CN108823206B - 一种苎麻的Bn-miR12及其应用 - Google Patents

一种苎麻的Bn-miR12及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苎麻的Bn‑miR12及其应用，该Bn‑miR12核苷酸序列如序列1所示；其前体序列Bn‑MIR12的核苷酸序列如序列2所示；编码前体序列Bn‑MIR12的DNA序列如序列3所示；苎麻的Bn‑miR12调控的靶基因comp44118_c0如序列4所示。本发明这种苎麻的Bn‑miR12的上调表达，可使其靶基因comp44118_c0表达下调，从而影响生长素响应因子6的合成，达到促进镉吸收的作用，在镉超富集苎麻品种培育中具有潜在应用价值。

Description

一种苎麻的Bn-miR12及其应用
技术领域
本发明涉及植物学技术领域，尤其涉及一种苎麻的Bn-miR12及其应用。
背景技术
镉是生物毒性最强的重金属元素，其不仅影响土壤生态结构和功能，而且会抑制作物的生长发育，降低产量和品质，并通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康。我国受镉污染耕地面积近1.33万公顷，污染范围涉及11个省25个地区，且污染程度有逐年加重的趋势。通过种植能吸收镉的作物，降低土壤中镉的含量，是目前处理镉污染土壤最为经济和有效的方法。
苎麻是古老的天然纤维作物，也是我国的特色作物，栽培面积和总产量均占世界的90％以上。苎麻对镉具有高耐高吸收作用，其具有适应能力强、生长迅速、繁殖能力强、根系发达、生物产量大等优点，在很多方面弥补了现有超积累植物植株矮小、生长速度慢、受气候影响大、很难实现实际应用价值等不足，具有很好的生态效益，是修复镉污染土壤的理想植物。目前，有关于筛选不同品种的苎麻来提高苎麻对镉的吸收，如专利201110025715.9中通过苎麻品种筛选方法，将苎麻品种分为高耐低吸收型、高耐高吸收型、低耐低吸收型和低耐高吸收型，指导麻农对不同镉污染程度的土壤种植不同的品种。还有加入一些药剂，与苎麻协同作用，从而提高苎麻对镉的吸收，如专利201410718494.7中，在种植苎麻过程中，施加生物可降螯合剂EDDS，从而提高苎麻对镉的吸收。
microRNA(miRNA)是一类内源性的、19-24个碱基长度的小分子非编码RNA，其通过碱基互补调控靶基因的表达，参与调控植物生长发育及多种非生物与生物胁迫。但是目前提高苎麻对镉的吸收方法，都是辅助性的提高，未涉及到苎麻吸镉分子机制理论的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种苎麻的Bn-miR12及其应用，可控制该基因的上调表达，提高苎麻对镉的吸收。
本发明这种苎麻的Bn-miR12，其核苷酸序列如序列1所示。
所述苎麻的Bn-miR12的前体序列Bn-MIR12，其核苷酸序列如序列2所示。
编码所述前体Bn-MIR12的DNA序列，其核苷酸序列如序列3所示。
所述苎麻的Bn-miR12调控的靶基因comp44118_c0，其核苷酸序列如序列4所示。
所述的苎麻的Bn-miR12在提高苎麻对镉吸收中的应用。
所述的苎麻的Bn-miR12在培育镉超富集苎麻品种中的应用。
其中Bn-miR12中Bn为苎麻的拉丁文Boehmeria nivea的简写，miR代表miRNA。
本发明具有的有益效果：本发明首次从苎麻中筛选的到一种新的miRNA(Bn-miR12)及其前体Bn-MIR12，该Bn-miR12可调控靶基因comp44118_c0的表达，该靶基因编码了生长素响应因子6(Auxin response factor6，ARF6)，而ARF6与重金属离子结合有关。本发明通过实时荧光定量PCR的办法验证了在正常和镉胁迫条件下Bn-miR12在苎麻中的表达差异，得出苎麻植株吸镉量与Bn-miR12表达量呈正比关系的结论，证明本发明Bn-miR12的上调表达可以促进苎麻对镉的吸收，且得出了Bn-miR12与其靶基因comp44118_c0的表达量呈反比关系的结论，证明Bn-miR12通过调节其靶基因的表达来调控苎麻吸镉量。本发明在镉超富集苎麻品种培育中具有潜在应用价值。
附图说明
图1为Bn-miR12前体序列Bn-MIR12的二级结构。
图2为镉胁迫处理下苎麻植株不同部位吸镉量。
图3为镉胁迫条件下Bn-miR12在苎麻叶片中的表达量变化情况。
图4为镉胁迫条件下Bn-miR12的靶基因comp44118_c0在苎麻叶片中的表达量变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述和说明，但本发明所保护范围不限于此。
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。
实施例1miRNA的筛选和鉴定
1.植物材料和样品的准备
处理组：取苎麻中苎1号品种嫩梢(10-15cm)，经多菌灵消毒10s，扦插于水循环装置，置于人工气候温室中培养，待根长至10cm时用10mg/L浓度的氯化镉处理，处理20天后采集完全展开的苎麻叶片，液氮速冻后，-80℃冷冻备用。
对照组：将处理组中的10mg/L浓度的氯化镉换成水，其余实验条件不变，作为对照组。
2.苎麻miRNA的高通量测序
RNA提取：将叶片在液氮中研磨成粉末后，采用北京艾德莱生物科技有限公司生产的EASYspin植物microRNA快速提取试剂盒提取RNA；用微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，RNA OD60/OD80在1.8～2.2之间，电泳显示28S和18S条带清晰，无降解，表明RNA质量合格；用Agilent 2100Bioanalyzer检测RNA的完整性，完整性大于8.0，表明RNA完整性高。
文库构建：检验合格的RNA用于构建miRNA文库，miRNA文库的构建按照IlluminaSampleSrepration Protocol文库构建方法进行，然后采用HiSeq2500高通量测序，委托百迈客生物科技有限公司完成。
3.miRNA的鉴定
HiSeq2500高通量测序获得rawreads数据后，对所获得的原始数据序列进行去街头、去低质量、去未知碱基N含量大于等于10％、去污染、去载体序列、去短于18或长于30个核苷酸的序列等处理，得到可用于后续分析的干净序列(cleanreads)。利用Bowtie软件，将cleanreads分别与Silva数据库、GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase数据库进行序列比对，过滤核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等ncRNA以及重复序列，获得包含miRNA的Unannotated reads。利用miRDeep2软件将Unannotated reads与指定的苎麻转录组进行序列比对，获得Mapped Reads。利用miRDeep2软件将18-30nt的核苷酸序列比对到miRBase数据库中特定物种上，鉴定该物种已知的miRNA；过滤获得的未比对到参考基因组，通过碱基数目延伸，进行miRNA结构预测，进行二级结构分析。本实施例中二级结构如图1所示，从图可知，其形成类似miRNA前体的稳定茎环结构则该序列可鉴定为苎麻新miRNA。通过该方法，鉴定出受镉胁迫诱导的苎麻新miRNA，命名为Bn-miR12，其成熟序列为：UGAAGCUGCCAGCCUGAUCUC(如序列1所示)，其前体序列如序列2所示。
4.Bn-miR12差异表达分析
利用DESeq软件对来自对照组和处理组处理文库的miRNA序列进行比对分析，利用|log2(fold change)|≥1和Benjamini-Hochberg错误发现率校正P-值<0.01作为筛选条件，进行样品组间的差异表达分析。结果表明，在处理组中Bn-miR12在苎麻叶片中上调表达。
5.Bn-miR12靶基因的预测
用TargetFinder软件对Bn-miR12的靶基因进行预测，并通过生物信息学对所获得的靶基因进行注释，利用预测到的靶基因序列比对苎麻基因组，获得靶基因的基因组序列，该靶基因为comp44118_c0，其核苷酸序列如序列4所示。
实施例2Bn-miR12的表达量分析
1.植物材料和样品的准备同实施例1中1。
2.Bn-miR12的表达量分析
以提取的合格的RNA为样品，采用Specific Stem-loop RT Primer第三代试剂盒反转录成cDNA第一链，以cDNA为模板，采用试剂盒中通用的反向引物和正向引物F1对进行q-PCR检测Bn-miR12的表达量，采用F2和R2组成的引物对进行q-PCR检测18SrRNA(内参基因)，计算Bn-miR12的相对表达量。
具体操作步骤如下：
1)RNA提取：取-80℃保存的样品，液氮研磨成粉，取粉末约100mg，迅速加入1ml冷藏的trizol，匀浆仪匀浆2min；按200μL氯仿/1mL Trizol的比例加入氯仿，迅速混匀15s，在室温放置2-3min；在2℃-8℃环境中，12000g离心15min，提取上层水相600μl；在提取的水相中按1:1的比例加入异丙醇，轻轻吹打混匀，室温放置10min；2℃-8℃环境12000g离心10min，RNA沉淀于管底，将上层废液吸出(尽量将液体吸干净)；按1mL 75％酒精/1mLTrizol的比例加入-20℃保存的75％冷酒精，颠倒3次悬浮沉淀，在2℃-8℃环境7500g离心5min，弃去上层废液，空气中干燥5-10min；加入50μL RNase free的水溶解RNA，测定浓度备用。
2)反转录：以提取的RNA为模板，采用Specific Stem-loop RT Primer第三代试剂盒反转录成cDNA第一链，反转录体系如下：
Figure BDA0001706955940000041
Figure BDA0001706955940000051
冰上5min，16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃1s。
18SrRNA反转录：
配制反应液：
总RNA原液 ～200ng
100μMoligo(dT) 1μl
Rnase Free H<sub>2</sub>O 至12μl
70℃10min，迅速冰上冷却2min
反转录体系：
项目 用量
上述反应液 12μl
5x M-MLV buffer 4μl
25mMdNTP 0.4μl
Rnase inhibitor 0.5μl
200U/μL M-MLV 0.5μl
Rnase Free H<sub>2</sub>O Upto20μl
42℃60min，85℃5min，4℃1s，-20℃保存获得的cDNA。
3)q-PCR实验
正向引物F1：TGAAGCTGCCAGCCTGATCTC(序列5)；
反向引物R1：试剂盒通用引物；
正向引物F2：ATGATAACTCGACGGATCGC(序列6)；
反向引物R2：CTTGGATGTGGTAGCCGTTT(序列7)，在冰上配制PCR反应体系：
项目 用量
cDNA 0.2μl
2×SYBR mix 5μl
0.5μMeachprimer 4μl
ddH<sub>2</sub>O 补足10μl
充分混匀PCR反应液，吸取反应液至每个PCR反应孔中，封好热封膜，短暂离心，确保所有试剂都甩至反应管底部。在Roche light cycler 480II PCR仪上检测目的miRNA，PCR反应程序如下：
循环数 步骤 温度 时间
1 预变性/酶活化 94℃ 10min
45 变性 82℃ 20sec
退火/延伸 60℃ 20sec
熔解曲线分析：
Figure BDA0001706955940000061
18SrRNA反应程序：
循环数 步骤 温度 时间
1 预变性/酶活化 94℃ 10min
45 变性 94℃ 20sec
退火/延伸 60℃ 30sec
熔解曲线分析同目标miRNA。以内参基因做参考，计算Bn-miR12的相对表达量。
本实施例中Bn-miR12的相对表达量见图3。结果表明，处理组在镉胁迫作用下，Bn-miR12在苎麻叶片中相对于对照(未经镉胁迫处理的苎麻)上调表达，与测序分析的表达量表达趋势一致。
实施例3Bn-miR12的靶基因comp44118_c0的表达量分析
1.植物材料和样品的准备同实施例1中1。
2.Bn-miR12靶基因的表达量分析
按照实施例2中18SrRNA反转录的方法准备cDNA样品，利用靶基因正向引物F3：CTCGCAACTTTTCCAAAACC(序列8)和反向引物F3：TTGCTCTGTTTTTGGGCTCT(序列9)引物对扩增靶基因，以18SrRNA为内参基因(正向引物F4：TGACGGAGAATTAGGGTTCGA(序列10)；反向引物F4：CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT(序列11))，在Roche light cycler 480II PCR仪上检测靶基因的表达量，PCR反应体系及反应程序同实施例2中18SrRNA。靶基因的表达量如图4所示。结果表明，在镉胁迫处理下，Bn-miR12的靶基因comp44118_c0表达量与Bn-miR12的表达量呈反比关系，说明comp44118_c0受Bn-miR12调控，从而调控苎麻对镉的吸收。
实施例4镉胁迫下苎麻植株吸镉量分析
取苎麻中苎1号品种嫩梢(10-15cm)，经多菌灵消毒10s，扦插于水循环装置，置于人工气候温室中培养，待根长至10cm时用10mg/L浓度的氯化镉处理，处理20天后分别收获根、茎、叶，烘干后磨粉，利用SOLAAR M6原子吸收光谱仪测定其镉含量，结果如图2所示。
对照组：对照组将氯化镉处理换成水处理，其他条件与处理组一致。对照组的根茎叶镉含量极低，原子吸收的方法未能检测到镉的存在。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 一种苎麻的Bn-miR12及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 苎麻()
<400> 1
ugaagcugcc agccugaucu c 21
<210> 2
<211> 108
<212> RNA
<213> 苎麻()
<400> 2
uaucgugcuu cacuacuagu ugaagcugcc agccugaucu caaccuuccu ccuugaugag 60
ggaugauuag aucaugcggc agcuucaccu gguucuggcg gcacgaga 108
<210> 3
<211> 108
<212> DNA
<213> 苎麻()
<400> 3
tatcgtgctt cactactagt tgaagctgcc agcctgatct caaccttcct ccttgatgag 60
ggatgattag atcatgcggc agcttcacct ggttctggcg gcacgaga 108
<210> 4
<211> 825
<212> DNA
<213> 苎麻()
<400> 4
ccttcttggg gctgagggct aaaaccaact gaagagagcc tcatttcaga agaacttaac 60
cacaacttaa gaacttaatt tgatcaaagc aaataagcac caaaattgac caaaaacact 120
gaccaagcac ttcttccact gcacaagaac atatcttctt tcacccacta aaatcccaat 180
acaacatagt ccatgcaaag cctctctctg caaatcacgt agtctctaaa cagacttatt 240
cagagccaag gacaagaaaa gaatcaaact ttgacaaacc cacaacaagc caagctctga 300
aatcttcaac caaacccagt ttcgctgcaa aacaagattg atttgagcct cataagctag 360
tgatcaccga aaacaaggcc tcagtcaaca ttcgaagagc acagagctca aaagctcgca 420
acttttccaa aacccacttg agaaaaggcc aaaagaagct gagagaaacg acagatctcc 480
gatacctcgg aaacccagaa aggaatcacc agatctcaat tagcagagcc caaaaacaga 540
gcaagagatt ttcaagtgct ttgttgttac catttctttt ctctctctct tgttttgctc 600
agagcaagcg agctcaagga gcgtcatgat tacatgtgca tatacgaaca ctgtgagata 660
atcacagaga atatttattg tgtgcaaaat aactaataat aatgaagatc gtatcgtaga 720
gtttggaggg atttttactc agctttttat ttttttttgt ttccactaat ggaaatggaa 780
actgagagct gtttggcttt agttctctgc taagtggtag tggtg 825
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tgaagctgcc agcctgatct c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atgataactc gacggatcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cttggatgtg gtagccgttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ctcgcaactt ttccaaaacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ttgctctgtt tttgggctct 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tgacggagaa ttagggttcg a 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ccgtgtcagg attgggtaat tt 22

Claims (4)

1.一种苎麻的Bn-miR12，其特征在于，所述的Bn-miR12核苷酸序列如序列1所示。
2.根据权利要求1所述的苎麻的Bn-miR12的前体序列Bn-MIR12，其特征在于，所述的前体序列Bn-MIR12核苷酸序列如序列2所示。
3.编码权利要求2所述的前体序列Bn-MIR12的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列核苷酸序列如序列3所示。
4.根据权利要求1所述苎麻的Bn-miR12调控的靶基因comp44118_c0，其特征在于，所述comp44118_c0的核苷酸序列如序列4所示。
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