CN108837558B - 采用多级离心分馏萃取从茶多酚中连续分离egcg方法 - Google Patents
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Abstract
本专利介绍了一种新的从茶多酚中分离提纯EGCG的方法——多级离心分馏萃取法，该技术涉及的萃取法为溶剂萃取法，不含反应萃取剂，具有成本低、可连续性操作、操作简单和易于工业化生产等显著特点。本专利利用各单体在有机相和水相中的分配行为不同对EGCG进行了选择性分离，利用离心萃取器的离心作用力强化传质效率，从而实现EGCG的快速和高选择性分离，EGCG的纯度可达99%以上。该技术克服了其他分离提纯EGCG方法所存在的分离成本高，分离程序繁琐，分离效率低，不利于工业化生产等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种从茶多酚中分离EGCG的分离纯化方法，涉及一种采用溶剂萃取法，经多级离心萃取器离心分馏萃取EGCG的方法。
背景技术
茶多酚（tea polyphenols）是从茶叶中提取出来的一种生物活性物质，由30多种含酚基的物质组成，其中以儿茶素的含量最高。茶多酚中主要包含儿茶素（DL-C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等主要儿茶素单体，其中EGCG是活性最高。现代医学研究发现，茶多酚是一种新型的天然抗氧化剂，具有抗肿瘤、抗衰老、去脂减肥，降低血糖、血脂和胆固醇及抑制艾滋病（HIV病毒）的作用；还能清除体内过剩的自由基、阻止脂质过氧化，提高机体免疫力，延缓衰老。茶多酚还有抑制细菌生长、防止食物腐败变质、消除异臭、水溶性强等特征，因此，在食品、油脂、保健、医药、日化、精细化工等领域都有广泛的应用。在FDA确定儿茶素具有药用功能后，国际市场对儿茶素的需求日益增长。研究各种儿茶素的药理活性和在体内的代谢情况，儿茶素新药的开发，均需要各类高纯度的儿茶素单体，尤其是功效与含量远大于其他儿茶素的EGCG，成为了研究的重点。
EGCG是绿茶中最有效的抗氧化多酚，具有非常强的抗氧化、抗癌、抗突变等活性，而且EGCG对肿瘤防治具有十分重要的意义，已经得到各国相关研究人员的认可。EGCG的提纯制备主要采用色谱法或色谱联用的方法。其中柱色谱法分离纯度高，但是固定吸附材料容易造成样品的不可逆吸附或降解，分离效率低，操作步骤繁琐费时，操作条件不易控制。高效液相色谱法操作简便，分离效果好，但该方法分离成本高，分离量较小，难以实现工业化。高速逆流色谱较高效液相色谱法增大了处理量，但仍然难满足工业化生产需求。另外，已有超临界流体萃取法分离提纯EGCG的报道，该方法无污染，分离量大，有利于工业化，但是茶多酚在超临界CO2流体中溶解度较低，导致分离产率较低。因此，提出新的分离EGCG的方法具有重大意义。
本发明是首次采用多级离心分馏萃取技术对茶多酚中EGCG进行连续萃取分离。本发明利用不同儿茶素在溶剂体系中的分配行为不同，利用离心萃取器的离心作用力进一步强化传质效率，快速高效地得到高纯度EGCG。该技术克服了上述其他分离技术所存在的分离成本高，分离程序繁琐，分离效率低，不利于工业化的问题，具有操作简便，产量大和纯度高的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用绿色高效不含反应萃取剂的溶剂体系，利用多级离心萃取连续分离EGCG的技术，适用于工业化生产高纯度EGCG，生产过程简单高效，绿色环保，克服了现有技术的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种EGCG的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行分配实验。茶多酚溶于水中作为水相，茶多酚浓度0.01 g/mL，纯有机溶剂（或混合溶剂）作为有机相；在一定温度下，取相同体积两相混合进行萃取分离，经振荡静置后，用高效液相色谱分析水相和有机相茶多酚的浓度，计算茶多酚中各个单体的分配比（单体有机相浓度/单体水相浓度）和分离因子，选择出合适的溶剂体系进行多级离心萃取实验。
（2）进行第一步多级离心萃取实验。取适量茶多酚溶于水中，配制一定浓度的茶多酚水溶液作为料液相；将步骤（1）筛选出的有机溶剂体系作为有机相；取纯水作为水相，进行多级离心分馏萃取实验。其中，有机相与料液相体积流量比为0.2 ~ 20，有机相与水相体积流量比为0.2 ~ 20，萃取级数2 ~ 20级，料液相进料位置为2 ~ N-1，温度控制在0 ~ 25℃。
（3）进行第二步多级离心萃取实验。取步骤（2）所得含EGCG水相作为料液相，将步骤（1）筛选出的有机溶剂体系作为有机相；取纯水作为水相进行多级离心分馏萃取实验。其中，有机相与料液相体积流量比为0.1 ~ 20，有机相与水相体积流量比为0.1 ~ 20，料液相进料位置为2 ~ N’-1，温度控制在0 ~ 25 ℃，进行N’ (2 ≤ N’ ≤ 20)级离心分馏萃取，得到含有EGCG的有机相。
（4）将步骤（3）得到的有机相进行减压蒸馏，获得高纯度的EGCG粉末。
显著特点：本发明先采用溶剂萃取法从茶多酚中对EGCG进行分离，选择合适的萃取体系，利用不同单体在水相和有机相中分配行为不同，利用离心萃取器的离心作用力使水相和有机相实现快速混合及快速分离，快速高效地获得纯度高的EGCG。通过多级离心分馏萃取，可大大提高EGCG的纯度和产率，使用的有机溶剂可回收利用，大大降低了成本，减少了污染。本方法流程简单，操作简便，产品质量稳定，适合规模化生产。
附图说明：
图1为离心萃取器多级分馏萃取技术所用装置示意图，其中各序号分别代表：①步骤（2）离心分馏萃取水相入口，②步骤（2）离心分馏萃取水相出口，③步骤（2）离心分馏萃取有机相入口，④步骤（2）离心分馏萃取料液相入口，⑤步骤（2）离心分馏萃取有机相出口，⑥步骤（3）离心分馏萃取水相入口，⑦步骤（3）离心分馏萃取水相出口，⑧步骤（3）离心分馏萃取有机相入口，⑨步骤（3）离心分馏萃取料液相入口，⑩步骤（3）离心分馏萃取有机相出口。将水相入口处的离心机编号为1（1’），按水相流动的方向对离心机依次编号，每台离心机构成1个萃取级。f（f’）代表进料位置，第1至第f（f’）级构成洗涤段，第f+1至第N（N’）级构成萃取段。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明做进一步说明：
一、测试与分析
本发明所述实施例中分离产物的产率和残余率分析采用美国安捷伦科技公司Agilent 1260高效液相色谱仪以及日本GL Sciences公司的Inertsil ODS-3色谱柱（250mm × 4.6 mm，5 μm）。
二、实施例
实施例1
取茶多酚溶于水中制成浓度为0.01 g/mL的溶液作为水相，取有机溶剂（乙酸丁酯或乙酸异丁酯或甲基叔丁基醚）与正己烷以不同比例混合作为有机相。取水相和有机相各3mL于10 mL离心管中，于水浴恒温振荡器中5 ℃充分震荡后静置分层，计算平衡时茶多酚中各单体的分配比（k）；当乙酸异丁酯和正己烷体积比为80:20，EGCG与GCG分配比相邻分别为0.65和2.39，分离因子为3.68。取茶多酚溶于去离子水配成浓度为0.01 g/mL的1 L溶液作为料液相；取乙酸异丁酯和正己烷（体积比80:20）混合溶剂作为有机相；取去离子水作为水相；串联10级离心萃取器，使用恒流泵先将水相泵入离心萃取器，当萃余相出口有水相流出时，将有机相从相应入口泵入离心萃取器，经过一段时间两相流量达到稳定后再将料液相从第6级离心萃取器泵入。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为2:1，有机相与水相体积比为1:1。用循环冷却水控制温度为5 ℃，进行离心分馏萃取实验，3小时后萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，茶多酚中分配比相邻的EGCG与GCG分别进入水相和有机相中，EGCG产率达到98%。
实施例2
取茶多酚溶于去离子水配成浓度为0.01 g/mL的1 L溶液作为料液相；取乙酸异丁酯和正己烷（体积比80:20）混合溶剂作为有机相；取去离子水作为水相；串联10级离心萃取器，使用恒流泵先将水相泵入离心萃取器，当萃余相出口有水相流出时，将混合有机溶剂从相应入口泵入离心萃取器，两相流量达到稳定后再将初分离后含EGCG混合物的料液相从第6级离心萃取器泵入。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为2:1，有机相与水相体积比为3:2。用循环冷却水控制温度在5 ℃下进行离心分馏萃取3小时，使萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，茶多酚中分配比相邻的EGCG与GCG分别进入水相和有机相中，EGCG产率为76%。
实施例3
对于第一步多级分馏萃取，取茶多酚溶于去离子水配成浓度为0.01 g/mL的1 L溶液作为料液相，取乙酸异丁酯与正己烷（体积比80:20）的混合有机溶剂作为有机相，取去离子水作为水相；串联10级离心萃取器，使用恒流泵先将水相泵入离心萃取器，当萃余相出口有水相流出时，将有机相从相应入口泵入离心萃取器，经过一段时间两相流量达到稳定后再将料液相从第6级离心萃取器泵入。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为2:1，有机相与水相体积比为1:1。用冷却循环水控制温度在5 ℃下进行10级离心逆流萃取3小时，使萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，茶多酚中分配比相邻的EGCG与GCG分别分离进入两相中，EGCG与分配比小于EGCG的单体分配进入水相中。第一步分离平衡后，将乙酸丁酯溶剂作为有机相，取纯水作为水相，使用恒流泵分别将水相和有机相泵入下一组10级离心萃取器，用第一步离心萃取分离所得平衡后水相作为料液相，直接泵入第6’级离心机进行第二步多级离心分馏萃取。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为1:1，有机相与水相体积比1:2。用循环冷却水控制温度在5 ℃下进行离心分馏萃取3小时，使萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，仅EGCG分配进入有机相中，将平衡后有机相进行减压蒸馏，获得固体粉末，EGCG纯度达到99%，产率达到96%。
实施例4
对于第一步多级分馏萃取，取茶多酚溶于去离子水配成浓度为0.01 g/mL的1 L溶液作为料液相；取乙酸异丁酯与正己烷（体积比80:20）的混合有机溶剂作为有机相；取去离子水作为水相；串联10级离心萃取器，使用恒流泵先将水相泵入离心萃取器，当萃余相出口有水相流出时，将有机相从相应入口泵入离心萃取器，经过一段时间两相流量达到稳定后再将料液相从第6级离心萃取器泵入。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为2:1，有机相与水相体积比为1:1。用冷却循环水控制温度在10 ℃下进行10级离心逆流萃取3小时，使萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，茶多酚中分配比相邻的EGCG与GCG分别分离进入两相中，EGCG与分配比小于EGCG的单体分配进入水相中。第一步分离平衡后，将乙酸丁酯溶剂作为有机相，取纯水作为水相，使用恒流泵分别将水相和有机相泵入下一组10级离心萃取器，用第一步离心萃取分离所得平衡后水相作为料液相，直接泵入第6’级离心机进行第二步多级离心分馏萃取。水相体积流量为2 mL/min，水相与料液相体积比为1:1，有机相与水相体积比1:2。用循环冷却水控制温度在10 ℃下进行离心分馏萃取3小时，使萃取达到平衡。通过液相检测分析，萃取平衡后，仅EGCG分配进入有机相中，将平衡后有机相进行减压蒸馏，获得固体粉末，EGCG纯度达到90%，产率达到83%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种离心分馏萃取分离EGCG(I)的方法，
其特征在于，包含下述操作步骤：
(1)对预先购买的茶多酚进行溶解处理，溶剂为去离子水，得到茶多酚提取物溶液；
(2)将茶多酚溶液作为水相，将纯有机溶剂或混合溶剂作为有机相，两相混合进行萃取分离，经充分振荡后静置取样，用高效液相色谱分析获得平衡后水相和有机相的茶多酚各单体的浓度，计算出茶多酚中各单体的分配系数和分离因子，筛选出合适的溶剂体系；
(3)取适量茶多酚溶于去离子水作为料液相，将筛选出的纯有机溶剂或混合溶剂作为有机相，去离子水作为水相；
(4)利用计量泵将水相泵入入口①，当出口②有水相流出时，将步骤(2)筛选出的有机相泵入进口③，当有机相出口⑤有有机相流出后，将料液相泵入入口④，水相同有机相呈逆流流动，于一定温度下进行N级离心分馏萃取，2≤N≤20，使第一步萃取过程达到稳定状态；
(5)利用计量泵将水相泵入入口⑥，当出口⑦有水相流出时，将步骤(2)筛选出的有机相泵入进口⑧，当有机相出口⑩和水相出口⑦流量稳定后，再将水相出口②的水相作为料液相泵入入口⑨，水相同有机相呈逆流流动，于一定温度下进行N’级离心分馏萃取，2≤N’≤20，使第二步萃取过程达到稳定状态，从有机相获得纯的EGCG，从水相得到其余儿茶素；
(6)将从步骤(5)得到的有机相进行减压蒸馏，获得高纯度的EGCG粉末；
使用纯溶剂时，多级离心分馏萃取有机相与水相摩尔比为0.2～20，有机相与料液相摩尔比为0.2～20；
使用混合溶剂时，多级离心分馏萃取有机相与水相摩尔比为0.1～20，有机相与料液相摩尔比为0.1～20。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂选自正丁醇，异丁醇，正戊醇，异戊醇，正己醇，庚醇，正辛醇，乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酸异丁酯，甲基叔丁基醚，正己烷；所述混合溶剂为乙酸丁酯、乙酸异丁酯、甲基叔丁基醚与正己烷按一定比例混合的混合溶剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用多级离心萃取器从茶多酚中连续选择性萃取分离EGCG。
4.根据权利要求1所述的方法，料液相泵入入口位置分别为f，f’，2≤f≤N-1，2≤f’≤N’-1。
5.根据权利要求1所述的方法，多级离心分馏萃取过程温度控制在0～25℃。
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