菌多样性相对于在分泌者个体中有统计学上的显著下降(p=0.009)。因此，非分泌者个体的双歧杆菌多样性比分泌者个体的低。结果示于图4中。
实施例6
如上文所述，通过测序进行了对条带的DGGE分析和鉴定。鉴定的基础是对获自切出的DGGE凝胶条带的序列进行的Blast搜索。结果显示，与分泌者个体相比，非分泌者个体中几种常见的双歧杆菌基因型缺失或很少存在。具体而言，在非分泌者中未检测到：青春双岐杆菌(图5中的条带15、24、27和29)和链状/假链状双歧杆菌(图5中的条带22和34)的最常检出的基因型以及与未经培养的双歧杆菌关联的基因型(图5中的条带5、13、19、25、31和37)，或者其物种水平上的详细鉴定需要进一步的分析(例如测序)的那些双歧杆菌物种和/或菌株。此外，在非分泌者个体中检测到的与两歧双歧杆菌关联的基因型(图5中的条带6、8、11、16、17、20、30、32和36)及未经培养的双歧杆菌关联的基因型比分泌型个体中的更稀少。在整套研究样品中最常检出的双歧杆菌基因型也是在非分泌者个体和分泌者个体之间出现情况不同的那些基因型(表5中的粗体)，例外的是长双歧杆菌，其在分泌者个体和非分泌者个体中一样常见。因此，该结果表明非分泌者缺乏或携带了少量的在分泌者中常见的几种双歧杆菌基因型。结果示于图5和表5中。
实施例7
如上文所述，使用BioNumerics软件进行了DGGE分析和条带位置分析。结果显示，存在于非分泌者个体中的双歧杆菌基因型为：双歧杆菌基因型4(条带位置16.3%)、双歧杆菌基因型6(条带位置20.4%)、双歧杆菌基因型7(条带位置22.3%)、两歧双歧杆菌(条带位置29.7%)、双歧杆菌基因型12(条带位置43.8%)、双歧杆菌基因型16(条带位置47.3%)、双歧杆菌基因型17(条带位置49.5%)、双歧杆菌基因型18(条带位置55.0%)、双歧杆菌基因型20(条带位置62.2%)和长双歧杆菌(条带位置53.5%)(表5，图6)。
表5.对条带位置的鉴定以及条带在非分泌者(NSS,n=6)和分泌者(SS,n=42)中的检出频率。频率在非分泌者和分泌者之间有差异的条带位置以粗体标出。
*被划分到条带位置43.8%中的两个条带的序列并不完全相同，其相似性为97.3%。
实施例8
除了之前的实施例1～7中的59位志愿者以外，在此实施例中招募了12位新志愿者，从而将志愿者数提高到了71位。对于这71个样品，除了确定表型外，通过对FUT2的编码外显子进行测序来对分泌者状态进行基因型确定，如在Silva等(Silva等，GlycoconjJ2010;27:61-68)和Ferrer-Admetlla等(MolBiolEvol2009;26:1993-2003)中所述。对FUT2外显子的基因型确定使得能够确定Lewis阴性个体(其表型分泌者状态无法确定)的分泌者状态。如上文所述，对粪便双歧杆菌基因型进行了DGGE分析并进行了数据分析，不同之处在PCA中使用了条带存在或缺失的情况。用统计学程序设计语言R(版本2.10.1)用计算机进行了统计学分析，即方差分析。
在扩充的数据集(n=71)中，57个个体具有分泌者表型，14个为非分泌者。与实施例3和4中的PCA结果类似，在对双歧杆菌DGGE信息进行的PCA分析中，非分泌者个体的结果在分泌者个体内形成了独立的聚类。基于双歧杆菌DGGE信息的PCA双标如图7所示。在PCA中观察到的聚类现象表明：与来自分泌者个体的样品相比，来自非分泌者个体的样品中的双歧杆菌种群发生了变化。这些结果确认了实施例3和4中用较小数量的样品得到的结果。
对PCA聚类贡献最大的条带位置是17.7%、20.4%、26.6%、62.2%和63.7%(图7)。这些条带位置也属于在分泌者个体中最常检出的那些(表6)。条带位置17.7%(青春双歧杆菌)和63.7%(链状/假链状双歧杆菌)在非分泌者个体中缺失。而在非分泌者个体中，除与长双歧杆菌关联的条带位置53.5%外，所有其他常见的条带位置(在多于10%的样品中出现)的检出频率都比在分泌者个体中明显更低(表6)。与分泌者状态相关的条带位置被关联至青春双歧杆菌、链状/假链状双歧杆菌、齿双歧杆菌和两歧双歧杆菌。因此，该结果表明非分泌者缺乏或极少具有在分泌者样品中常见的几种双歧杆菌基因型。
与实施例5类似，使用基于条带强度的香农多样性指数来表示样品中的双歧杆菌多样性。此外，使用条带数量来表示双歧杆菌物种的丰富度。香农多样性指数和条带数量显示出，与分泌者个体相比，非分泌者个体的双歧杆菌多样性和丰富度都在统计学意义上显著下降(p分别为0.0001和0.0003)。平均而言，非分泌者个体的每个样品中的条带数是分泌者个体的几乎2倍(19倍)。平均而言，在双歧杆菌的DGGE信息中，非分泌者个体具有2.5(最多5)个条带，而分泌者个体具有4.7个条带(最多11个条带)。因此，非分泌者个体的双歧杆菌多样性和丰富度比分泌者个体的低。结果示于图8中。
表6.对双岐杆菌DGGE的条带位置的测序鉴定以及条带在分泌者个体(14)和非分泌者个体(57)中的检出频率
*16SrDNA局部序列(475～490bp)与所示的物种的模式株的相似性为98%以上。
实施例9
使用了定量PCR(qPCR)方法来检测并定量非分泌者个体(n=14)和分泌者个体(n=57)的粪便样品中的细菌、双歧杆菌和4个双岐杆菌群/物种(两歧双歧杆菌、长双歧杆菌群、链状/假链状双歧杆菌和青春双歧杆菌)的16SrRNA基因拷贝。引物和每对引物的退火温度示于表7中。对于每对引物，25μl的反应混合物由0.3μM每种引物(Sigma-Aldrich,UK)、1×PowerSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,CA,USA)、4μl粪便DNA(对于双歧杆菌群特异性引物，将其稀释至1ng/μl的浓度；对于通用引物和双岐杆菌引物，将其稀释至0.1ng/μl的浓度)组成。ABIPrism7000设备(AppliedBiosystems,CA,USA)中的扩增条件为：在95℃进行10分钟，一个循环；随后是在95℃进行15秒和在适合的退火温度(见表6)进行60秒，40个循环。分析了60℃～95℃的解链温度曲线，以确定扩增的特异性。以三等分样式对所有样品和标准样进行了分析。使用细菌基因组DNA浓度已知的10倍稀释液(10ng/μl～0.0004ng/μl)，从对应的细菌菌株(表7)为每个细菌群构建了标准曲线。在设备(MPBiomedicals,CA,USA)中进行细胞裂解，并使用DNA迷你试剂盒(Qiagen)，从而从标准菌株中提取出基因组DNA。使用GenEx企业版v.5.2.6.34(MultiDAnalysesAB,Sweden)来对标准曲线进行分析和对样品进行反推定量。用统计学程序设计语言R(版本2.10.1)用计算机进行了统计学分析，即Wilcoxon检验。
表7.针对16SrRNA基因的引物，退火温度，以及用作qPCR中标准样的菌株
*扩增了物种长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、猪双歧杆菌。
**用于扩增青春双歧杆菌基因型A和B的两个正向引物。
参考文献：1Tseng等，ClinChem2003,49,306-309。2 等，JApplMicrobiol2004,97,1166-1177。3Matsuki等，ApplEnvironMicrobiol2004;70:167-173。
在来自非分泌者个体和分泌者个体的样品中，双岐杆菌在超过90%的样品中都可检出(图9)。与分泌者个体的样品相比，在非分泌者个体的样品中，双歧杆菌的总量更低(p=0.05)，所存在的双岐杆菌物种也更少(图9)。在非分泌者中所有双歧杆菌群的检出频率都比分泌者样品中的低，这确认了DGGE结果。在14%的非分泌者样品中检测到了两歧双歧杆菌(对照35%的分泌者样品)，在29%的非分泌者样品中检测到了链状/假链状双歧杆菌(对照47%的分泌者样品)，在57%的非分泌者样品中检测到了青春双歧杆菌(对照75%的分泌者样品)。此外，在具有可检出量的青春双歧杆菌群的样品中，非分泌者中的青春双歧杆菌的丰度比分泌者样品中的低(p=0.055)(图9)。
实施例10
发明人从非分泌者个体和分泌者个体的样品中分离出了双歧杆菌菌株，并在DGGE凝胶中分析了它们的16SrRNA基因片段以及粪便样品，从而鉴定出对应于所观察到的DGGE条带位置(即DGGE基因型)的菌株。采用TNOTIM-1模型来分离菌株，该模型模拟胃和小肠中的环境。由合并的非分泌者样品(共12.1g粪便)、两个单独的分泌者样品(1.9g和2g粪便)以及合并的分泌者样品(共9.8g粪便)制备了粪便浆。在DGGE分析和菌株分离中使用的是相同的粪便样品。将粪便与人造唾液和无菌水/乳混合而得到的TIM-1用粪便浆被用来输入TIM-1模型。采用了该模型的两种状态：在一种状态中，将用于清空胃内容物的T1/2设置为20分钟，pH变化为30分钟内从pH2.0到1.7，胃分泌水平为20%。在另一种状态中，将胃清空半衰期设置为30分钟，胃pH下降为90分钟内从5.0到1.8，胃分泌水平为100%。将胃内容物传送至十二指肠隔室中，并在此处将其中和至pH6.4，添加胆汁和胰酶，随后传送(时间10分钟)至空肠隔室中以及至回肠隔室中。在每个隔室中，模拟了胆汁盐类、胰酶和电解质的生理浓度以及经过小肠的平均生理通量。在模型中处理120～80分钟、180～240分钟和240～300分钟后收集样品，并使用Beerens培养基和RB培养基(棉子糖双歧杆菌培养基)分离出双歧杆菌。将分离物于37℃在厌氧条件下温育72小时。通过在beerens琼脂上直接进行平板接种并于37℃在厌氧条件下温育72小时，还从粪便浆中分离出了来自分泌者个体的粪便样品的菌株。如在等(JApplMicrobiol2004;98:459-470)中所述，使用引物OPA-2用RAPD对分离物进行筛选。将代表不同RAPD信息的菌株保藏在本地菌株收集库中，并在DGGE中对其进行分析来发现这些菌株所对应的条带位置。在设备(MPBiomedicals,CA,USA)中进行细胞裂解，并使用DNA迷你试剂盒(Qiagen)，从而从菌株中提取出基因组DNA。通过对16SrRNA基因片段(长约700碱基对)进行测序来鉴定菌株。按上文所述执行DGGE分析。
总共分离出了274株来自非分泌者个体的双歧杆菌菌株和360株来自分泌者个体的菌株。用RAPD筛选分离物，以检测不同的双歧杆菌菌株。在对分离物进行RAPD筛选时，具有不同RAPD信息的15个不同的双歧杆菌分离物源自非分泌者个体样品，28个双歧杆菌分离物源自分泌者个体样品。
在粪便样品的DGGE信息中检出的共26个条带位置(DGGE基因型)中，菌株与其中15个对应。此外，这些菌株与几乎所有的常见双歧杆菌DGGE基因型(13株中有12株存在于超过10%的样品中)对应(表6)。发现来自非分泌者个体的菌株对应于6个DGGE基因型，然而来自分泌者个体的菌株对应于13个DGGE基因型。条带位置/DGGE基因型、DNA序列以及对应菌株列于表8中。一些菌株具有若干个16SrRNA拷贝，因此一种菌株可以对应于若干个条带位置。
表8.DGGE中双歧杆菌条带位置的序列和鉴定结果，以及来自分泌者个体和非分泌者个体的对应菌株的存在情况。为每个位置都示出了已用引物Bif164F和Bif662R在DGGE中进行了扩增和分析的16SrRNA基因片段的序列。双歧杆菌基因型序号参见表1和表2中的基因型。
实施例11
通过在实施例10中所述的处理之前和之后对活细菌进行计数，分析了双歧杆菌在TNOTIM-1模型处理中的存活情况。从合并的非分泌者样品(共12.1g粪便)和分泌者样品(共9.8g粪便)制备了粪便浆，并从该粪便浆中分析了双歧杆菌在TNOTIM-1模型中的存活情况。在TIM-1处理之前(进样)和在处理120～180分钟、180～240分钟和240～300分钟后，从粪便浆中收集样品。将所收集的样品的梯度稀释液以二等分样式平板接种在beerens和RB培养基上，并于37℃温育72小时。
来自分泌者合并样的双歧杆菌的存活率是来自非分泌者合并样的双歧杆菌的存活率的2.4倍(在RB琼脂上)或32倍(在Beerens琼脂上)高(表9)。这些结果表明，非分泌者个体中的可培养的双歧杆菌种群与分泌者个体中的双歧杆菌种群不同。此外，非分泌者个体中的双歧杆菌种群体对模拟胃和小肠环境的TNOTIM-1模型的严酷条件忍耐力较低。
表9.来自分泌者个体和非分泌者个体的合并粪便样品的双歧杆菌在TIM-1模型(上胃肠道条件)中的存活率。存活率通过用Beerens和RB培养基进行平板计数培养确定。

Claims (20)

1.一种微生物组合物，其特征在于，所述微生物组合物是根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌组成而定制的，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种下述双歧杆菌基因型：
具有SEQIDNO:11的16SrRNA序列并且DGGE条带位置为45.7％的青春双歧杆菌，和
具有SEQIDNO:12的16SrRNA序列并且DGGE条带位置为63.7％的链状/假链状双歧杆菌。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含两歧双歧杆菌。
4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种益菌素。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述益菌素包含含有岩藻糖的聚糖。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述益菌素是乳-N-二糖I。
7.在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的的双歧杆菌谱在定制微生物组合物中的应用，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
8.个体的分泌者/非分泌者血型状态在定制用于补充富含双歧杆菌的益生菌的微生物组合物中的应用，其中所述双歧杆菌在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
9.个体的分泌者/非分泌者血型状态在定制用于为所述个体补充富含双歧杆菌的益生菌的微生物组合物中的应用，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
10.母乳喂养或断奶的婴儿及该婴儿母亲的分泌者/非分泌者血型状态在定制用于为所述婴儿补充富含双歧杆菌的益生菌的微生物组合物中的应用，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
11.个体的分泌者/非分泌者血型状态在定制用于补充得到想要的效果所需剂量的双歧杆菌的微生物组合物中的应用，其中所述双歧杆菌在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
12.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是为非分泌者型的婴儿定制的。
13.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是为母乳喂养的且其母亲具有非分泌者血型类型的婴儿定制的，而不论所述婴儿的分泌者表型。
14.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是为老年个体定制的，用于支持双歧杆菌多样性和丰度的保持。
15.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗和/或预防炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或过敏症。
16.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗和/或预防遗传性过敏症。
17.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，所述微生物组合物是益生菌组合物。
18.如权利要求7～11中任一项所述的应用，所述微生物组合物是益生菌组合物。
19.一种组合物，其特征在于，所述组合物是根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌组成而定制的，所述组合物用于平衡分泌者和/或非分泌者个体中的双歧杆菌微生物丛，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
其中所述DGGE条带位置能够通过下述方法确定：
a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
b)用45％～60％的变性梯度，在8％DGGE凝胶中于70V进行960分钟来分离经扩增的局部16SrRNA。
20.一种组合物，其特征在于，所述组合物是根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌组成而定制的，所述组合物用于对分泌者和/或非分泌者个体中的双歧杆菌肠内种群进行靶向调节，从而得到更高多样性和/或更多量的双歧杆菌物种或菌株，
术语“不常见”是指在非分泌者中具有可检测水平的所述双歧杆菌物种或菌株的频率通常小于10％，
所述组合物包含具有选自由3.5％、7.5％、12.6％、17.7％、26.6％、62.2％、33.0％、45.7％、57.3％和63.7％组成的组中的DGGE条带位置的至少一种菌株，
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a)用双歧杆菌特异性引物Bif164F和Bif662R+GC对双歧杆菌16SrRNA基因局部进行PCR扩增；
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