CN114457074B - 一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用，包括miRNA，所述miRNA为铵态氮处理条件下，在木本植物根系中上调表达的miRNA(pc‑miR166b)，所述miRNA的靶基因为真核翻译起始因子基因(eukaryotic translation initiation factor，eIF)，所述miRNA在铵态氮处理过程中高表达，通过下调靶基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程，miRNA(pc‑miR166b)与参与木本植物根系对铵态氮的应答过程中有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，pc‑miR166b的表达量在铵态氮处理和对照组处理样本间的差异极显著，本发明为培育高效吸收利用土壤氮素的木本植物新种质意义重大，适合于推广应用。

Description

一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程育种技术，尤其涉及一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用。
背景技术
氮素是植物生长发育必不可少的大量元素之一，也是植物根系从土壤中吸收最多的矿质元素，对其生长发育具有重要意义。但是，土壤中的氮元素含量并不均一，且在土壤空间中的分布复杂多变，如何利用土壤中复杂多变的氮素环境发展农林业，是生物科学技术迫切需要解决的重大课题。其中，利用传统育种方式培育高氮素吸收利用效率木本植物新品种虽然可行，但是难以实现遗传定向改良且进展缓慢。随着现代生物学技术的发展，人们寄希望于利用基因工程育种技术培育高氮素吸收利用效率木本植物新品种，进而既可以实现农林生态***氮素高效利用的经济效益，也能实现减少土壤氮肥施加，保护生态环境的环保效益，具有重要理论与实践意义。
当今，对于植物高氮素吸收利用效率机理的研究已经有很多，但从总体上讲，国内外学者对植物高氮素吸收利用效率机理的研究多局限于生理层面，植物高氮素吸收利用效率的分子机制仍不清楚，严重限制了木本植物高氮素利用效率新品种培育。miRNAs及其靶基因作用机制的解析，是树木抗逆生理与分子生物学研究领域的前沿热点。针对木本植物特定组织中miRNAs对氮素响应作用机制的研究发现，为利用现代分子生物学手段，培育高氮素吸收效率木本植物新品种揭开了一个新视角。
同时，miRNA参与植物非生物胁迫应答响应是通过结合靶基因mRNA进行负调控实现的。如果仅通过生物信息学分析预测，将得到大量靶基因，验证难度巨大。而通过同一组织小RNA，降解组和转录组测序，并进行联合分析，会更加精准的获得参与植物非生物胁迫应答响应的miRNA及其靶基因，为鉴定木本植物特定组织对氮素响应这类复杂生理机制提供一个全新手段。
有鉴于此，本发明提出一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用，以解决现有技术中的不足之处。
发明内容
本发明的目的是提供了一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用，以解决现有技术中存在的上述技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的与木本植物铵态氮应答相关的miRNA，所述miRNA为铵态氮处理过程中上调的miRNA，其核苷酸序列为：
成熟体序列：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
前体序列：
ggttgagaggaatgttgtctggctcgaggtcattgaggccatgattatacagacatgacattacctgatgacagctgagaaaattcaaagtctgtgtgtatcttgcacctcgatgattcTCGGACCAGGCTTCATTCCTtccaacaaa；
所述miRNA的靶基因是真核翻译起始因子基因，所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程；
所述真核翻译起始因子基因全长序列：
ATTTGTTTGTTTGTTTGGTTCGTCAGTATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGAATGACAGATTTGATTTTGGTTTTTGGGTTGGTTCTAAACAATTGAGGCGCACTGATCAGTCGCCTGGTCGTGGTTTCTTGGCATCAGGCATCGTTTTCATTTGAAGGGCATTCAAGTGAGAGTTTGACAGACTATATACCAGGAGCACAACGCCCCTGTAATATTATCAATTGTTGAGTGACAATATTAATGCTGCCTATATAGCATATGATTAAATTGCAACCAATTTTTAGTTTTCTCTTTAATTTATTTTTAATTCACTGCTTCCTTTTCCCTTTTCTCCCTTGTGTAACCAAACATCCAAGACCTTCAAACATTTTCTGGATATCAAGAGGGAAAAATGGGTGAATCTGATCCTGAGATTGCTTAACCACA；
所述真核翻译起始因子基因CDS序列：
ATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGA。
上述的与木本植物铵态氮应答相关的miRNA的应用，其特征在于，在木本植物根系中生长发育和分化中，应用所述miRNA在铵态氮处理过程，包括：
所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程。
与现有技术相比，本发明所提供的与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用，miRNA(pc-miR166b)与参与木本植物根系对铵态氮的应答过程中有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，pc-miR166b的表达量在铵态氮处理和对照组处理样本间的差异极显著，本发明为培育高效吸收利用土壤氮素的木本植物新种质意义重大，适合于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例中pc-miR166b前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构。
图2为本发明实施例中eIF的5’UTR与pc-miR166b的结合位点示意图。
图3为本发明实施例中pc-miR166b和eIF在硝态氮处理/对照组中，木本植物根系中的相对表达量结果示意图。
图4为本发明实施例中pc-miR166b靶向eIF基因的烟草瞬时转化结果示意图。
图5为本发明实施例中转染pc-miR166b后，进行烟草铵态氮处理后，pc-miR166b的表达和eIF表达情况示意图。
图6a、图6b分别为本发明实施例中转染pc-miR166b后，进行烟草铵态氮处理后，烟草植株NH4 +和NO3 -含量测定示意图。
序列表
1、miRNA成熟体序列；
2、miRNA前体序列；
3、真核翻译起始因子基因全长序列；
4、真核翻译起始因子基因CDS序列；
5、miRNA上游引物；
6、miRNA下游引物；
7、5.8s rRNA上游引物；
8、5.8s rRNA下游引物。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，这并不构成对本发明的限制。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
首先对本文中可能使用的术语进行如下说明：
术语“和/或”是表示两者任一或两者同时均可实现，例如，X和/或Y表示既包括“X”或“Y”的情况也包括“X和Y”的三种情况。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”或其它类似语义的描述，应被解释为非排它性的包括。例如：包括某技术特征要素(如原料、组分、成分、载体、剂型、材料、尺寸、零件、部件、机构、装置、步骤、工序、方法、反应条件、加工条件、参数、算法、信号、数据、产品或制品等)，应被解释为不仅包括明确列出的某技术特征要素，还可以包括未明确列出的本领域公知的其它技术特征要素。
术语“由……组成”表示排除任何未明确列出的技术特征要素。若将该术语用于权利要求中，则该术语将使权利要求成为封闭式，使其不包含除明确列出的技术特征要素以外的技术特征要素，但与其相关的常规杂质除外。如果该术语只是出现在权利要求的某子句中，那么其仅限定在该子句中明确列出的要素，其他子句中所记载的要素并不被排除在整体权利要求之外。
术语“质量份”是表示多个组分之间的质量比例关系，例如：如果描述了X组分为x质量份、Y组分为y质量份，那么表示X组分与Y组分的质量比为x:y；1质量份可表示任意的质量，例如：1质量份可以表示为1kg也可表示3.1415926kg等。所有组分的质量份之和并不一定是100份，可以大于100份、小于100份或等于100份。除另有说明外，本文中所述的份、比例和百分比均按质量计。
除另有明确的规定或限定外，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如：可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本文中的具体含义。
当浓度、温度、压力、尺寸或者其它参数以数值范围形式表示时，该数值范围应被理解为具体公开了该数值范围内任何上限值、下限值、优选值的配对所形成的所有范围，而不论该范围是否被明确记载；例如，如果记载了数值范围“2～8”时，那么该数值范围应被解释为包括“2～7”、“2～6”、“5～7”、“3～4和6～7”、“3～5和7”、“2和5～7”等范围。除另有说明外，本文中记载的数值范围既包括其端值也包括在该数值范围内的所有整数和分数。
术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述和简化描述，而不是明示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本文的限制。
本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。本发明实施例中未注明具体条件者，按照本领域常规条件或制造商建议的条件进行。本发明实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的与木本植物铵态氮应答相关的miRNA，所述miRNA为铵态氮处理过程中上调的miRNA，其核苷酸序列为：
成熟体序列：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
前体序列：
ggttgagaggaatgttgtctggctcgaggtcattgaggccatgattatacagacatgacattacctgatgacagctgagaaaattcaaagtctgtgtgtatcttgcacctcgatgattcTCGGACCAGGCTTCATTCCTtccaacaaa；
所述miRNA的靶基因是真核翻译起始因子基因，所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程；
所述真核翻译起始因子基因全长序列：
ATTTGTTTGTTTGTTTGGTTCGTCAGTATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGAATGACAGATTTGATTTTGGTTTTTGGGTTGGTTCTAAACAATTGAGGCGCACTGATCAGTCGCCTGGTCGTGGTTTCTTGGCATCAGGCATCGTTTTCATTTGAAGGGCATTCAAGTGAGAGTTTGACAGACTATATACCAGGAGCACAACGCCCCTGTAATATTATCAATTGTTGAGTGACAATATTAATGCTGCCTATATAGCATATGATTAAATTGCAACCAATTTTTAGTTTTCTCTTTAATTTATTTTTAATTCACTGCTTCCTTTTCCCTTTTCTCCCTTGTGTAACCAAACATCCAAGACCTTCAAACATTTTCTGGATATCAAGAGGGAAAAATGGGTGAATCTGATCCTGAGATTGCTTAACCACA；
所述真核翻译起始因子基因CDS序列：
ATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGA。
上述的与木本植物铵态氮应答相关的miRNA的应用，在木本植物根系中生长发育和分化中，应用所述miRNA在铵态氮处理过程，包括：
所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程。
所述miRNA表达水平及其下调真核翻译起始因子基因的表达是利用RT-qPCR检测，并根据木本植物根组织中所述miRNA的表达水平，判断木本植物响应氮素的能力并进行筛选。
所述植物为杨树或烟草。
检测木本植物杨树根组织中的所述miRNA表达水平，包括如下步骤：
(1)提取杨树根组织中含有miRNA的总RNA；
(2)设计目标miRNA和内参基因5.8s rRNA的引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；
(3)采用miRNA特异的正向引物，以及通用下游引物，利用荧光定量PCR试剂盒进行miRNA和内参基因的扩增；
(4)扩增后利用2-△△Ct法计算获得miRNA的表达水平。
所述荧光定量PCR试剂盒包括反转录试剂、miRNA引物、内参基因5.8s rRNA引物和荧光定量PCR反应试剂；
miRNA上游引物为：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
miRNA下游引物为：AACGAGACGACGACAGACTTTTTTTTTTTTTTTNN；
5.8s rRNA上游引物为：CTCGGCTCTCGCATCGATGA；
5.8s rRNA下游引物为：AGACGTGCCCTCGACCAAGA。
所述miRNA应用于林木遗传育种，能培育高效吸收利用土壤氮素的木本植物新种质。
综上所述，本发明深入了解miRNAs参与木本植物根系对铵态氮的应答过程，对利用分子育种技术培育高氮素吸收利用效率植物新品种意义重大。
本发明提出的miRNA(pc-miR166b)与参与木本植物根系对铵态氮的应答过程中有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，pc-miR166b的表达量在铵态氮处理和对照组处理样本间的差异极显著，同时本发明提出的miRNA可应用于培育高氮素吸收利用效率植物新品种，并且本发明提出的检测pc-miR166b表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从木本植物根系RNA提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。
为了更加清晰地展现出本发明所提供的技术方案及所产生的技术效果，下面以具体实施例对本发明实施例所提供的进行详细描述。
实施例1
根据图1所示，本实施例提出基于小RNA，转录组和降解组测序技术，并结合生物信息学联合分析获得木本植物铵态氮应答相关的miRNA(pc-miR166b)及其靶基因真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIF)。
(1)实验植物和样本准备
以2月龄的灰杨水培苗为实验素材来源。对其进行NH4 +处理，处理时长为10天。处理后选取灰杨根系进行收获。所有收获样品迅速置于液氮中，放于-80℃冰箱备用。
将处理组和对照组灰杨根系样本采样后，为了获得足够的材料进行进一步分析，将3株植物的样本均匀混合作为一个重复。每组各选取3个重复样本作为实验组灰杨根系样本和对照组灰杨根系样本。并将选出的实验组、对照组灰杨根系样本利用商用试剂盒提取总RNA，然后分别构建用于miRNA和mRNA测序的cDNA文库，最后将构建好的文库送测序公司进行测序。
(2)基于高通量测序结果分析表达差异miRNA和mRNA
将获得的测序结果进行分析，将两组实验灰杨根系样本测序结果，利用transcripts per million(TPM)对miRNAs表达水平进行定量。使用miRNA在铵态氮处理下的TPM除以对照的TPM来计算这个miRNA的差异倍数(Fold change，FC)。差异表达的miRNAs筛选阈值为：P<0.05。采用Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped(FPKM)对mRNAs表达水平进行定量。基于FPKM值，使用Ballgown package计算mRNAs的差异表达水平。使用mRNAs在铵态氮处理下的FPKM除以对照的FPKM来计算这个基因的差异倍数(Foldchange，FC)。差异表达的mRNAs的筛选阈值为：log2(FC)≥1或≤-1，P<0.05。
高通量测序分析表达差异miRNA结果表明，相比较于对照，铵态氮处理条件下，木本植物根中pc-miR166b显著上调表达。同时，根据灰杨数据库，调取其前体序列发现，其前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征，如图1所示。
(3)差异表达miRNA和mRNA联合分析进行关键miRNA筛选
利用降解组测序数据，采用CleaveLand软件(3.0.1版本)预测miRNAs的靶基因。同时利用转录组数据联合分析相关miRNAs靶基因的表达模式。通过进一步分析发现，差异表达miRNA的靶基因eukaryotic translation initiation factor(eIF)为真核翻译起始因子家族成员。
靶基因预测结果表明，eIF的5’UTR区与pc-miR166b的转录调控区有15个碱基互补结合，如图2所示。
在铵态氮处理过程中，eIF为下调基因，与对照组相比，铵态氮处理组中pc-miR166b表达量升高，符合miRNA具有负调控功能的特点，即miRNA对能够负调控靶基因转录，因此，在铵态氮处理过程中，pc-miR166b表达上调，通过抑制eIF的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程。
实施例2
根据图3所示，本实施例提出验证pc-miR166b标记与铵态氮处理相关性的方法，用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对测序获得的关键pc-miR166b及其靶基因(eIF)的表达进行样本鉴定。
(1)实验样本准备
取2月龄的灰杨水培苗18株。半数进行铵态氮处理，半数作为对照组。经NH4 +处理10天后。收获灰杨根系后迅速放入液氮中冻存。然后将3株植物的样本均匀混合作为一个重复。每组各选取3个重复样本。
(2)pc-miR166b差异表达验证
提取灰杨根系总RNA：利用RNA提取试剂盒(TRK1001,联川生物,中国)提取总RNAs，eIF mRNA反转录及定量的条件为：利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)进行反转录；
TB Green qRT-PCR kit(TaKaRa，日本)进行qRT-PCR；
引物为(F：CTCGCTCACAACCTGTTGAA；
R：TGGGCGAATGATTAATGTCA)检测每次设置3个平行管反应；
以Actin作为内参，引物序列为(F：CCCATTGAGCACGGTATTGT；
R：TACGACCACTGGCATACAGG)。
PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；
pc-miR166b定量的条件为：利用试剂盒进行反转录PrimeScriptTM RT reagentKit(TaKaRa，日本)试剂盒进行反转录，TB Green qRT-PCR kit(TaKaRa，日本)进行qRT-PCR；
PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)；
引物为(F：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
R：AACGAGACGACGACAGACTTTTTTTTTTTTTTTNN)检测每次设置3个平行管反应；
以5.8s rRNA作为miRNA的内参基因：物序列为(F：CTCGGCTCTCGCATCGATGA；R：AGACGTGCCCTCGACCAAGA)。
PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；
miRNA和基因的表达量利用2-△△Ct法进行计算，统计采用t检验，log2(FC)≥1或≤-1和P＜0.05定义为有统计学意义，分析各组之间的表达差异。
qPCR结果表明，pc-miR166b表达量与eIF基因表达量在铵态氮处理组和对照组间差异极显著，同时qPCR结果与测序结果相吻合。结果如图3所示。
实施例3
根据图4所示，本实施例提出对木本植物杨树根中eIF基因表达及参与铵态氮响应的调控。
烟草瞬时转化pc-miR166b和eIF载体的构建
eIF载体构建：根据灰杨基因组数据库得到eIF(Potri.007G119200)基因的全长序列设计引物，提取灰杨根组织中的RNA，并反转录为cDNA，利用PCR方法，扩增eIF基因的全长序列，然后经回收、纯化等步骤，将目的片段克隆到pCAMBIA1300载体中；具体的实验步骤包括：根据灰杨基因组数据库得到Potri.007G119200基因的全长序列，针对克隆载体pCAMBIA1300序列的酶切位点SpeI和KpnI，在TaKaRa网站上设计引物引物为(F：ACATTTAAATACTAGTATGATGAAGCCTGGTTCGG；
R：CCCTTGCTCACCATGTCAGTAACCATTTATCCAATGTCG)。以灰杨根系为材料，利用RNA提取试剂盒(TRK1001,联川生物,中国)提取总RNAs，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)进行反转录；
利用高保真酶PrimeSTARMax RNA Polymerase进行序列扩增，随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段胶回收，操作步骤参照胶回收试剂盒(天根，中国)进行。利用Nanodrop检测浓度和质量。
pc-miR166b载体构建：根据包括pc-miR166b茎环结构的前后200bp序列设计引物，提取灰杨根组织中的DNA，利用PCR方法，扩增包括pc-miR166b茎环结构前后200bp的序列，然后经回收、纯化等步骤，将目的片段克隆到pCAMBIA2300载体中；
具体的实验步骤包括：根据包括pc-miR166b茎环结构前后200bp序列，针对克隆载体pCAMBIA2300序列的酶切位点KpnI和XbaI，在TaKaRa网站上设计引物，引物为(F：TTTGGAGAGGACAGGCTGGCTCGAAGCTTAAGC；
R：GCAGGTCGACTCTAGTTACATGGATAGACCTTCAGATTCC)。
以灰杨根系为材料，利用植物DNAzol提取试剂盒(Invitrogen，美国)提取DNAs，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)进行反转录；利用高保真酶PrimeSTARMaxRNA Polymerase进行序列扩增，随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段胶回收，操作步骤参照胶回收试剂盒(天根，中国)进行。利用Nanodrop检测浓度和质量。
烟草瞬时转化实验验证eIF与pc-miR166b的靶向结合
将上述测序正确的eIF全长序列以及包含pc-miR166b茎环结构的序列分别克隆到pCAMBIA1300和pCAMBIA2300载体上。随后，将克隆的pCAMBIA1300-eIF和pCAMBIA2300-miR166b载体通过点击转化到农杆菌菌株GV3101中。分别将克隆的pCAMBIA1300-eIF和pCAMBIA2300-miR166b农杆菌细胞挑取单克隆，28℃过夜培养摇菌。试验分为对照组和处理组，具体分组如下：
a.处理组(pCAMBIA1300-eIF和pCAMBIA2300-miR166b表达载体共转染)；
b.对照组(NC)：pCAMBIA1300-eIF和pCAMBIA2300、pCAMBIA2300-miR166b和pCAMBIA1300表达载体共转染；
c.空白对照组(BC)：载体pCAMBIA1300和pCAMBIA2300表达载体分别转染；将处理组，对照组和空白对照组分别进行烟草叶肉细胞注射。
瞬转2天后采收叶片，利用基因特异性引物进行qRT-PCR分析。所采取步骤以及引物如实施案例2所用。
选择烟草5.8s rRNA，引物为(F：ACGTCTGCCTGGGTGTCACAA；
R：GCGAGCACAGAATTAATACGAC)和烟草tublin基因，引物为(F：ATGAGAGAGTGCATATCGAT；R：TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA)分别作为pc-miR166b和eIF的内参基因，分别对miRNAs和靶基因进行qPCR验证。PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；
eIF基因的表达量利用2-△△Ct法进行计算，统计采用t检验，P＜0.05定义为有统计学意义，分析各组之间的表达差异。
qPCR结果表明，eIF基因的表达量在单独瞬时转化pCAMBIA2300-miR166b时有所下降，这说明eIF基因受到了pc-miR166b的切割而被降解，表达量有所下降。同时，在pCAMBIA1300-eIF和pCAMBIA2300-miR166b共同瞬时转化烟草叶肉细胞后，eIF基因的表达量有所回升，说明pc-miR166b确实为eIF基因的靶基因。结果如图4所示。
实施例4
(1)根据图5所示，本实施例提出对烟草叶片进行瞬时转染pc-miR166b，进行铵态氮处理后，pc-miR166b的表达和eIF表达情况。
将上述瞬时转染的烟草进行铵态氮处理10天后，收获其植株，进行pc-miR166b和eIF基因的表达分析。所述试剂盒包括：RNA提取试剂盒、反转录试剂、荧光定量PCR试剂盒；
提取烟草植物总RNA：利用RNA提取试剂盒(TRK1001,联川生物,中国)提取总RNAs，eIF mRNA反转录及定量的条件为：利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)进行反转录；
TB Green qRT-PCR kit(TaKaRa，日本)进行qRT-PCR；
引物为(F：CTCGCTCACAACCTGTTGAA；R：TGGGCGAATGATTAATGTCA)检测每次设置3个平行管反应；
烟草tublin基因，引物为(F：ATGAGAGAGTGCATATCGAT；R：TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA)。
PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；
pc-miR166b定量的条件为：利用试剂盒进行反转录PrimeScriptTM RT reagentKit(TaKaRa，日本)试剂盒进行反转录，TB Green qRT-PCR kit(TaKaRa，日本)进行qRT-PCR；PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)；
引物为(F：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
R：AACGAGACGACGACAGACTTTTTTTTTTTTTTTNN)检测每次设置3个平行管反应；
烟草5.8s rRNA，引物为(F：ACGTCTGCCTGGGTGTCACAA；R：GCGAGCACAGAATTAATACGAC)。
PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；
图一miRNA和基因的表达量利用2-△△Ct法进行计算，统计采用t检验，log2(FC)≥1或≤-1和P＜0.05定义为有统计学意义，分析各组之间的表达差异。
qPCR结果表明，对烟草叶片进行瞬时转染pc-miR166b，进行铵态氮处理后，与没有进行铵态氮处理的对照相比，pc-miR166b的表达量有所上升，其靶基因eIF表达量下降，说明pc-miR166b和靶基因eIF受铵态氮调控，结果如图5所示。
实施例5
(1)根据图6a、图6b所示，本实施例提出对烟草叶片进行瞬时转染pc-miR166b后，进行铵态氮处理后，烟草植株NO3 -和NH4 +含量测定。
烟草植株中的NH4 +含量测定。大约100mg的鲜样中加入1.5m L提取液(100mM HCl，500μL氯仿)，4℃下震荡15min后进行离心(10000g，4℃，10min)。离心后，水相被转移至新的2mL离心管中，并且加入50mg活性炭，混匀，再次离心(12000g，4℃，10min)。然后大约100μL上清液与500μL 1％(w/v)苯酚-0.005％(w/v)硝普钠溶液混合，随后加入500μL 1％(v/v)次氯酸钠-0.5％(w/v)氢氧化钠溶液，混合液在37℃下培养30min后在620nm处测定吸光值。
烟草植株中的NO3 -含量测定。大约100mg的新鲜样品粉末中加入1mL去离子水，然后45℃水浴1h。离心(5000g，20℃，15min)后，上清液用于NO3-含量的测定。0.2m L上清液和0.8m L 5％(w/v)水杨酸(用浓H2SO4配置)混合，室温下放置20min后，加入19mL 2M NaOH使pH高于12。待溶液冷却到室温，测定其在410nm处的吸光值。
烟草植株NO3 -和NH4 +含量测定结果表明，对烟草叶片进行瞬时转染pc-miR166b，进行铵态氮处理后，与没有进行铵态氮处理的对照相比，铵态氮浓度显著调高，而硝态氮浓度显著下降。这说明pc-miR166b受铵态氮调控，同时影响植物对硝态氮和铵态氮的吸收利用效率，结果如图6a、图6b所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。本文背景技术部分公开的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
/>
/>
/>
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序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> miRNA成熟体序列()
<400> 1
<210> 2
<211> 148
<212> DNA
<213> miRNA前体序列()
<400> 2
gttgagagga atgttgtctg gctcgaggtc attgaggcca tgattataca gacatgacat 60
tacctgatga cagctgagaa aattcaaagt ctgtgtgtat cttgcacctc gatgattctc 120
caacaaa 127
<210> 3
<211> 2124
<212> DNA
<213> 真核翻译起始因子基因全长序列()
<400> 3
<210> 4
<211> 1722
<212> DNA
<213> 真核翻译起始因子基因CDS序列()
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> miRNA上游引物()
<400> 5
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> miRNA下游引物()
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 5.8s rRNA上游引物()
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 5.8s rRNA下游引物()
<400> 8

Claims (1)

1.一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA为铵态氮处理过程中上调的miRNA，其核苷酸序列为：
成熟体序列：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
前体序列：
ggttgagaggaatgttgtctggctcgaggtcattgaggccatgattatacagacatgacattacctgatgacagctga gaaaattcaaagtctgtgtgtatcttgcacctcgatgattcTCGGACCAGGCTTCATTCCTtccaacaaa；
所述miRNA的靶基因是真核翻译起始因子基因，所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程；
所述真核翻译起始因子基因全长序列：
ATTTGTTTGTTTGTTTGGTTCGTCAGTATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGAATGACAGATTTGATTTTGGTTTTTGGGTTGGTTCTAAACAATTGAGGCGCACTGATCAGTCGCCTGGTCGTGGTTTCTTGGCATCAGGCATCGTTTTCATTTGAAGGGCATTCAAGTGAGAGTTTGACAGACTATATACCAGGAGCACAACGCCCCTGTAATATTATCAATTGTTGAGTGACAATATTAATGCTGCCTATATAGCATATGATTAAATTGCAACCAATTTTTAGTTTTCTCTTTAATTTATTTTTAATTCACTGCTTCCTTTTCCCTTTTCTCCCTTGTGTAACCAAACATCCAAGACCTTCAAACATTTTCTGGATATCAAGAGGGAAAAATGGGTGAATCTGATCCTGAGATTGCTTAACCACA；
所述真核翻译起始因子基因CDS序列：
ATGATGAAGCCTGGTTCGGACCGAAATGCGTCGGCAAATTGGGGAAATAATTTGATGCGGCCGAAGTCGTCAGGGGCTGCTCGTGGTTTTGATGAGAAAGCTTCGTTTTTATCTCACCCGGCGCCTATAGGTAGAAACTTTGATGAGGATGAGCGTAAGCCGTTGGATGGTTCATCTGCTCCTCGTCGTACTATTAGTGATGAAAATGTTCGTGCTTCGGCTTTGGTTCCTCAAGAGTTGAAGCCGGAGTATGTTTCTAGTTCGTCTGTTAGGGTGCCGGATAGACCAGTGACAAGTCCGGTACCACAGTCTATGAGTTTGGGAGCGAGTTTGTCTCCGTTGAGACCGGGAGGGGTTTCGGTTGTAGTTAGTTCGCAGAATTCGGGTGGTTGGGGGAGTAATTCAGCTATAACAAGTGGTGGTAATGTTCAGGGTGTGAATAATAATCCTCCGAATGCCTGGGGGATGAGGAGGGATGTGATGGGTGTTAATGCCTCGAGGGGTTCATCTGTGTCGCCGGCATCGAATCCGGTGTCAAAGTTTGCTCAAGCAAGTGCGCTTGAAAAGGTATCTTCAGGATTGTGGCAGTCAAAGAGTCCTGGTGAACTTCTACCACATTTGATTTATTCACAGGAGAGTAATGCAAGTCATAGTGTGGATGTGGGTAGGGAGAGGGGTGATTATGATAATTCAAGGGGAGGTCAAGCTGAAAGTGACAGGGTCACAGGAGATAGGAATCAGGGTGGGGGGAGGACATTGCCGAATCATAGGAGGGATCAACCTCAAATGCACTTGGAAGAGTTTCATAGTGGAGGTATTGTCAGCTCGCAAACTCGACCAGCAATGCCCCCAGAAGTATCAGAACGACCTAAGCTGAATGTTATTGCAAGAACTAAAGCATTAGAGAGACCAGAAAATGACTACAGACAGGGGTACCAGCAACCTGTAGTATCTGGGAAGATTGAAATTGCCCATGAATTGTATGGAAATGGAAATCCTTCAAAGCCAGGGTTGGCGGATACCAAGAGTGGTAGTCAGCCAGCTGAGAGACCACTTGAACGTCCCAAATTGAATTTGAAGCCTCGCTCACAACCTGTTGAACAATCTGATGGAAGCCTTGAAAGAGAAAGGAGTTCATTGTTCGGCGGTGCTCGTCCACGGGAATTGGTTCTCAAGGAACGAGGTGTAGATGACATAGCAATTAATAACCTTGACATTAATCATTCGCCCAACAGGGTGAATTCTCCCAAGAATGAACTCACATCAGAACATGTGGCTCCAACCGCTCATCAGAGTCAGAAAAATGACAACCGTGGGGCTACCAGCAGAAGAAACGGGAGGGATTCTGAGAGGAAAGATCAACAGATGGACCATGAGAAAACTGATATGGAAAGGAAGAACTGGAGGAATGATAAATGGAAAAGCAGCAAGGATGCCAAGGACCAGCGACCTGAACCTGAAACCTGGCGCAAACCTAATGAAGAACCAAAAACTTCATCTGACGCCGCAGGAAACCGCCCTGGTAAAGTATCATCTGCCTTGGAGCTAGCTCAGGCTTTCTCAAAGTCAGCCTCTGATCCAAAGAGTCAGAATATACCTTCTTCTCAGAGAGGCGCGCCTGCAGGTAATGATCAGCCCTTTTCACGACTGACAGACACCCGTGAGCATCACCCAGCACCAACCACAGAGCCAACCACACGACATTGGATAAATGGTTACTGA；
在木本植物根系中生长发育和分化中，应用所述miRNA在铵态氮处理过程，包括：
所述miRNA通过下调真核翻译起始因子基因的表达，参与木本植物根系对铵态氮的应答过程；
所述miRNA表达水平及其下调真核翻译起始因子基因的表达是利用RT-qPCR检测，并根据木本植物根组织中所述miRNA的表达水平，判断木本植物响应氮素的能力并进行筛选；所述植物为杨树或烟草；
检测木本植物杨树根组织中的所述miRNA表达水平，包括如下步骤：
(1)提取杨树根组织中含有miRNA的总RNA；
(2)设计目标miRNA和内参基因5.8s rRNA的引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；
(3)采用miRNA特异的正向引物，以及通用下游引物，利用荧光定量PCR试剂盒进行miRNA和内参基因的扩增；
(4)扩增后利用2-△△Ct法计算获得miRNA的表达水平；
所述荧光定量PCR试剂盒包括反转录试剂、miRNA引物、内参基因5.8s rRNA引物和荧光定量PCR反应试剂；
miRNA上游引物为：TCGGACCAGGCTTCATTCTT；
miRNA下游引物为：AACGAGACGACGACAGACTTTTTTTTTTTTTTTNN；
5.8s rRNA上游引物为：CTCGGCTCTCGCATCGATGA；
5.8s rRNA下游引物为：AGACGTGCCCTCGACCAAGA；
所述miRNA应用于林木遗传育种，能培育高效吸收利用土壤氮素的木本植物新种质。
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