附图描述
图1(图1A至C)说明如何能实施根据本发明的方法以在选择期间分离感兴趣的细胞,例如用于植物育种和靶向选择策略。图1A显示用碱基编辑器(BE)或BE复合物,和编辑试剂,即包含位点特异性核酸酶(SSN)的位点特异性效应物,在两个不同基因组位置处平行地处理细胞。箭头指示靶位点,其中所述碱基编辑器(复合物)和所述位点特异性效应物将引入两个靶位点特异性修饰。图1B显示了图1A中所示的前一步骤的结果,即BE(复合物)在感兴趣的基因处引入修饰的表型,以白色突出显示,而位点特异性效应物在性状基因中诱导靶向编辑,以黑色突出显示。因此,两个不同基因组靶位点内的两种不同修饰允许从处理的细胞中分离植物细胞或植物。然后可以针对在感兴趣的基因处的编辑筛选植物,这通常与用于筛选目的的修饰表型不同。图1C显示了分离植物以获得所需基因型后的结果。这种期望的感兴趣的基因型包含通过位点特异性效应物引入的靶向修饰(黑色),但不再包含修饰的表型修饰,后者已被引入用于选择目的,但不作为在这个例子中所得的植物细胞、组织、器官或完整植物的基因组包含的基因组性状。
图2说明通过共同编辑TaALS S1位点增强的筛选效率。
图3说明通过编辑TaALS-P173产生除草剂抗性小麦。
图4说明通过编辑ZmALS-P165除草剂抗性玉米的产生。
图5显示玉米中编辑的序列结构和除草剂抗性位点。
图6说明ZmALS-P197和ZmALS-G654的有效编辑。
图7显示将ZmALS-P197和ZmALS-G654转化成期望的除草剂抗性赋予残基的效率。
序列:
SEQ ID NO:1是APOBEC1(大鼠胞苷脱氨酶)-XTEN接头的核苷酸序列(参见例如Schellenberger et al.,"A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner",Nature Biotechnol.27,1186-1190(2009))-nCas9(D10A)-UGI(尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂)-NLS编码构建体,其未经密码子优化。该序列包括3'终止密码子TAA。
SEQ ID NO:2是APOBEC1-XTEN接头-nCas9(D10A)-UGI-NLS编码构建体的核苷酸序列,其经密码子优化用于谷类植物。该序列包括3'终止密码子TAG。
SEQ ID NO:3代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_ALS1&2_P197S/L/F的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥ALS同系物中残基的坐标。该序列适用于SpCas9衍生的(化脓性链球菌Cas9衍生的)编辑器。
SEQ ID NO:4代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_ALS1&2_P197S/L/F示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥ALS同系物中残基的坐标。该序列适用于SaKKH-BE3衍生的编辑器(SaCas9的具有放松的PAM特异性的金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)衍生的突变体)。
SEQ ID NO:5代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_ALS1&2_P197S/L/F的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥ALS同系物中残基的坐标。该序列适用于基于VQR-BE3的编辑器(SaCas9的具有不同PAM特异性的金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)衍生的突变体)。
SEQ ID NO:6代表Zm_ALS1&2_S653N的示例性前间隔区序列,用于B73参考基因型的碱基编辑。位置基于拟南芥ALS同系物中残基的坐标。该序列适用于SpCas9衍生的编辑器。
SEQ ID NO:7代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_PPO_A220_&_G221的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于SpCas9的编辑器。
SEQ ID NO:8代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_PPO_A220_&_G221的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于SaKKH-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:9代表用于B73参照基因型的碱基编辑的Zm_PPO_A220_&_G221的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于VQR-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:10代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_PPO_C215的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于SpCas9的编辑器。
SEQ ID NO:11代表用于B73参考基因型的碱基编辑的Zm_PPO_C215的示例性前间隔区序列。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于SaKKH-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:12代表Zm_PPO_C215的示例性前间隔区序列,用于B73参考基因型的碱基编辑。该位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于SaKKH-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:13代表Zm_PPO_C215的示例性前间隔区序列,用于B73参考基因型的碱基编辑。该位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于VQR-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:14是密码子优化的APOBEC1-XTEN接头-CasX1-UGI-NLS编码构建体的核苷酸序列。该序列包括3'终止密码子TAG。
SEQ ID NO:15是密码子优化的APOBEC1-XTEN接头-AsCpf1(R1226A)(具有R1226A突变的氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)Cpf1)-UGI-NLS编码构建体的核苷酸序列。该序列包括3'终止密码子TAG。
SEQ ID NO:16是编码NLS-dCas9-NLS-接头-PmCDA1(来自海洋七鳃鳗(sealamprey)的活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)直系同源物PmCDA1,参见Nishida et al.(Science 2016,vol.353,issue 6305,aaf8729))-UGI的构建体的核苷酸序列。该序列包括3'终止密码子TAG。
SEQ ID NO:17是编码示例性Cas9切口酶n(i)Cas9(D10A)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是编码示例性CasX的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是编码示例性AsCpf1(R1226A)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是编码示例性APOBEC1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是编码示例性UGI的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是编码示例性PmCDA1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23代表Zm_PPO_N425_&Y426的示例性前间隔区序列,用于用于B73参考基因型的碱基编辑。位置基于拟南芥PPO同系物中残基的坐标。该序列适用于基于VQR-BE3的编辑器。
SEQ ID NO:24是氨基酸球菌属BV3L6Cpf1(AsCpf1)的序列,UniProtKB/Swiss-Prot标识符:U2UMQ6.1。
SEQ ID NO:25是来自拟南芥(GenBank:AAW70386)的乙酰乳酸合酶(ALS)(叶绿体)的序列。
SEQ ID NO:26是拟南芥原卟啉原氧化酶(PPO)的序列。
SEQ ID NO:27是拟南芥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)在叶绿体转运肽去除后的成熟蛋白质的序列;NCBI登录号AAY25438。
SEQ ID NO:28是长芒苋(Agranthus tuberculatus)线粒体原卟啉原氧化酶(PPX2L)的序列,参见NCBI登录号DQ386114。
定义
必须注意的是,除非上下文另有明确规定,否则如本文所用,单数形式“一个”,“一种”和“该”包括复数形式。例如,对一种组件的引用也旨在包括多个组件的组成。对含有“一”组分的组合物的引用旨在包括除了所述组分之外的其他组分。换句话说,术语“一个”,“一种”和“该”不表示数量的限制,而是表示存在“至少一个”所引用的项目。每个术语旨在涵盖本领域技术人员所理解的其最广泛的含义,并且包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
范围可以在本文中表述为从“大约”或“近似”或“基本上”一个特定值和/或至“大约”或“近似”或“基本上”另一特定值。当表达这样的范围时,其他示例性实施实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。此外,术语“约”意指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内,这将部分取决于如何测量或确定该值,即测量***的限制。例如,根据本领域的实践,“约”可意味着在可接受的标准偏差内。或者,“约”可以表示给定值的最高±20%,优选最高5至±10%,更优选最高±5%,更优选最高±1%的范围。或者,特别是关于生物***或过程,该术语可以意指数值的一个数量级内,优选在2倍内。在本申请和权利要求中描述特定值时,除非另有说明,否则术语“约”是隐含的,并且在本文中意味着在特定值的可接受的误差范围内。
“包含”或“含有”或“包括”是指至少所述化合物、元件、颗粒或方法步骤存在于组合物或制品或方法中,但不排除存在其他化合物、材料、颗粒、方法步骤,即使其他这样的化合物、材料、颗粒、方法步骤与所指明的那些具有相同的功能。
本文所用的术语“催化活性片段”指的是氨基酸序列,其是指从给定模板氨基酸序列或编码其的核酸序列衍生的核心序列,包含模板序列的全部或部分活性位点,条件是所得到的催化活性片段仍具有天然酶或其变体的活性位点负责的表征模板序列的活性。所述修饰适于产生仍具有与模板序列相同活性的较小体积氨基酸序列,使得催化活性片段成为空间上不太苛刻的更通用或更稳定的工具。
如本文所用的“互补”或“互补性”描述了两种DNA、两种RNA之间的关系,或对于根据本发明的杂交序列,RNA和DNA核酸区域之间的关系。由DNA或RNA的核碱基定义,两个核酸区域可以根据锁钥模型彼此杂交。为此,Watson-Crick碱基配对的原理基于腺嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶以及鸟嘌呤和胞嘧啶分别作为互补碱基。此外,非沃森-克里克配对,如反向沃森-克里克、Hoogsteen、反向Hoogsteen和摆动配对包含在本文中使用的术语“互补”中,只要各个碱基对可以彼此形成氢键键合,即基于所述互补性,两条不同的核酸链可以彼此杂交。
本文所用的术语“构建体”尤其是“遗传构建体”或“重组构建体”(在本文中可互换使用)指包含以下的构建体:质粒或质粒载体、粘粒、人工酵母-或细菌人工染色体(YAC和BAC)、噬粒、基于细菌噬菌体的载体、表达盒、分离的单链或双链核酸序列,其含有DNA和RNA序列或氨基酸序列,包括修饰病毒在内的病毒载体,其组合或混合物,用于引入或转化、转染或转导入本公开所述的靶细胞或植物、植物细胞、组织、器官或材料。本发明所述重组构建体可以包括效应结构域,采用核酸或氨基酸序列形式,其中效应结构域代表分子,其能在靶细胞中产生作用并包括转基因、单链或双链RNA分子,包含指导RNA、miRNA或siRNA,或氨基酸序列,包括例如酶或其催化活性片段、结合蛋白、抗体、转录因子、核酸酶优选位点特异性核酸酶等。此外,重组构建体可以包括调控序列和/或定位序列。重组构建体可以整合入载体,包括质粒载体,和/或其可以与载体结构分离的形式存在,例如以多肽序列形式或作为非载体连接的单链或双链核酸。其引入后,如通过转化,遗传构建体可以保持染色体外,即未整合入靶细胞基因组,例如采用双链或单链DNA、双链或单链RNA形式或作为氨基酸序列。或者,本公开所述遗传构建体或其部分能稳定整合入靶细胞基因组,包括靶细胞的核基因组或其它遗传元件,包含质体基因组,如线粒体或叶绿体。用于此关联的术语“质粒载体”指最初获自质粒的遗传构建体。
如本文所用,术语“递送构建体”或“递送载体”是指用作用于运输感兴趣的核酸(包含RNA和DNA的杂交核酸)和/或氨基酸序列货物进入靶细胞,优选真核细胞的任何生物或化学手段。本文所用的术语“载体”指递送本公开所述遗传或重组构建体到靶细胞、组织、器官或植物的转运工具。载体因而包括核酸序列任选包括序列如调控序列或定位序列以用于直接或间接递送到感兴趣靶细胞或植物所需细胞区室中的植物靶结构。载体也能用于引入氨基酸序列到靶细胞或靶结构。通常,本文所用的载体可以是质粒载体。术语“直接引入”指含有本公开所述待修饰核酸序列的所需靶细胞或靶结构直接转化或转导或转染到感兴趣的特定靶细胞,其中用载体递送的材料会发挥其作用。术语“间接引入”指在某一结构中实现引入,例如叶的细胞或者植物器官或组织的细胞,其自身不代表待转化的实际感兴趣靶细胞或结构,但这些结构用作***性传播和转移载体(优选包括本公开所述遗传构建体)到实际植物靶结构(例如分生细胞或组织)的基础。在术语“载体”用于转染氨基酸序列到靶细胞的上下文中,术语“载体”指用于肽或蛋白转染的合适试剂,例如离子脂质混合物、细胞穿透肽(CPP)或粒子轰击。在引入核酸材料的上下文中,术语“载体”不仅能指质粒载体,也指能用作引入核酸或氨基酸序列递送(例如通过粒子轰击方式)到感兴趣靶细胞的基础的合适载体材料。所述载体材料包括例如金或钨粒子。最后,术语“载体”也指使用病毒载体引入至少一种本公开所述遗传构建体,如修饰的病毒例如衍生自以下病毒株:玉米条纹病毒(MSV)、大麦条斑花叶病毒(BSMV)、雀麦花叶病毒(BMV,登录号:RNA1:X58456;RNA2:X58457;RNA3:X58458)、玉米斑纹病毒(MSpV)、玉米雷亚多非纳病毒(MYDV)、玉米黄矮病毒(MYDV)、玉米矮花叶病毒(MDMV),以下的的正链RNA病毒:甜菜坏死黄脉病毒(Benyviridae)科的,例如甜菜坏死黄脉病毒(登录号:RNA1:NC_003514;RNA2:NC_003515;RNA3:NC_003516;RNA4:NC_003517)或雀麦花叶病毒(Bromoviridae)科的,例如苜蓿花叶病毒属的病毒(登录号:RNA1:NC_001495;RNA2:NC_002024;RNA3:NC_002025)或雀麦花叶病毒属的,例如BMV(同上),或黄瓜花叶病毒属的,例如黄瓜花叶病毒(登录号:RNA1:NC_002034;RNA2:NC_002035;RNA3:NC_001440),或油橄榄病毒属的,花椰菜花叶病毒(Caulimoviridae)科的dsDNA病毒,尤其是杆状DNA病毒或花椰菜花叶病毒属,例如不同香蕉条纹病毒(如登录号:NC_007002,NC_015507,NC_006955或NC_003381)或花椰菜花叶病毒(登录号:NC_001497),或木薯脉花叶病毒属、碧冬茄病毒属、Rosadnavirus、茄内源病毒属、大豆褪绿斑驳病毒属或东格鲁病毒属的病毒,长线形病毒科(Closteroviridae)的正链RNA病毒,例如葡萄卷叶病毒属、毛形病毒属的,如莴苣侵染性黄化病毒(登录号:RNA1:NC_003617;RNA2:NC_003618)或番茄褪绿病毒(登录号:RNA1:NC_007340;RNA2:NC_007341),长线形病毒属,例如甜菜黄化病毒(登录号:NC_001598)或隐症病毒属,以下双生病毒科(Geminiviridae)的单链DNA(+/-)病毒,例如甜菜曲顶病毒属、菜豆金黄花叶病毒属的病毒,例如菜豆金黄花叶病毒、烟草曲茎病毒、烟草斑点曲叶病毒、番茄褪绿斑驳病毒、番茄矮叶病毒、番茄金色花叶病毒、番茄曲叶病毒、番茄斑驳病毒、或番茄黄斑病毒,或曲顶病毒属的双生病毒,例如甜菜曲顶病毒,或番茄伪曲顶病毒属、Turncurtvirus或玉米线条病毒属的双生病毒,例如玉米条纹病毒(同上)、烟草黄矮病毒、小麦矮小病毒,以下的正链RNA病毒:黄症病毒科(Luteoviridae),例如黄矮病毒属,如大麦黄矮病毒-PAV(登录号:NC_004750),或马铃薯卷叶病毒属的,例如马铃薯卷叶病毒(登录号:NC_001747),矮化病毒科(Nanoviridae)的单链DNA病毒,包括矮缩病毒属或香蕉束顶病毒属,双分病毒科(Partiviridae)的双链RNA病毒,包括甲型双分病毒、乙型双分病毒或丁型双分病毒,马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)的类病毒,马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的正链RNA病毒,例如包括布兰布Y病毒属、大麦黄花叶病毒属、甘薯病毒属、柘橙病毒属、禾草病毒属,例如小麦花叶病毒(登录号:NC_012799),或马铃薯Y病毒属的马铃薯Y病毒科,例如甜菜花叶病毒(登录号:NC_005304)、玉米矮花叶病毒(登录号:NC_003377)、马铃薯Y病毒(登录号:NC_001616)或玉米花叶病毒(登录号:NC_018833),或小麦花叶病毒属的马铃薯Y病毒科,例如雀麦线条病毒(登录号:NC_003501)或小麦线条花叶病毒(登录号:NC_001886),假病毒科(Pseudoviridae)的链RNA病毒,例如假病毒属或塞尔病毒属的,呼肠孤病毒科(Reoviridae)的双链RNA病毒,例如水稻矮缩病毒(登录号:RNA1:NC_003773;RNA2:NC_003774;RNA3:NC_003772;RNA4:NC_003761;RNA5:NC_003762;RNA6:NC_003763;RNA7:NC_003760;RNA8:NC_003764;RNA9:NC_003765;RNA10:NC_003766;RNA11:NC_003767;RNA12:NC_003768),番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)的正链RNA病毒,例如包括甲型坏死病毒属、绿萝病毒属、乙型坏死病毒属、香石竹斑驳病毒属、香石竹环斑病毒属、牛腾菊花叶病毒属、Macanavirus、玉米褪绿斑驳病毒属、黍花叶病毒属、番茄丛矮病毒属、幽影病毒属或玉米病毒属,例如玉米坏死条纹病毒(登录号:NC_007729),或以下的正链RNA病毒:帚状病毒科(Virgaviridae)的,例如真菌传杆状病毒属、大麦病毒属的病毒,如大麦条纹花叶病毒(登录号:RNA1:NC_003469;RNA2:NC_003481;RNA3:NC_003478),或花生丛簇病毒属、马铃薯帚顶病毒属、烟草花叶病毒属或烟草脆裂病毒属的,例如烟草脆裂病毒(登录号:RNA1:NC_003805;RNA2:NC_003811),以及以下的负链RNA病毒:单股反链病毒目(Mononegavirales)的,尤其是弹状病毒科(Rhabdoviridae),例如大麦黄条点花叶病毒(登录号:KM213865)或莴苣坏死黄化病毒(登录号/样本:NC_007642/AJ867584),小RNA病毒目(Picornavirales)的正链RNA病毒,尤其是伴生豇豆病毒科(Secoviridae),例如豇豆花叶病毒属、蚕豆病毒属、线虫传多面体病毒属、樱桃锉叶病毒属、温州蜜柑矮缩病毒属、伴生病毒属、灼烧病毒属或矮化病毒属,芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)的正链RNA病毒,尤其是甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae),例如青葱X病毒属、黑麦草慢病毒属、柑橘病毒属或马铃薯X病毒属,芜菁黄花叶病毒目,尤其是乙型线形病毒科(Betaflexiviridae),例如毛状病毒属、香石竹潜病毒属、柑橘病毒属、凹陷病毒属、Tepovirus或葡萄病毒属病毒,芜菁黄花叶病毒目的正链RNA病毒,尤其是芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae),例如virusesof the order葡萄斑点病毒属、玉米雷亚朵非纳病毒属或芜菁黄花叶病毒属病毒,以及细菌载体,例如农杆菌,如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。最后,术语“载体”也指适当化学转运剂,用于引入线性核酸序列(单或双链)或氨基酸序列或其组合到靶细胞,与物理引入方法相组合,包括聚合物或基于脂质的递送构建体。
因此合适的递送构建体或载体包含用于将核苷酸序列递送到靶细胞的生物学手段,包括病毒载体、农杆菌属,或化学递送构建体,包括纳米颗粒,例如中孔二氧化硅纳米颗粒(MSNPs),阳离子聚合物包括基于PEI(聚乙烯亚胺)聚合物的方法或聚合物如DEAE-葡聚糖,或非共价表面附着PEI以产生阳离子表面,脂质或聚合物囊泡或其组合。脂质或聚合物囊泡可以选自例如脂质、脂质体、脂质包封***、纳米颗粒、小核酸-脂质颗粒制剂、聚合物和聚合物囊泡。
本文在原核或真核细胞,优选动物细胞,更优选根据本公开的植物或植物细胞或植物材料的上下文中使用的术语“衍生物”或“子代”或“后代”涉及由自然生殖性繁殖,包括有性繁殖和无性繁殖产生的这种细胞或材料的子代。本领域技术人员公知,所述繁殖可导致由自然现象产生的突变导入生物体基因组中,所述突变导致后代或子代与亲本生物体或细胞在基因组上不同,然而,它们仍然属于相同的属/种,并且具有与亲本重组宿主细胞大致相同的特征。这样的由生殖或再生过程中的自然现象产生的衍生物或子代或后代因此包含在本公开内容的术语中。此外,术语“衍生物”可以指,在物质或分子而不是指细胞或生物体的情况下,直接地或通过修饰间接地从另一个获得。这可能意味着从细胞获得的核酸序列或来自细胞或植物的代谢物。因此,这些术语不是指任何任意的衍生物、后代或子代,而是指与亲代细胞或病毒或其分子***发生相关即基于亲代细胞或病毒或其分子的衍生物、后代或子代,衍生物、后代或子代以及“亲本”之间的关系明显可由本领域技术人员推断。
此外,本文在生物学序列(核酸或氨基酸)或分子或复合物的上下文中使用的术语“衍生”、“衍生自”或“衍生物”暗示相应序列基于参考序列,例如来自序列表,或数据库登录号,或相应的支架结构,即源自所述序列,而参考序列可包含更多序列,例如病毒的全基因组或完整多蛋白编码序列,而“衍生自”天然序列的序列可以仅包含其一个分离的片段或其连续片段。在这种情况下,cDNA分子或RNA可以说是“源自”作为分子模板的DNA序列。因此,本领域技术人员可以容易地定义“衍生自”参考序列的序列,其将通过DNA或氨基酸水平上的序列比对与相应的参考序列具有高度同一性,并且将与相应的参考序列具有一致的DNA/氨基酸连续延伸(对于比对的分子给定长度,>75%的查询同一性,条件是衍生的序列是查询序列并且参考序列表示序列比对期间的对象)。技术人员因此可以基于本文提供的公开内容通过聚合酶链式反应等将相应序列克隆到合适的感兴趣的载体***中,或使用序列作为载体支架。因此,术语“衍生自”不是任意序列,而是与其衍生的参考序列相对应的序列,而某些差异,例如在宿主细胞内复制重组构建物期间天然发生的某些突变,不能排除并且因此包含于术语“衍生自”。此外,来自亲本序列的几个序列段可以连接在从亲本衍生的序列中。不同的片段与亲本序列具有高甚至100%的同源性。本领域技术人员很清楚,当提供或部分提供为核酸序列时,根据本发明的人造分子复合物的序列然后将被转录并任选地在体内翻译并且可能在宿主细胞内被进一步消化和/或加工(信号肽的切割,内源性生物素化等),使得术语“衍生自”表示与根据本发明的公开的原始使用的序列的相关性。
如本文所用,“融合物”可以指包含一个或多个非天然序列(例如部分)的蛋白质和/或核酸。融合可以位于修饰蛋白的N-末端或C-末端,或两者,或在分子内作为单独的结构域。对于核酸分子,融合分子可以在5'或3'末端或其间任何合适的位置连接。融合可以是转录和/或翻译融合。融合物可以包含一个或多个相同的非天然序列。融合物可以包含一个或更多个不同的非天然序列。融合物可以是嵌合物。融合物可以包含核酸亲和标签。融合物可以包含条形码。融合物可以包含肽亲和标签。融合物可以提供位点特异性效应物或碱基编辑的亚细胞定位(例如,用于靶向细胞核的核定位信号(NLS),用于靶向线粒体的线粒体定位信号,用于靶向至线粒体的叶绿体定位信号叶绿体,内质网(ER)滞留信号等)。融合物可提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如亲和标签)。融合可以是小分子如生物素或染料,如alexa荧光染料,Cyanine3染料,Cyanine5染料。融合可以提供增加的或降低的稳定性。在一些实施方案中,融合可包含可检测标记,包括可提供可检测信号的部分。可以提供可检测信号的合适的可检测标记和/或部分可以包括但不限于酶,放射性同位素,特异性结合对的成员;荧光团;荧光报道分子或荧光蛋白;量子点等等。融合物可以包含FRET对的成员或荧光团/量子点供体/受体对。融合物可以包含酶。合适的酶可以包括但不限于辣根过氧化物酶,萤光素酶,β-25半乳糖苷酶等。融合物可以包含荧光蛋白。合适的荧光蛋白可以包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)(例如来自维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP,来自Anguilla japonica的荧光蛋白或其突变体或衍生物),红色荧光蛋白,黄色荧光蛋白,黄绿色荧光蛋白(例如,来自头孢克洛毛状苔藓的四聚体荧光蛋白的mNeonGreen),任何各种荧光和有色蛋白。融合物可以包含纳米颗粒。合适的纳米粒子可以包括荧光或发光纳米粒子,以及可选地连接至纳米粒子的磁性纳米粒子或纳米金刚石。可以检测纳米粒子的任何光学或磁性性质或特征。融合物可包含解旋酶,核酸酶(例如FokI),内切核酸酶,外切核酸酶(例如5'外切核酸酶和/或3'外切核酸酶),连接酶,切口酶,核酸酶-解旋酶(例如Cas3),DNA甲基转移酶(例如Dam)或DNA脱甲基酶,组蛋白甲基转移酶,组蛋白脱甲基酶,乙酰化酶(包括例如但不限于组蛋白乙酰化酶),脱乙酰酶(包括例如但不限于组蛋白脱乙酰酶),磷酸酶,激酶,转录(共)激活剂,转录(共)因子,RNA聚合酶亚基,转录阻遏物,DNA结合蛋白,DNA结构化蛋白,长的非编码RNA,DNA修复蛋白(例如参与修复单链和/或双链断裂的蛋白质,例如涉及碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、NHEJ、HR、微同源性介导的末端连接(MMEJ)和/或可选的非同源末端连接(ANHEJ)的蛋白,例如但不限于HR调节剂和HR复合物组装信号),标记蛋白,报道蛋白,荧光蛋白,配体结合蛋白(例如mCherry或重金属结合蛋白),信号肽(例如Tat-信号序列),靶向性蛋白或肽,亚细胞定位序列(例如,核定位序列,叶绿体定位序列)和/或抗体表位,或其任何组合。
术语“遗传修饰”或“遗传操作”或“经遗传操作的”在本文中以广义使用并指核酸序列或氨基酸序列、靶细胞、组织、器官或生物体的任何修饰,其伴随着直接或间接人为干预,以影响内源遗传材料或者靶细胞、组织、器官或生物体的转录组或蛋白质组,用于以目的性方式修饰其,从而其不同于在没有人为干预情况下发现的状态。人为干预能体外或体内/植物原位发生,或都可以。能包括进一步修饰,例如一或多个点突变,如用于靶向蛋白工程或密码子优化、缺失,至少一个核酸或氨基酸分子的一或多个***或缺失(还包括同源重组),修饰核酸或氨基酸序列,或其组合。所述术语还应包括核酸分子或氨基酸分子或宿主细胞或生物体,包含植物或其植物材料,其与天然出现的相当序列、生物体或材料类似,但通过至少一个目的性操作步骤构建。因此,本文所用的“靶向遗传操作”或“靶向(碱基)修饰”是“遗传操作”的结果,其以靶向方式实现,即在靶细胞中特定位置和在特定合适情况下以在至少一个待操作细胞优选植物细胞中达到所需效果,其中该术语意指待被靶向的序列和相应的修饰基于前面的序列考虑因素,从而可以提前计划产生的修饰,例如,基于细胞基因组中靶位点的可用序列信息和/或基于感兴趣的分子工具的靶特异性信息(核酸或氨基酸序列的识别或结合特性,互补碱基配对等)。
术语“基因组”是指存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中的遗传物质(基因和非编码序列)的全部互补物,和/或从一个亲本作为一个单位(单倍体)遗传的完整染色体组。本文所用的术语“粒子轰击”,也称为“基因枪转染”或“微粒介导的基因转移”,是指用于将包含感兴趣的核酸或遗传构建体包被的微粒或纳米粒子转移到靶中的物理递送方法细胞或组织。微粒或纳米粒子起到抛射物的作用,并使用合适的装置(通常称为基因枪)在高压下向目标靶结构上发射。通过粒子轰击的转化使用覆盖有感兴趣基因的金属微粒,然后使用被称为“基因枪”(Sandford等1987)的设备以足够快的速度(约1500千米/h)将其喷射到靶细胞上以穿透目标组织的细胞壁,但不足以导致细胞死亡。对于原生质体,其细胞壁完全被去除,条件在逻辑上是不同的。在至少一个微粒上的沉淀的核酸或遗传构建体在轰击后释放到细胞中,并整合到基因组中。微粒的加速通过高压放电或压缩气体(氦气)完成。关于所使用的金属颗粒,它们必须是无毒的,无反应性的,并且它们具有比靶细胞更小的直径。最常用的是金或钨。基因枪和相关***的制造商和供应商通常会提供大量有关其一般用途的信息。
术语“基因组编辑”和“基因组工程改造”在本文中可互换使用,并且是指针对活体有机体的任何遗传信息或基因组的靶向特异性修饰的策略和技术。因此,术语包括基因编辑,但也包括除基因组的基因编码区之外的区域的编辑。它还包括编辑或改造核(如果存在)以及细胞的其他遗传信息。此外,术语“基因组编辑”和“基因组工程改造”还包括表观遗传编辑或工程改造,即例如甲基化、组蛋白修饰或可能引起基因表达可遗传改变的非编码RNA的靶向修饰。
如本文所用,“种质”是用于描述遗传资源的术语,或者更准确地说是生物体的DNA和该材料的集合。在育种技术中,术语种质用于指示从中可以创建新植物或植物品种的遗传物质的集合。
术语“向导RNA”、“gRNA”或“单向导RNA”或“sgRNA”在本文中可互换使用,并且是指CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的合成融合物,或术语是指仅由crRNA和/或tracrRNA组成的单个RNA分子,或者该术语是指单独包含crRNA或tracrRNA部分的gRNA。tracr和crRNA部分因此不一定必须存在于一个共价连接的RNA分子上,然而它们也可以由两个单独的RNA分子组成,所述两个单独的RNA分子可以缔合或可以通过非共价或共价相互作用缔合以提供根据本公开的gRNA。术语“gDNA”或“sgDNA”或“向导DNA”在本文中可互换使用,并且指的是与Argonaute核酸酶相互作用的核酸分子。由于它们与位点特异性核酸酶相互作用的能力并且有助于将所述位点特异性核酸酶靶向基因组靶位点,本文公开的gRNA和gDNA都被称为“向导核酸”或“向导核酸”。
如本文所用,术语“突变”和“修饰”可互换使用以指在体内或体外核酸操纵的背景下的缺失、***、添加、取代、编辑、链断裂和/或引入加合物。缺失定义为核酸序列中的变化,其中一个或多个核苷酸不存在。***或添加是核酸序列中的变化,导致添加一个或多个核苷酸。“取代”或编辑指用不同于被替换的一或多个核苷酸的分子替换一个或多个核苷酸替换。例如,核酸可被不同的核酸置换,例如通过用胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或尿苷取代胸腺嘧啶。嘧啶至嘧啶(例如C转化成Tt至C的核苷酸取代)或嘌呤至嘌呤(例如G到A或A至G的核苷酸取代)被称为转换(transition),而嘧啶至嘌呤或嘌呤至嘧啶(例如G到T或G到C或A到T或A到C)被称为颠换(transversion)。或者,可以用修饰的核酸代替核酸,例如胸腺嘧啶二醇取代胸腺嘧啶。突变可能会导致不匹配。术语“错配”是指两个核酸之间的非共价相互作用,每个核酸位于不同的核苷酸序列或核酸分子上,其不遵循碱基配对规则。例如,对于部分互补序列5'-AGT-3'和5'-AAT-3',存在G-A错配(转换)。
关于序列或分子的术语“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用,并且指天然或合成来源的单链或双链DNA或RNA。术语核苷酸序列因此被用于与其长度无关的任何DNA或RNA序列,使得该术语包含任何包含至少一个核苷酸的核苷酸序列,但也包括任何种类的较大的寡核苷酸或多核苷酸。术语因此是指天然和/或合成的脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)序列,其可以任选地包含合成的核酸类似物。根据本公开内容的核酸可以任选地进行密码子优化。“密码子优化”意味着DNA或RNA的密码子使用适合于感兴趣的细胞或生物体的密码子使用,以改善所述目的细胞或生物体中所述重组核酸的转录速率。本领域技术人员很清楚,由于密码子简并性,靶核酸可以在一个位置被修饰,而这种修饰仍然会在翻译后在该位置产生相同的氨基酸序列,这是通过密码子优化实现的考虑靶细胞或生物体的物种特异性密码子使用。根据本申请的核酸序列可以对以下非限制性生物体列表进行特定的密码子优化:大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghumbicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉米(Zea mays)、小米(Setaria italic)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、紫短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilopstauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Beta spp.)包括甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、筷子芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oeleracia)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatrophacurcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicerreticulatum)、Cicer judaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanusscarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypiumsp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Toreniafournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和韭菜(Allium tuberosum),或人(Homo sapiens)。
如本文所用,“核苷酸”因此通常可以指碱-糖-磷酸盐组合。核苷酸可以包含合成核苷酸。核苷酸可以包含合成的核苷酸类似物。核苷酸可以是单体单元的核酸序列(例如,脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可以包括三磷酸核糖核苷三磷酸(ATP),三磷酸尿苷(UTP),三磷酸胞苷(CTP),三磷酸鸟苷(GTP)和dATP,dCTP,dITP,dUTP,dGTP,dTTP或其衍生物等脱氧核糖核苷三磷酸。这样的衍生物可以包括,例如但不限于[αS]dATP,7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP,以及在含有它们的核酸分子上赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文使用的术语核苷酸可以指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTPs)及其衍生物。二脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实例可以包括但不限于ddATP,ddCTP,ddGTP,ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过公知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测标记可以包括例如放射性同位素,荧光标记,化学发光标记,生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素,5-羧基荧光素(FAM),2'7'-5二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE),若丹明,6-羧基罗丹明(R6G),N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA),6-羧基-X-罗丹明(ROX),4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL),CascadeBlue,Oregon Green,Texas红,花青和5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。
如本文所用,“非天然”或“非天然存在”或“人造”可指或在天然核酸或蛋白质中未发现的核酸或多肽序列、任何其他生物分子如生物素或荧光素。非天然可以指亲和标签。非天然可以指融合。非天然的可以指包含突变、***和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列。非天然序列可展现和/或编码其中非天然序列被融合的核酸和/或多肽序列也可展现的活性(例如,酶活性,甲基转移酶活性,乙酰转移酶活性,激酶活性,泛素化活性等)。可通过基因工程将非天然核酸或多肽序列连接至天然存在的核酸或多肽序列(或其变体)以产生编码嵌合核酸和/或多肽的嵌合核酸和/或多肽序列。非天然序列可以指3'杂交延伸序列。
如本文中在植物细胞、组织、器官或植物中使用的术语“植物毒性的”或“植物毒性”是指植物或任何植物细胞的细胞毒性效应或细胞毒性。因此该术语意味着化合物或触发剂对植物抑制、破坏或甚至杀死植物细胞、组织、器官或整个植物的毒性作用。这种损害可能由各种各样的化合物引起,包括除草剂,杀虫剂,痕量金属,由病原体诱导的毒性效应物,盐度植物毒素或化感物质。此外,该术语还指植物激素,例如但不限于用于调节植物免疫应答的激素,如乙烯,茉莉酮酸和水杨酸,或调节植物发育和生长的植物激素,如生长素,脱落酸(ABA)、细胞***素,赤霉素和油菜素类固醇等。
本文所用的术语“植物”指完整植物生物体、植物器官、分化和未分化的植物组织、植物细胞、种子和其衍生物及后代。“植物细胞”包括但不限于来自以下的细胞:来自种子,来自成熟胚和未成熟胚、分生组织、籽苗、不同分化状态的愈伤组织、叶、花、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子、原生质体、巨藻和微藻。不同植物细胞可以是单倍体、二倍体或多倍体。术语“植物器官”是指植物组织或一组组织,其构成植物的形态上和功能上不同的部分。
本文所用的“植物材料”指能获自在任何发育阶段的植物的任何材料。植物材料能植物原位获得或者来自植物或其植物组织或器官的体外培养物。因此,该术语包括植物细胞、组织和器官以及发育的植物结构和亚细胞组分如核酸、多肽及所有化学植物物质或代谢物,其能在植物细胞或区室内发现和/或能由植物生成,或其能获自任何植物细胞、组织的提取物或者任意发育阶段的植物。所述术语还包括植物材料的衍生物,如原生质体,获自植物材料所含至少一个植物细胞。由此,该术语还包括植物的分生细胞或分生组织。
“质粒”是指以双链核酸序列形式的环状自主复制染色体外元件。在基因工程领域中,这些质粒通常***例如编码对抗生素或除草剂的抗性的基因,编码靶核酸序列的基因,定位序列,调控序列,标签序列,标记基因,包括抗生素标记或荧光标记等。保留原始质粒的结构组分,如复制起点。根据本发明的某些实施方案,定位序列可以包含核定位序列,质体定位序列,优选线粒体定位序列或叶绿体定位序列。所述定位序列对于植物生物技术领域的技术人员是可用的。用于不同目标细胞的各种质粒载体可商购获得,并且其修饰对于相应领域的技术人员是已知的。
“聚合酶链式反应”(PCR)是合成特定DNA片段的技术。PCR包含一系列重复变性、退火和延伸循环。通常,双链DNA被热变性,并且与靶区段的3'边界互补的两种引物在低温下与DNA退火,然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤被称为“循环”。
“后代”包括植物、植物细胞或植物组织的任何后续世代。
如本文所用的术语“调控序列”是指可指导目的核酸序列的转录和/或翻译和/或修饰的核酸或氨基酸序列。
术语“蛋白质”、“氨基酸”或“多肽”在本文中可互换使用,并且指具有催化酶功能或结构或功能作用的氨基酸序列。术语“氨基酸”或“氨基酸序列”或“氨基酸分子”包括任何天然或化学合成的蛋白质、肽、多肽和酶或修饰的蛋白质、肽、多肽和酶,其中术语“修饰的”化学或酶促修饰蛋白质、肽、多肽和酶,包括将野生型序列截短为更短但仍然有活性的部分。
根据本发明,可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见,例如,Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(herein"Sambrook et al.,1989");DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&SJ.Higgins eds.(1985);Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984);Animal Cell Culture(RI.Freshney,ed.(1986);ImmobilizedCells and Enzymes(IRL Press,(1986);B.Perbal,A Practical Guide To MolecularCloning(1984);F.M.Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)等。
如本文所用,“可选择的表型”或“表型可选择的”或“表型可筛选的”定义细胞或生物体在生长、代谢、对植物毒性(例如除草剂)或其他化合物的敏感性、或消耗营养素方面的表现或视觉特征的改变。“可选择的表型”还包括通过眼睛或使用特殊设备观察到的可见或不可见外观。因此表型可选择的性状由至少一个基因组区域编码并产生表型,其可以通过视觉显微镜或通过任何分子或分析生物学手段进行筛选。
每当本公开涉及核酸或氨基酸序列的同源性或同一性的百分比时,这些值限定了通过使用EMBOSS Water配对序列比对(核苷酸)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)核酸或用于氨基酸序列的EMBOSS Water配对序列比对(蛋白质)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)。由欧洲分子生物学实验室(EMBL)欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的用于局部序列比对的工具使用修改的Smith-Waterman算法(参见www.ebi.ac.uk/Tools/psa/和Smith,TF&Waterman,MS“通用分子子序列的鉴定”Journal of Molecular Biology,1981 147(1):195-197)。进行对齐时,使用由EMBL-EBI定义的默认参数。这些参数是(i)对于氨基酸序列:矩阵=BLOSUM62,空位开放罚分=10和空位延伸罚分=0.5或(ii)对于核酸序列:矩阵=DNA满,空位开放罚分=10和空位延伸罚分=0.5。
当涉及双链核酸序列,例如作为DNA靶序列的基因组序列时,术语“链断裂”包括单链断裂和/或双链断裂。单链断裂(缺口)是指双链核酸序列的两条链之一中断。这与涉及双链核酸序列的两条链中断的双链断裂形成对比。根据本公开内容的链断裂可以通过使用合适的内切核酸酶(包括CRISPR内切核酸酶或其变体,包括CRISPR内切核酸酶或其变体,在感兴趣的核酸碱基位置处)的酶切割引入双链核酸序列,其中所述变体可以是突变的或野生型蛋白或核酸内切酶的截短形式,其仍然可以发挥野生型蛋白的酶促功能。
这里使用的术语“靶区域”、“靶位点”、“靶结构”、“靶构建体”、“靶核酸”或“靶细胞/组织/生物体”或“DNA靶区域”其可以是靶细胞的任何区室内的任何基因组或表观基因组区域。
如本文所用的术语“靶向的”或“位点特异性的”或“定点的”是指分子生物学行为,其使用关于待修饰的感兴趣的基因组区域的序列的信息,并且其进一步依赖于分子工具例如核酸酶(包括CRISPR核酸酶及其变体,TALEN,ZFN,大范围核酸酶或重组酶),DNA修饰酶(包括碱基修饰酶如胞嘧啶脱氨酶,组蛋白修饰酶等),DNA结合蛋白质,cr/tracr RNA,向导RNA等,其允许在计算机上预测至少一种在感兴趣的基因组靶区内实现的修饰。因此,相关的分子工具可以离体或计算机设计并构建。
如本文所用的术语“转基因”或“转基因的”是指至少一种取自一种生物体的基因组或合成产生的核酸序列,然后将其导入感兴趣的细胞或生物体或组织的宿主中,和随后通过“稳定”转化或转染方法将其整合到宿主的基因组中。相反,术语“瞬时”转化或转染或导入是指引入分子工具的方式,所述分子工具包括至少一种核酸(DNA,RNA,单链或双链或其混合物)和/或至少一种氨基酸序列,任选地包含合适的化学或生物试剂,以实现向细胞的至少一个感兴趣区室的转移,包括但不限于细胞质,细胞器,包括细胞核,线粒体,液泡,叶绿体或膜中,导致所引入的至少一种分子的转录和/或翻译和/或缔合和/或活性,而不会实现稳定的整合或掺入以及所引入至少一个引入到细胞的基因组的分子的遗传。
因此,在此使用的术语“瞬时引入”因此是指暂时引入根据本公开的至少一种核酸序列,优选掺入到递送载体中或掺入重组构建体中,有或没有递送载体的帮助,转化至靶结构,例如植物细胞,其中在合适的反应条件下引入所述至少一个核酸序列,使得所述至少一个核酸序列不整合到靶结构的内源性核酸材料中,所述基因组作为整体发生,使得至少一个核酸序列不会整合到靶细胞的内源DNA中。因此,在瞬时引入的情况下,引入的遗传构建体将不会遗传给靶结构例如原核生物、动物或植物细胞的后代。至少一个核酸序列或由其转录或翻译产生的产物仅以暂时的方式以组成型或诱导型形式存在,并且因此只能在靶细胞中有限的时间内有活性以发挥其功能。因此,通过瞬时导入引入的至少一种核酸序列不可遗传至细胞的子代。然而,以瞬时方式引入的核酸序列可能潜在地被遗传给靶细胞的后代。
本文公开的任何位点特异性效应物或碱基编辑器的“变体”代表与相应野生型酶相比包含至少一个突变、缺失或***的分子,以改变天然存在的野生型酶的活性。作为非限制性例子,“变体”可以是催化失活的Cas9(dCas9),或已被修饰以用作切口酶的位点特异性核酸酶。
发明详述
本发明提供了用于在植物细胞、组织、器官或材料中进行定向编辑的方法,所述方法具体组合并使用平行导入策略。因此,本文提供的方法依赖于在第一基因组靶位点处平行引入表型可选择性状,其中这种表型可选择性状因此容许筛选并且不包括引入转基因标记序列或标记盒。此外,在第一个基因组靶位点引入靶向修饰以获得可选择的表型不依赖于提供外源多核苷酸模板,也不依赖于在靶位点引入双链(ds)断裂,这些步骤通常在多种基因组编辑方法必需,所述方法需要使用位点特异性核酸酶(SSN)在基因组靶位点处引入双链断裂,其经常通过提供用于同源修复(HR)的修复模板作为外源核酸物质而被修复。
因此提供了与植物育种策略特别相关的方法,其中农艺感兴趣的性状必须在感兴趣的植物中组合,这通常需要迭代并且通常需要耗费时间的选择步骤。此外,本文提供的具体方法步骤在不同的基因组靶位点平行化转基因无标记选择和导致赋予植物或植物细胞选择性或其他表型靶向编辑。这反过来能够在没有选择标记盒的情况下分离这种修饰的植物材料,而这种表型选择可以显著降低用于筛选感兴趣的第二靶向修饰的成本,第二靶向修饰通常在表型上不是可筛选的。由于同时引入两种靶向修饰,一种保证转基因无标记选择的修饰和允许将高度位点特异性和可预测的编辑引入感兴趣的基因组靶标位点的第二种修饰的协同相互作用,本发明允许精确育种策略包括显著减少用于鉴定感兴趣基因型的选择努力,这又有助于减少识别感兴趣的植物细胞或种质内的相关修饰所需的时间和成本。
在第一方面,提供了提供用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的植物组织、器官或完整植物,而没有稳定整合转基因可选择标记序列的方法实现上述目的,所述方法包括:(a)将至少一个第一靶向碱基修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点中,其中所述至少一个靶向碱基修饰引起至少一种表型可选择的性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入所述至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点中,其中使用至少一个位点特异性效应物在所述第二植物基因组靶位点处产生所述至少一个第二靶向修饰来引入所述至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,其通过选择(i)由在所述第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰导致的至少一种表型可选择性状,并且任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的所述至少一个第二靶向修饰。
根据本发明的方法,不需要用作选择性标记的转基因外源序列的稳定整合。相反,在第一植物基因组靶位点产生表型可选择性状或表型。这具有提供可选择编辑的优点,其不依赖于在选择期间用作标记的外源核酸构建体的整合。
如本文所用,“表型可选择性状”是指由表达相关基因组性状后引起可见或其他可选表型的至少一种基因编码的性状。所述性状的选择可通过视觉或通过使用选择剂、化合物或触发剂施用于植物细胞、组织、器官、材料或整株植物来完成。
第一和第二植物基因组靶位点可以是相同的或不同的基因组座。优选地,第一和第二植物基因组靶位点位于不同的基因组基因座内,该基因座可以位于相同或不同的染色体上。
根据本发明的方法,进行第一和第二靶向修饰的平行引入策略,其中在第一和第二植物基因组靶标位点引入的不同靶向修饰的这种平行化显著改善了后来的筛选步骤。通常,第二种修饰将没有机会进行选择,因为它赋予的表型在产生植物的过程中将不表达或不相关。因此,本发明的方法所基于的目的是使用引起表型可选择表型的第一修饰作为实现选择的工具。与传统方法相比,本文公开的方法具有不掺入转基因标记基因的优点。与不使用具有选择剂的选择性表型相比,其具有通过消除全部或大部分未处理的细胞来提高效率的优点,否则所述细胞将占产生植物的细胞的大部分。通过消除未处理的细胞,必须生产的植物数量大大减少,并且用于第二次靶向修饰的必须进行分子筛选的植物数量大大减少,这又增加了所公开的用于植物育种的方法的效率。
优选地,根据本发明的各个方面的方法依赖于同时或随后将至少一个第一靶向碱基修饰、密码子缺失或移码或缺失修饰引入到待修饰的相同的至少一个植物细胞中,所述至少一个植物细胞也接受所述至少一个第二靶向修饰导入感兴趣的第二植物基因组靶位点。因此,第一和第二靶位点的修饰最好同时引入同一个细胞,即以同时的方式,即并行地。因此,在此意义上的后续导入是指这样的事实,即引入的包括至少一个碱基编辑复合物和/或至少一个位点特异性效应物的不同工具可能在彼此之前短暂地起作用。尽管如此,这个术语随后意味着在同一个细胞内同时并行地引入感兴趣的工具。这进而具有改善筛选可能性的效果,这是由于介导至少一种第一和第二靶向修饰的分子工具的引入过程的耦合,这些修饰彼此并不完全独立。因此具有一个修饰的待修饰的细胞更有可能也具有第二个靶向修饰。与随机选择细胞相比,特别是对于通常不具有区分处理和未处理细胞的全部群体的清晰表型的第二种修饰,本发明的方法提供了选择优势。选择因此得到显著改善,因为通常代表基因组编辑过程中的瓶颈的各种工具以功能方式递送是同步并同时完成的。由于有可能以靶向的方式选择第一修饰,因此只需进行针对第二植物基因组靶位点的至少一个靶向修饰的有限数量的筛选努力,因为没有以功能性方式接受根据本发明的任何工具或复合物的细胞根本不会接受导致第一植物基因组靶位点处表型可选择性状的修饰。由于所述植物细胞接受根据本发明并行地添加到细胞中的第二位点特异性效应复合物的机会很低,如果第一靶向修饰的筛选是阴性的,对于第二靶向修饰将不必进行耗时的筛选。
根据本发明的方法因此使得可以通过适合的试剂或通过视觉筛选选择用第一靶向修饰靶向的表型可选择性状而选择接受或不接受至少一种第一修饰的细胞。因此,该筛选消除了不包含至少一种第一修饰的细胞,或者筛选允许目视检查并将细胞分离已接受或未接受第一靶向修饰的修饰细胞。由于根据本发明的并行引入和递送方法,在已经成功接收第一靶向修饰的细胞中,也可以预期合理的数目也具有至少一个第二靶向修饰。在这种情况下,“合理的”意味着通过选择至少一种由至少一种第一靶向修饰引起的可表型选择性状而针对至少一种第二靶向修饰的存在而筛选的细胞数量的任何改善(即,减少)。至少一个第二靶向修饰存在的实际频率通常很难预测,因为它会根据若干因素而变化。这使得使用普通分子技术(例如依赖于PCR)筛选通过基因组工程引入的任何修饰十分繁琐。根据本发明的方法,已经接受第一和第二靶向修饰二者的细胞的频率可以是具有第一修饰的植物细胞或植物与具有第一和第二修饰的植物细胞或植物相比的比例在2:1和1,000:1之间的范围内。因此,在任何筛选或选择步骤中都有固有的优点,因为第二次修饰必须筛选的细胞总数将会减少。特别地,其中用于引入第一和第二靶向修饰的工具的递送失败的那些细胞可能不会接收到任何分子工具,因此第一和第二靶向修饰都不存在。因此,第一表型可选择性状将不明显,即可选择。在选择压力下或在视觉选择之后,相应的植物细胞、组织、器官或整个植物对于表型可选择性状为“阴性”将不必经受随后的第二靶向修饰的筛选,因为第二修饰在第一修饰不存在的情况下,由于各工具的并行引入而被引入的可能较低。
如果需要,通过与衍生植物杂交将第一修饰与第二修饰遗传分离。
因此,本文公开的方法因此可以用于通过消除或去除没有接受编辑试剂的细胞或如针对至少一种第一靶向修饰所筛选的没有经过靶向修饰的细胞来增加具有在第二感兴趣的基因处的靶向修饰的植物的回收。
根据本发明的各种实施方案的靶向碱基修饰是指基因组编辑,其能够以可编程的方式将一个靶DNA碱基直接,不可逆地转化为另一个,而不需要dsDNA骨架切割或供体模板(参见图1)。Komor等,Nature,第533卷,2016)。
在一实施方案中,根据本发明第一方面的方法在步骤(b)中另外包含引入修复模板以在至少第二植物基因组靶位点进行靶向序列转换或置换。修复模板(RT)代表单链或双链核酸序列,其可在导致双链或单链DNA断裂的任意基因组编辑期间提供,从而通过提供RT作为帮助同源性定向修复的已知序列的模板。根据本发明的至少一个修复模板核酸序列的大小可以变化。它可以在约20bp至约5,000bp或甚至8,000bp的范围内,取决于以定点方式修饰的DNA靶序列。RT可以作为单独的物理实体提供,或者作为根据本发明的复合物的一部分提供。使用RT可能有利于某些应用,以避免由于细胞NHEJ修复机制造成的不希望的***或缺失。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,本文提供的方法包括进一步的步骤(d)将包含所述至少一个第一和至少一个第二靶向修饰的至少一个经修饰的植物或植物材料与感兴趣的另外的植物或植物材料杂交以分离所产生的后代植物或植物材料以获得感兴趣的基因型,任选地其中感兴趣的基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰。
感兴趣的另外的植物或植物材料可以是包含感兴趣的基因组材料的任何植物材料,其中包含例如良种事件或任何感兴趣的性状的该材料例如用于随后的育种以产生基因型以及因此产生感兴趣的植物。感兴趣的基因型因此是结合来自不同感兴趣植物的性状的前述育种步骤的结果。
在根据本发明的所有方面的一实施方案中,感兴趣的最终基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰,即至少一种表型可选择性状。如图1所示,本发明的方法特别适用于通过将衍生的植物杂交并将其与第二靶向修饰遗传分离而去除导致表型可选择性状的第一靶向修饰(参见图1C),如果某些应用需要。在另一实施方案中,编码感兴趣的表型可选择性状的第一靶向修饰可以保持在感兴趣的基因型中,如果表型可选择性状本身对于所得感兴趣基因型和相应植物或植物材料具有价值。
在根据本发明第一方面的一实施方案中,其中所述至少一个位点特异性效应物与至少一个碱基编辑复合物暂时或永久连接,其中所述碱基编辑复合物介导至少一个第一靶向碱基修饰步骤(a)。因此,至少一个位点特异性效应物可以非共价(暂时)或共价(永久)附着于至少一个碱基编辑复合物。至少一个碱基编辑复合物的任何组件可以临时或永久链接到至少一个位点特异性效应物。术语“暂时”和“永久”因此应被广义地解释并且包含共价和/或非共价键或附接以实现至少一个位点特异性效应物和至少一个碱基编辑复合物的物理接近。至少一个碱基编辑复合物的至少一个组分与至少一个位点特异性效应物或者任何其它组分(例如与该至少一个位点特异性效应物相关的gRNA或RT)的连接在至少一个第一和至少一个第二基因组靶位点在感兴趣的基因组内很接近的情况下可能是感兴趣的。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一种位点特异性效应物选自以下中的至少一种:核酸酶,包含CRISPR核酸酶,包括Cas或Cpf1核酸酶,TALEN,ZFN,大范围核酸酶,Argonaute核酸酶,限制性内切核酸酶,包括FokI或其变体,重组酶或两个位点特异性切口内切核酸酶,或碱基编辑器,或前述效应物的任何变体或催化活性片段。
因此,本文使用的“位点特异性效应物”可以定义为具有将单链或双链切割引入基因组靶位点或具有以下能力的任何核酸酶、切口酶、重组酶或碱基编辑器:将包含点突变、***或缺失的靶向修饰引入感兴趣的基因组靶位点。至少一个“位点特异性效应物”可以单独作用或与其他分子组合作为分子复合物的一部分。“位点特异性效应物”可以作为融合分子存在,或者作为通过共价或非共价相互作用中的至少一种相关联的单独的分子存在,从而使位点特异性效应复合物的组分物理接近。
如本文所用的“碱基编辑器”是指蛋白质或其具有与其衍生的蛋白质相同的催化活性的片段,所述蛋白质或其片段单独地或当作为分子复合物提供时被称为本文中的碱基编辑复合物,具有介导靶向碱基修饰的能力,即,如果碱基转换不引起沉默突变而是导致由包含待转换的位置的密码子编码的氨基酸转换,则感兴趣的碱基的转换导致感兴趣的点突变,继而可导致靶向突变。优选地,根据本发明的至少一个碱基编辑器暂时或永久地连接至少一个位点特异性效应物,或任选地连接至少一个位点特异性效应物复合物的组分。连接可以是共价和/或非共价的。
本文公开的任何碱基编辑器或位点特异性效应物或其催化活性片段,或碱基编辑复合物或位点特异性效应复合物的任何组分可作为核酸片段引入细胞中,核酸表示或编码DNA、RNA或蛋白质效应物的片段,或其可作为DNA、RNA和/或蛋白质或其任何组合引入。
消除使用内切酶、DSB和修复模板制备可选择修饰的关键工具集是使用碱基编辑器或定向诱变结构域。多个出版物已经显示了靶向碱基转换,主要胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T),其使用与胞苷脱氨酶结构域(载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC1),例如,来源于大鼠的APOBEC)连接的CRISPR/Cas9切口酶或非功能性核酸酶。由胞苷脱氨酶催化胞嘧啶(C)的脱氨基并产生尿嘧啶(U),其具有胸腺嘧啶(T)的碱基配对性质。大多数已知的胞苷脱氨酶对RNA起作用,并且已知接受DNA的少数例子需要单链(ss)DNA。对dCas9-靶DNA复合物的研究表明,在形成Cas9-向导RNA-DNA'R-环'复合物时,置换的DNA链的至少9个核苷酸(nt)是未配对的(Jore等,Nat.Struct.Mol.Biol.,18,529-536(2011))。实际上,在Cas9R-环复合物的结构中,位于被置换的DNA链上的前间隔区的前11nt是无序的,这表明它们的移动不是高度受限的。还有人推测,Cas9切口酶诱导的非模板链胞嘧啶的突变可能是由细胞胞嘧啶脱氨酶的可及性引起的。推断R环中这段ssDNA的一个子集可以作为dCas9-连接的胞苷脱氨酶的有效底物,以实现DNA中C到U的直接可编程转换(Komor等,同上)。
因此,根据本发明的任何碱基编辑复合物可以包含至少一个胞苷脱氨酶或其催化活性片段。所述至少一个碱基编辑复合物可以包含胞苷脱氨酶或其催化活性片段形式的结构域作为碱基编辑器。
在另一实施方案中,所述至少一个第一靶向碱基修饰是任何核苷酸C、A、T或G至任何其他核苷酸的转化。C、A、T或G核苷酸中的任何一个可以以定点方式被交换为另一个核苷酸,如由碱基编辑器或其催化活性片段介导的。所述至少一个碱基编辑复合物因此可以包含任何碱基编辑器,或碱基编辑器结构域或其催化活性片段,其可以以靶向方式将感兴趣的核苷酸转化成任何其它感兴趣的核苷酸。
本发明提供了结合碱基编辑工具本身的知识的方法,并且将该技术用于实现感兴趣的表型可选择表型以避免需要转基因标记的组合方法中,因为碱基编辑可以人工创建内源标记,具有可选择的表型输出。为此,碱基编辑器与修饰的位点特异性效应物结合,其保留识别和结合基因组靶区域的能力,任选地由基于CRISPR的核酸酶的gRNA向导,介导C向U的转化,或G到A,以引入定点诱变。反过来,可以实现导致感兴趣表型的靶向突变。这为靶向育种策略铺平了道路,特别是因为本文公开的方法另外组合使用至少一种碱基编辑器或碱基编辑复合物以将靶向碱基修饰引入至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点,所述植物细胞平行地要由至少一种位点特异性效应物介导的第二修饰进行修饰。该方法允许以协同方式无标记地选择和筛选感兴趣的修饰或基因型,而不需要针对根据本发明的各个方面的至少一个第一修饰(即,靶向碱基修饰、靶向密码子缺失或靶向移码或缺失修饰)引入DSB或RT。
尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)结构域的添加进一步提高了碱基编辑效率。核定位信号(NLS)或任何其他细胞器靶向信号可以进一步需要以确保复合物的正确靶向。
在根据本发明所有方面的一实施方案中,所述至少一种位点特异性效应物是基于CRISPR的核酸酶,其中所述基于CRISPR的核酸酶包含指导所述至少一种碱基编辑复合物的位点特异性DNA结合结构域,其中所述至少一种基于CRISPR的核酸酶或编码其的核酸序列选自:(a)Cas9,包括SpCas9,SaCas9,SaKKH-Cas9,VQR-Cas9,St1Cas9,(b)Cpf1,包括AsCpf1,LbCpf1,FnCpf1,(c)CasX或(d)CasY或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物,优选其中所述至少一种基于CRISPR的核酸酶与相应野生型相比包含突变型序列,从而使得到的基于CRISPR的核酸酶转变为单链特异性DNA切口酶,或转变为缺乏全部DNA切割能力的DNA结合效应物。
如本文所用,“基于CRISPR的核酸酶”是已经在天然存在的CRISPR***中鉴定的任何核酸酶,其随后从其天然背景中分离,并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的重组构建体,适合作为靶向基因组工程的工具。只要最初的基于野生型CRISPR的核酸酶提供DNA识别,即结合特性,任何基于CRISPR的核酸酶都可以使用并任选重新编程或另外突变以适合本发明的各种实施方案。所述DNA识别可以是PAM依赖性的。具有优化和工程化PAM识别模式的CRISPR核酸酶可用于特定应用。PAM识别编码的扩展可以适合于将位点特异性效应复合物靶向感兴趣的靶位点,而与野生型CRISPR基核酸酶的原始PAM特异性无关。Cpf1变体可以包含S542R,K548V,N552R或K607R突变中的至少一种,优选来自酸性氨基酸球菌的AsCpf1中的突变S542R/K607R或S542R/K548V/N552R(参见SEQ ID NO:24)。此外,根据本发明的方法,可以使用修饰的Cas变体,例如Cas9变体作为碱基编辑复合物的一部分,例如,BE3,VQR-BE3,EQR-BE3,VRER-BE3,SaBE3,SaKKH-BE3(参见Kim等,Nat.Biotech.,2017,doi:10.1038/nbt.3803)。因此,根据本发明,设想人工修饰的CRISPR核酸酶,其实际上可能不是在双链切割酶意义上的任何“核酸酶”,而是切口酶或核酸酶死亡变体,其仍具有固有的DNA识别以及结合能力。适用于本发明目的的示例性基于Cas或Cpf1的构建体公开于SEQ ID NO:17至19中。AsCpf1野生型序列公开于SEQ ID NO:24中。用于本发明方法中的其它合适的基于Cpf1的效应物来源于滑麻科细菌(LbCpf1,例如NCBI参考序列:WP_051666128.1),或来自土拉弗朗西斯菌(FnCpf1,例如UniProtKB/Swiss-Prot:A0Q7Q20.1)。Cpf1的变体是已知的(参见Gao等人,BioRxiv,dx.doi.org/10.1101/091611)。因此,可分别切割具有TYCV/CCCC和TATVPAM的靶位点并具有增强的体外和体内活性的具有突变S542R/K607R和S542R/K548V/N552R的AsCpf1突变体设想为本发明的位点特异性效应物。脱靶活性的全基因组范围评估表明这些变体保留了高水平的DNA靶向特异性,这可以通过在非PAM相互作用域中引入突变而进一步改善。总之,这些变体将AsCpf1的靶向范围增加到人类基因组的非重复区域中的每~8.7bp一个切割位点,为CRISPR/Cas基因组工程工具箱提供有用的添加(参见Gao等人,同上)。
在根据本发明的第一方面的一个实施方案中,所述至少一个第一靶向碱基修饰由包括至少一个碱基编辑器作为组件的至少一个碱基编辑复合物进行。根据本发明的碱基编辑复合物包括碱基编辑器以及其他可选组件。
在一实施方案中,碱基编辑复合物含有APOBEC1组分,优选大鼠APOBEC1。在另一实施方案中,碱基编辑复合物可以包含任何胞苷/胞嘧啶脱氨酶作为碱基编辑器,例如人AID,例如UniProtKB/Swiss-Prot:Q9GZX7.1,人APOBEC3G,例如GenBank:CAK54752.1,或七鳃鳗CDA1,例如GenBank:ABO15150.1,但是任何酶或其催化活性片段均被设想在本发明的范围内。适用于本发明方法的示例性APOBEC组分由SEQ ID NO:20表示。此外,根据本发明的方法,可以使用经修改的碱基编辑器,优选具有窄编辑宽度低于6nt,低于5nt,低于4nt,低于3nt或甚至2nt或1nt的碱基编辑器。编辑窗口越窄,可以在感兴趣的基因组目标位置引入编辑越精确。
在一实施方案中,碱基编辑复合物含有UGI(尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂)组分。在某些实施方案中,可以使用源自枯草芽孢杆菌的UGI或抑制UDG活性的任何其他结构域来抑制在某些细胞中具有活性的内源性碱基切除修复(BER)的活性。适用于本发明方法的示例性UGI组分由SEQ ID NO:21表示。
在又一实施方案中,碱基编辑复合物包含XTEN组分,即特定接头,以提供与至少一个位点特异性效应物连接的至少一个碱基编辑物的最佳脱氨基活性。可以使用在碱基编辑器和位点特异性效应物之间具有至少2个核苷酸(nt)长度的其他接头,其不影响由位点特异性效应物赋予的结合活性和/或碱基编辑器的碱基编辑活性。合适的XTEN接头序列由SEQID NO:1(688至735位),SEQ ID NO:2(706至753位),SEQ ID NO:14(706至753位)或SEQ IDNO:15(位置706至753)提供。本领域技术人员已知多种其他接头以及接头设计的文献。因此,根据本发明的各种方法,可以使用刚性以及柔性接头。
根据本发明的示例性融合构建体示于SEQ ID NO:1、2、14、15或16。
在一个实施方案中,所述至少一个碱基编辑复合物包括多于一个的组件,并且其中所述至少两个组件是物理链接的。物理连接可以包含共价键,例如通过将DNA片段彼此融合以在表达后形成融合蛋白,或通过将根据本公开内容的复合物的不同组分彼此化学交联。物理连接可以另外包含非共价相互作用。非共价相互作用或附着因此包括静电相互作用、范德华力、TT效应和疏水效应。在核酸分子背景下特别重要的是氢键作为静电相互作用。氢键(H-键)是特定类型的偶极-偶极相互作用,其涉及部分正氢原子与未与所述氢原子共价结合的高度负电、部分负的氧、氮、硫或氟原子之间的相互作用。
在另一实施方案中,碱基编辑复合物含有来自海萤光素的PmCDA1(活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)直系同源物PmCDA1,参见Nishida等(Science 2016,vol.353,issue6305,aaf8729))组分作为碱基编辑器。根据本发明的方法使用的示例性PmCDA1提供于SEQ IDNO:22。
基于CRISPR的核酸酶通过识别存在于待修饰的感兴趣的基因组目标区域内的前间隔区相邻基序(PAM)而起作用。为了进一步增加使用修饰的基于CRISPR的核酸酶的碱基编辑的范围和精确度,引入不同的PAM特异性以扩大可靶向的位点的数目因此是非常感兴趣的(Kim等,Nat.Biotech.,2017,doi:10.1038/nbt.3808)。如技术人员已知的,野生型CRISPR核酸酶具有核酸酶与核酸酶之间不同的内在PAM特异性。根据本发明,设想了基于CRISPR的核酸酶,其具有改变的PAM特异性和因此修饰的靶向范围,例如接受NGA(VQR-Cas9)、NGAG(EQR-Cas9)或NGCG的SpCas9突变体(VRER-Cas9)PAM序列以及包含将变体的PAM要求放松到NNNRRT的三个突变(SaKKH-Cas9)的工程化SaCas9变体(Kleinstiver等,Nat.Biotechnol.33,1293-1298(2015))。适合于不同的基于CRISPR的核酸酶的根据本发明的示例性PAM序列由SEQ ID NO:3-13和23表示。
在一个实施方案中,所述至少一个碱基编辑复合物包括多于一个的组件,其中所述至少两个组件作为单独的组件提供。这种方法可适用于某些转化或转染策略。
在根据本发明的方法的某些实施方案中,根据本发明的任何复合物的至少一种组分可以包含可与感兴趣的细胞内的同源结合配偶体特异性相互作用或缔合的部分,使得复合物将在细胞内形成,或者该复合物可以在转化或转染之前体外形成。结合对可通过对接结构域或结合结构域或编码其的核酸序列缔合,选自生物素、适体、DNA、RNA或蛋白质染料(所述染料包含荧光素,或包含荧光素,或它们的变体)、马来酰亚胺或四唑盐(XTT)、特异性配置为与至少一种修复模板核酸序列相互作用的向导核酸序列、链霉抗生物素蛋白或其变体(优选单体抗生物素蛋白,抗生物素蛋白或其变体)、亲和标签(优选抗生蛋白链菌素标签)、抗体、单链可变片段(scFv)、对特定抗体或scFv特异的抗原、单域抗体(纳米抗体)、anticalin、农杆菌VirD2蛋白或其结构域、Picornavirus VPg、拓扑异构酶或其结构域、PhiX174噬菌体A蛋白、PhiX A*蛋白、VirE2蛋白或其结构域或地高辛配基。其他合适的结合对是技术人员已知的。最优选地,同源结合配偶体在生理条件下彼此具有高亲和常数或结合亲和力并因此具有低解离常数(Kd),即在低μM或优选nM范围内的Kd值,并且优选低于以辅助根据本发明的至少一种碱基编辑复合物或至少一种位点特异性效应复合物的复合物形成。
在根据本发明的方法的所有方面的一实施方案中,所述至少一个碱基编辑复合物的至少一个组分和/或所述至少一个位点特异性效应物复合物的至少一种组分包含至少一个细胞器定位信号以将至少一个碱基编辑复合物靶向亚细胞器。在一个实施方案中,至少一个细胞器定位信号是核定位信号(NLS)。在另一实施方案中,所述至少一个细胞器定位信号是叶绿体转运肽。在又一实施方案中,所述至少一个细胞器定位信号是线粒体转运肽。可以存在一个或多个定位信号,其与碱基编辑的至少一个组件或位点特异性效应物复合物相关联。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是编码至少一种表型可选择性状的基因组靶位点,其中所述至少一种表型可选择性状是抗性/耐受性状或生长优势性状,并且其中所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰赋予针对待添加到该至少一种修饰的植物细胞、组织或植物或其后代的化合物或触发剂的抗性/耐受性或生长优势。
本文所用的“生长优势”是指在植物发育和繁殖的所有阶段期间的任何生理或代谢上有利的性质,例如有利于对生物和非生物胁迫的抗性,或例如,在诸如干旱、盐度等胁迫条件下影响植物生长和发育。
因此,根据本发明的“化合物”或“触发剂”可以是除草剂,例如选自细胞代谢抑制剂,例如:EPSPS抑制(甘氨酸,例如草甘膦);ALS/AHAS(支链氨基酸生产)抑制(例如咪唑啉,磺酰脲);脂质合成抑制/ACCase(芳氧基苯氧基丙酸酯(FOPs),环己二酮(DIMs),苯基吡唑啉(DENs);谷氨酰胺合成酶抑制剂(草铵膦/膦丝菌素),生长/细胞***抑制剂,例如植物细胞生长干扰剂(苯氧基羧酸,如,2,4-D),合成植物生长素(苯甲酸例如麦草畏),生长素运输抑制(phtalamates);以及干扰光过程,例如:HPPDs(吡唑和异恶唑)的漂白剂/抑制剂;光***II(PS II)抑制剂)(三嗪,三嗪酮,哒嗪酮,C3:碘苯腈和溴苯腈等);原卟啉原氧化酶(PPO/PPX)抑制剂(例如二苯基醚和N-苯基二甲酰亚胺)。
此外,根据本发明的“化合物”或“触发剂”可以是植物生长因子或植物内源产生的或外源施用的影响植物代谢的任何其他物质。
对于本文公开的方法的所有实施方案,所述化合物或触发剂可以外源施用以允许选择感兴趣的性状,所述表型可选择性状由根据本发明所有方面的各种方法以靶向方式修饰的至少一个植物细胞、组织、器官、材料或整株植物编码。因此,以表型可选择性状的修饰形式提供特定的相互作用对以及在随后的选择和杂交步骤期间提供相应的化合物或触发剂可以改善任何育种工作。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一种表型可选的感兴趣性状是至少一个内源基因或由至少一个内源基因编码,或其中所述至少一种感兴趣的表型性状至少是或由至少一个转基因编码,其中所述至少一个内源基因或所述至少一个转基因编码选自对抑制、破坏或杀死缺乏在所述至少一种感兴趣的表型性状上的至少一种修饰的细胞的植物毒素优选除草剂的抗性/耐受性,或其中所述至少一种表型性状选自细胞***、生长速率、胚胎发生的增强剂,或另一种表型可选择的性质,所述性质为修饰的细胞、组织、器官或植物提供与未修饰的细胞、组织、器官或植物相比的优势。
在根据本发明各个方面的另一实施方案中,所述至少一个第一植物基因组靶位点是编码至少一种表型可选择性状的至少一个内源基因或转基因,所述表型可选择性状选自除草剂抗性/耐受性,其中除草剂抗性/耐受性选自包括对EPSPS抑制剂(包括草甘膦)的抗性/耐受性;对谷氨酰胺合成抑制剂包括草铵膦的抗性/耐受性;对ALS-或AHAS-抑制剂(包括咪唑啉或磺酰脲)的抗性/耐受性;对ACCase抑制剂(包括芳氧基苯氧基丙酸(FOP))的抗性/耐受性;对类胡萝卜素生物合成抑制剂的抗性/耐受性,包括八氢番茄红素去饱和酶步骤的类胡萝卜素生物合成抑制剂、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或其他类胡萝卜素生物合成靶抑制剂;对纤维素抑制剂的抗性/耐受性;对脂质合成抑制剂的抗性/耐受性;对长链脂肪酸抑制剂的抗性/耐受性;对微管组装抑制剂的抗性/耐受性;对光***I电子分流剂的抗性/耐受性;对光***II抑制剂(包括氨基甲酸酯、三嗪类和三嗪酮类)的抗性/耐受性;对PPO-抑制剂的抗性/耐受性和对合成生长素(包括麦草畏(2,4-D,即2,4-二氯苯氧乙酸))的抗性/耐受性。
在根据本发明各个方面的另一实施方案中,所述至少一个内源基因或所述至少一个转基因编码至少一种表型性状,所述表型性状选自:对生物胁迫的抗性/耐受性,包括病原体抗性/耐受性,其中病原体选自病毒,细菌,真菌或动物病原体;对非生物胁迫的抗性/耐受性,包括耐寒性/耐受性,干旱胁迫抗性/耐受性,渗透抗性/耐受性,抗热胁迫抗性/耐受性,抗冷性/耐受性,抗氧化胁迫抗性/耐受性,重金属胁迫抗性/耐受性,盐胁迫或洪涝抗性/耐受性,倒伏抗性/耐受性,碎裂抗性/耐受性;或其中感兴趣的至少一种表型性状是选自感兴趣的另外农学性状的改变,包括产量增加、开花时间修饰、种子颜色修饰、胚乳组合物修饰、营养含量修饰或感兴趣途径的代谢工程改造。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一种表型可选择性状是植物毒性抗性/耐受性状,优选除草剂抗性/耐受性状,并且其中待修饰的至少一个植物细胞的第一基因组靶位点中的至少一个第一靶向碱基修饰赋予对植物毒性化合物,优选除草剂的抗性/耐受性,所述化合物是待加入至少一个修饰的植物细胞、组织、器官或整体或其后代中的外源性化合物。
根据本发明的各个方面,由感兴趣的植物细胞的基因组编码的任何其他表型可选择性状可以作为至少一个第一靶向修饰的靶,条件是至少一个基因已知编码感兴趣的表型可选择性状,并相应的和互补的化合物或触发器可用或可以设计为用于筛选所述靶向修饰。对于可见的表型,筛选不需要化合物或触发剂,相反,必须已有基于观察到的视觉可筛选性状的适当读出和确定策略。
在根据各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是赋予对除草剂或植物毒性化合物的抗性或耐受性的基因,其中所述第一植物基因组靶位点包含导致至少一个相应的氨基酸转换的至少一个核酸转换,其中所述至少一个核酸转换通过至少一个碱基编辑器进行。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是ALS。任何ALS序列都适用于本发明的目的。示例性的ALS序列由SEQ ID NO:25表示。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是PPO。任何PPO序列都适用于本发明的目的。示例性的PPO序列由SEQ ID NO:26表示。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是EPSPS。任何EPSPS序列都适用于本发明的目的。示例性的EPSPS序列由SEQ IDNO:27表示。
在根据本发明各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是EPSPS、ALS或PPO或其任何等位基因或植物变体,并且其中EPSPS、ALS或PPO包含导致至少一个相应氨基酸转换的至少一个核酸转换,其中所述至少一个核酸转换通过至少一个碱基编辑器进行。
编码根据本发明的表型可选择性状的一个此类靶是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。已经显示几个单和双氨基酸取代降低了该酶的草甘膦敏感性(Sammons,R.D.和Gaines,T.A.(2014),Glyphosate resistance:state ofknowledge.Pest.Manag.Sci.,70:1367-1377)。
另一个靶是乙酰乳酸合酶(ALS)基因,其中多种单氨基酸突变已经与对***并嘧啶类、磺酰脲类、嘧啶基硫代苯甲酸类、咪唑啉酮类和磺酰氨基羰基***啉酮类的一种或多种除草剂的耐受性相关联。用于本发明目的的合适的残基取代包括A122、P197、A205、D376、W574和S653)。
另一种可选择的修饰将在玉蜀黍和拟南芥的原卟啉原氧化酶(PPO)基因中。在此,将215位半胱氨酸修饰成苯丙氨酸(A215F)、亮氨酸(A215L)或赖氨酸(A215K),以及将220位丙氨酸修饰成缬氨酸(A220V)、苏氨酸(A220T)或亮氨酸(A220L),以及221位甘氨酸至丝氨酸(A221S)或亮氨酸(A221L)涉及对PPO除草剂如二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、恶二唑、恶唑烷二酮、苯基吡唑、嘧啶二酮、噻二唑、***啉酮以及其他的抗性(Li,Xianggan等人“Development of Protoporphyrinogen Oxidase as a Efficient Selection Markerfor Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Maize.PlantPhysiology 133.2(2003):736-747.PMC.Web.15Mar.2017)。除了上述残基取代之外,烟草或其同系物中178位甘氨酸的单个氨基酸缺失阻碍了PPO抑制剂的结合,并对上述抑制剂提供了抗性(Patzoldt,W.L.et al.(2006)."A codon deletion confers resistance toherbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase"PNAS 103(33):12329-12334),并且可以根据本发明的各个方面使用。
此外,本申请中提出的技术允许精确的氨基酸修饰和缺失以及引入终止密码子以改变或中断产生可选择表型的基因序列。在编码氨基酸的61个密码子中,通过任一链上的至少一个胞嘧啶/胞苷到胸腺嘧啶/胸苷的转换,五种氨基酸可以转化成终止密码子。
进行这些修饰的工具是CRISPR核酸酶。显示提供单个或多个碱基对缺失的CRISPR核酸酶包括Cas9、Cpf1、CasX和CasY。虽然这些是目前最方便的选择,但定点核酸酶的未来发展很容易适应本申请中描述的方法。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是ALS,并且靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码A122的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码P197的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码A205的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码D376的序列处,或靶向修饰与根据SEQID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码R377的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码W574的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码S653的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:25的ALS参考序列相比发生在编码G654的序列处,或上述突变的任何组合。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是PPO,并且靶向修饰与根据SEQ ID NO:26的PPO参照序列相比,发生在编码C215、A220、G221、N425或Y426的序列处,或上述突变的任何组合。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是来自长芒苋(Amaranthus tuberculatus)的PPX2L基因产物以用于选择。在根据本发明的各个方面的一实施方案中,包含靶向碱基修饰、靶向密码子缺失或靶向移码或缺失修饰的第一靶向修饰发生在与根据SEQ ID NO:28的来自长芒苋PPX2L基因产物的G210残基相当的位置。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是EPSPS,并且至少一种靶向修饰与根据SEQ ID NO:27的EPSPS参考序列相比较,发生在编码G101、T102、P106、G144或A192的序列处,或上述突变的任何组合。在某些优选实施方案中,靶向修饰与根据SEQ ID NO:27的EPSPS参考序列相比较,发生在编码G101和G144的序列处,或者靶向修饰与根据SEQ ID NO:27的EPSPS参考序列相比较,发生在编码G101和A192的序列处,或靶向修饰与根据SEQ ID NO:27的EPSPS参考序列相比较,发生在编码T102和P106的序列处。
基于本文提供的公开内容,本领域普通技术人员还可以定义其他合适的植物毒性抗性/耐受性状和相应的突变,以产生至少一种根据本发明的表型可选择性状。
在根据本发明的各个方面的某些实施方案中,所述至少一种表型可选择性状是可用于鉴定或分离至少一个修饰的植物细胞、组织、器官或整株植物的可见表型。“可见”表型是可通过肉眼观察或显微镜观察来检测的任何表型,从而不需要通过分子生物学进行筛选。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,所述至少一种表型可选择性状是光泽表型、金色表型、色素沉着表型或生长优势表型。技术人员已知几种其他可见的表型。由于其遗传背景的原因,所述可见表型将根据感兴趣的植物或植物细胞而变化。
根据本发明的第二方面,提供了用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的植物组织、器官或完整植物而不稳定整合转基因可选择标记序列的方法,所述方法包括:(a)使用至少一个第一位点特异性效应物将至少一个第一靶向密码子缺失修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点,所述至少一个第一位点特异性效应物包含核酸酶、重组酶或DNA修饰试剂,其中所述至少一个靶向密码子缺失修饰引起至少一种表型可选择性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点,其中使用至少一个第二位点特异性效应物引入所述至少一个第二靶向修饰以在所述第二植物基因组靶位点处产生至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或者分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,通过选择(i)在所述第一植物基因组靶位点处的至少一个第一靶向密码子缺失修饰造成的至少一种表型可选择性状,以及任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的至少一个第二靶向修饰,(d)任选地:将包含所述至少一个第一和所述至少一个第二靶向修饰的至少一个经修饰的植物或植物材料与另外的感兴趣的植物或植物材料杂交以使所获得的后代植物或植物材料分离以产生感兴趣的基因型,任选地其中所述感兴趣的基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰。
在根据本发明的另一方面,提供了用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的组织、器官或完整植物而不稳定整合转基因可选择标记序列的方法,所述方法包括:(a)使用至少一个第一位点特异性效应物将至少一个第一靶向移码或缺失修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点,所述至少一个第一位点特异性效应物包含核酸酶、重组酶或DNA修饰试剂,其中所述至少一个靶向移码或缺失修饰引起至少一种表型可选择性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点,其中使用至少一个第二位点特异性效应物引入所述至少一个第二靶向修饰以在所述第二植物基因组靶位点处产生至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或者分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,通过选择(i)在所述第一植物基因组靶位点处的至少一个第一靶向移码或缺失修饰造成的至少一种表型可选择性状,以及任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的至少一个第二靶向修饰,(d)任选地:将包含所述至少一个第一和所述至少一个第二靶向修饰的至少一个经修饰的植物或植物材料与另外的感兴趣的植物或植物材料杂交以使所获得的后代植物或植物材料分离以产生感兴趣的基因型,任选地其中所述感兴趣的基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰。
如上所述,根据本发明的方法提供了组合两种不同分子复合物的新方法,一种复合物被配置成引入至少一个第一靶向修饰,导致可选择的表型而不***转基因标记,并且另一种复合物被配置以引入至少一个第二靶向修饰,其中第一修饰用于筛选目的,而第二修饰代表待引入的基因组编辑。因此,本发明的方法在不同的基因组靶位点处协同地组合基因组编辑策略以实现不同的靶向修饰,最终导致有效的育种过程以实现具有感兴趣的基因型的植物。
在某些实施例中,本发明的方法步骤b还包括引入修复模板(RT)以在所述至少一个第一和/或第二植物基因组靶位点上进行靶向序列转换或置换。该RT为基因组编辑方法增加了另一水平的精确度,因为根据本发明提供(单独提供或作为至少一种复合物的一部分提供)的合适RT,由于由核酸酶或切口酶产生的断裂可以修复,通过提供感兴趣的RT来协助同源性定向修复而不是使用依赖易出错的内源性NHEJ途径作为修复机制。在一实施方案中,使用基于CRISPR的核酸酶作为与gRNA相互作用的位点特异性效应物,其中所述gRNA可以与RT共价连接,或其中基于CRISPR的核酸酶和/或gRNA与所述RT非共价相互作用。在另一实施方案中,单独地提供RT,包括在编码感兴趣RT的构建体上添加,并且RT将通过RT内的与至少一个感兴趣的基因组靶位点退火的同源臂介导的互补碱基配对与位点特异性效应复合物缔合。
在一实施方案中,可以提供作为相互作用结构域的活性Cpf1和非活性dCas9的融合蛋白或非共价缔合的活性Cpf1和非活性dCas9作为位点特异性效应物。Cas9的gRNA可以靶向修复模板或其延伸,形成Cpf1-dCas9-RT复合物。crRNA(Cpf1)靶向定义为用于双链切割以启动HDR的基因组基因座。同样,可以使用高活性锌指蛋白,megaTAL或无活性大范围核酸酶。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,提供了通过本文公开的任何一种方法可获得的植物细胞、组织、器官、材料或完整植物或其后代。
由于本文提供的方法被特别设计以帮助提供具有农学上有利的性状但不包含转基因标记序列的新植物,所以本文公开的方法适合于快速可靠地在植物中产生多种不同的植物基因型。
在根据本发明的各个方面的一实施方案中,待修饰的至少一种植物细胞优选源自选自以下的植物:大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zea spp.)包括玉米(Zeamays)、小米(Setaria italic)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、紫短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Beta spp.)包括甜菜(Betavulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、筷子芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oeleracia)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatrophacurcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicerreticulatum)、Cicer judaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanusscarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypiumsp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Toreniafournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和韭菜(Allium tuberosum),或属于上述植物之一的任何品种或亚种。
产生经遗传修饰的无转基因植物的方法
在另一方面,本发明提供一种通过基因组编辑产生经遗传修饰的无转基因植物的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供待遗传修饰的植物的细胞或组织;
b)提供第一基因组编辑***和第二基因组编辑***,其中所述第一基因组编辑***能够靶向并修饰所述植物中的目的基因,所述第二基因组修饰***能够靶向并修饰所述植物中的内源可选择标记基因;
c)用所述第一和第二基因组编辑***共转化所述细胞或组织;
d)从所述经转化的细胞或组织再生植物;
e)从步骤d)再生的植物中选择所述可选择标记基因被修饰的植物;和
f)从步骤e)选择出的植物中鉴定目的基因被修饰的植物。
所述植物的细胞或组织包括任何可以再生成完整植物的细胞或组织,例如原生质体、愈伤组织、外植体、未成熟胚等。
如本文所用“修饰”包括改变基因序列和/或改变基因的表达。
如本文所用,术语“目的基因”意指植物中待修饰的任何核苷酸序列,包括结构基因和非结构基因。优选地,所述目的基因与植物的性状优选农艺性状相关。
如本文所用,“可选择标记基因”意指其被合适地修饰后使得植物产生能够被选择的性状的植物内源基因。优选地,所述可选择标记基因被合适地修饰后基本上不改变植物的其它性状。
例如,所述可选择标记基因可以是植物内源除草剂抗性基因,其被合适地修饰后将使得植物产生除草剂抗性。所述植物内源除草剂抗性基因包括但不限于PsbA、ALS、EPSPS、ACCase、PPO和HPPD、PDS、GS、DOXPS和P450。其中能够产生除草剂抗性的ALS基因突变位点包括但不限于A122、P197、A205、S653(氨基酸的编号参照拟南芥中ALS酶的氨基酸序列)。能够产生除草剂抗性的EPSPS基因突变位点包括但不限于T102、P106(氨基酸编号参照拟南芥中EPSPS酶氨基酸序列)。能够产生除草剂抗性的ACCase基因突变位点包括但不限于I1781、W2027、I2041、D2078、G2096(氨基酸编号参照大穗看麦娘Alopecurus myosuroides中叶绿体ACCase酶的氨基酸序列)。能够产生除草剂抗性的HPPD基因突变位点包括但不限于P277、L365、G417、G419(氨基酸的编号参照水稻中HPPD酶的氨基酸序列)。
在本发明的一些实施方案中,能够在小麦中赋予除草剂抗性的ALS突变位点包括TaALS P173。在一些实施方案中,玉米中能够赋予除草剂抗性的ALS突变位点包括ZmALSP165。在一些实施方案中,能够赋予水稻除草剂抗性的ALS突变位点包括OsALS P171。
或者,所述可选择标记基因可以是当合适地修饰后使得植物产生目视可见性状改变的基因,例如控制叶舌、叶片颜色、叶片蜡质的基因,包括但不限于LIG、PDS、zb7和GL2。
传统的植物修饰方法(转基因方法)需要在植物再生期间施加一定的选择压力进行筛选(例如根据使用的转基因载体不同而使用不同抗生素进行筛选),以提高成功率。然而,这样将会使植物基因组中整合有外源基因特别是抗生素抗性基因,存在安全性问题。
通过使用基因组编辑技术进行植物修饰,基因组编辑***可以不整合进植物基因组即可实现目的基因的修饰。因此,在本发明的方法中,步骤d)的再生优选地在无选择压力下进行。这样可以避免外源基因的整合,获得经遗传修饰(基因组编辑)的无转基因植物。然而,无选择压力下再生植物会大大降低筛选效率。
这一问题在本发明中创造性地通过共转化靶向目的基因的基因组编辑***和靶向内源可选择标记基因的基因组编辑***解决。
不受任何理论限制,在本发明的方法中,靶向目的基因的基因组编辑***和靶向内源可选择标记基因的基因组编辑***共转化至植物(如植物细胞或组织)中后,对目的基因和内源可选择标记基因的编辑将倾向于一起发生。因此,根据内源可选择标记基因选择出的植物将有很大的概率其目的基因也被修饰。首先针对内源可选择标记基因的编辑进行筛选将大大提高对目的基因编辑的筛选效率。并且,由于仅仅使用了内源可选择标记基因,避免了转基因问题。本发明中,所述内源可选择标记基因优选在被修饰后不会影响感兴趣的性状,例如不会降低产量等。更优选地,所述内源可选择标记基因的修饰赋予所述植物额外的感兴趣的性状,例如除草剂抗性。也即是说,优选本发明中所述可用于选择植物的性状也是农艺学上有用的性状,例如除草剂抗性。
进行步骤e)中所述选择的方法取决于所述可选择标记基因的性质。例如,如果所述可选择标记基因被修饰后赋予植物除草剂抗性,则可以将再生的植物置于合适浓度(该浓度下具有野生型可选择标记基因的植物不能存活或生长很差)的除草剂下生长,选择在该浓度下存活或生长良好的植物。
步骤f)中所述鉴定可以通过例如PCR/RE、或者测序方法进行。本领域技术人员熟知如何鉴定基因突变与否的方法。
适合于本发明的转化植物(细胞或组织)的方法包括但不限于基因枪法、PEG介导的原生质体转化和土壤农杆菌介导的转化。
本发明并不特别限制使用的基因组编辑***,只要其能够实现对植物基因组的精确编辑。例如,适于本发明使用的基因组编辑***包括但不限于单碱基编辑(PBE)***、CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPRi***、锌指核酸酶***和TALEN***。选择或设计合适的靶向目的基因和内源可选择标记基因的基因组编辑***在本领域技术人员的技能范围内。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇的规律间隔的短回文重复序列)***是在进化过程中产生的细菌用于防御外来基因入侵的免疫***。目前已经被改造并广泛用于真核生物的基因组编辑。
CRISPR-Cas9***是指基于Cas9核酸酶的基因组CRISPR编辑***。“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用,指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关***)原核免疫***的组分,能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。适用于本发明的CRISPR-Cas9***包括但不限于记载于Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using aCRISPR-Cas system.Nat.Biotechnol.31,686-688(2013)的***。
“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用。在CRISPR-Cas9***中,向导RNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成,其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而,本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA),其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。
本发明的CRISPR-Cas9***可以包含以下之一:
i)Cas9蛋白,和向导RNA;
ii)包含编码Cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和向导RNA;
iii)Cas9蛋白,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;
iv)包含编码Cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;或
v)包含编码Cas9蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。
CRISPR-Cpf1***是基于Cpf1核酸酶的CRISPR基因组编辑***。Cpf1与Cas9的区别在于蛋白分子量较小,并且只需要crRNA作为向导RNA,PAM序列也有所不同。适用于本发明的CRISPR-Cpf1***包括但不限于记载于Tang et al.,2017的***。
本发明的CRISPR-Cpf1***可以包含以下之一:
i)Cpf1蛋白,和向导RNA(crRNA);
ii)包含编码Cpf1蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和向导RNA;
iii)Cpf1蛋白,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;
iv)包含编码Cpf1蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;或
v)包含编码Cpf1蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。
CRISPR干扰(CRISPRi)是衍生自CRISPR-Cas9***的一种基因沉默***,其使用的是核酸酶失活的Cas9蛋白。此***尽管并没有改变靶基因的序列,在本文范围内也定义为基因组编辑***。适用于本发明的CRISPRi***包括但不限于Seth and Harish,2016中记载的***。
本发明的CRISPRi***可以包含以下之一:
i)核酸酶失活的Cas9蛋白,和向导RNA;
ii)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和向导RNA;
iii)核酸酶失活的Cas9蛋白,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;
iv)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;或
v)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。
单碱基编辑***是最近基于CRISPR-Cas9开发出的一种可以对基因组进行精确单碱基编辑的***,其使用核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白。核酸酶失活的Cas9(由于DNA切割结构域的亚结构域HNH亚结构域和/或RuvC亚结构域的突变造成)保留gRNA指导的DNA结合能力,胞苷脱氨酶可以催化DNA上胞苷(C)的脱氨化作用形成尿嘧啶(U)。将核酸酶失活的Cas9与胞苷脱氨酶融合,在向导RNA的指导下,融合蛋白可以靶向植物基因组中的靶序列,由于Cas9核酸酶活性缺失,DNA双链不被切割,而融合蛋白中的脱氨酶结构域能够将Cas9-向导RNA-DNA复合物形成中产生的单链DNA的胞苷脱氨转换成U,再通过碱基错配修复实现C至T的取代。适用于本发明的单碱基编辑***包括但不限于记载于Zonget al.,2017的***。
本发明的单碱基编辑***可以包含以下之一:
i)核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白,和向导RNA;
ii)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和向导RNA;
iii)核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;
iv)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体,和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体;或
v)包含编码核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。
在一些实施方案中,所述核酸酶失活的Cas9蛋白相对于野生型Cas9(化脓链球菌SpCas9)包含氨基酸取代D10A和/或H840A。所述胞苷脱氨酶的实例包括但不限于:APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G或CDA1(PmCDA1)。
“锌指核酸酶(ZFN)”是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备的人工限制性酶。单个ZFN的锌指DNA结合结构域通常含有3-6个单独的锌指重复序列,每个锌指重复序列可以识别例如3bp。适用于本发明的ZFN***例如可以参考Shukla et al.,2009和Townsend et al,2009的记载获得。
“转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)”是可以经工程化而可以切割特定DNA序列的限制性酶,通常通过将转录激活因子样效应物(TALE)的DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备。TALE经工程化后可以结合几乎任何想要的DNA序列。适用于本发明的TALEN***例如可以参考Li et al.,2012的记载获得。
本领域技术人员可以根据不同基因组编辑***的各自特性以及所需实现的具体基因组编辑类型来合适地确定本发明方法中第一基因组编辑***和第二基因组编辑***的组合,例如选择合适的组合避免相互之间的干扰,例如可以共享gRNA的不同***之间的干扰。
例如,如果内源可选择标记基因需要使用单碱基编辑***进行精确突变以产生可选择性状,通常而言不使用CRISPR-Cas9***靶向目的基因,因为这两种***可以共享gRNA,Cas9在敲除目的基因外还可能敲除内源可选择标记基因。反之亦然。
在本发明方法的一些优选实施方案中,其中所述第一和第二基因组编辑***均是单碱基编辑***。
在本发明的一些实施方式中,所述第一和第二基因组编辑***的各组分可以由同一表达构建体表达或由不同表达构建体表达,这可以由本领域技术人员便利地选择。例如,可以用同一表达构建体转录针对目的基因和可选择标记基因的向导RNA。优选地,所述第一和第二基因组编辑***的各组分由同一表达构建体表达。
在本发明方法的一些具体实施方案中,其中所述第一和第二基因组编辑***均是单碱基编辑***,且核酸酶失活的Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白以及针对目的基因和可选择标记基因的向导RNA由同一表达构建体表达。
在本发明方法的一些实施方案中,所述植物是单子叶植物或双子叶植物,例如,所述植物选自大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghumbicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zea spp.)包括玉米(Zea mays)、小米(Setaria italic)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、紫短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Beta spp.)包括甜菜(Betavulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、筷子芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oeleracia)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatrophacurcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicerreticulatum)、Cicer judaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanusscarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypiumsp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Toreniafournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和韭菜(Allium tuberosum),或属于上述植物之一的任何品种或亚种。在一些实施方案中,所述植物是作物植物。
在本发明的一些实施方式中,所述方法还包括获得所述经遗传修饰的无转基因植物的后代。
在另一方面,本发明还提供了经遗传修饰的植物或其后代或其部分,其中所述植物通过本发明上述的方法获得。
在另一方面,本发明还提供了一种植物育种方法,包括将通过本发明上述的方法获得的经遗传修饰的第一植物与不含有所述遗传修饰的第二植物杂交,从而将所述遗传修饰导入第二植物。
通过同时靶向植物中待修饰的目的基因和内源可选择标记基因,大大提高了通过基因组编辑方法产生经遗传修饰的无转基因植物的筛选效率。通过本发明的方法,对于突变率小于1%的目的基因,其无转基因突变体的筛选效率可以提高大约10-100倍。
递送方法:
本领域技术人员已知用于将遗传物质引入植物细胞的各种合适的递送技术。通过选择从原生质体的聚乙二醇(PEG)处理(Potrykus等,1985)直接递送技术,诸如电穿孔(D'Halluin等,1992),显微注射(Neuhaus等,1987),碳化硅纤维晶须技术(Kaeppler等,1992),病毒载体介导的方法(Gelvin,Nature Biotechnology 23,“Viral-mediated planttransformation gets a boost”,684-685(2005))和粒子轰击(参见例如Sood et al.,2011,Biologia Plantarum,55,1-15)。
尽管基于生物学方法的转化方法,如农杆菌转化或病毒载体介导的植物转化,以及基于物理递送方法(如粒子轰击或显微注射)的方法已经演化为用于将遗传物质引入感兴趣的植物细胞或组织的突出技术。Helenius等人(“使用HeliosTM基因枪将基因输送到完整植物中”,Plant Molecular Biology Reporter,2000,18(3):287-288)公开了作为将物质引入植物细胞的物理方法的粒子轰击。因此,目前存在多种将基因构建体形式的遗传物质引入感兴趣的植物细胞中的植物转化方法,包括植物生物技术领域的技术人员已知的生物和物理手段,并且可以应用以引入至少一个碱基编辑器和至少一个特定位置效应器以及包括至少一个碱基编辑器和至少一个特定位置效应器的相应复合物。值得注意的是,所述用于转化和转染的递送方法可以用于同时引入本发明的工具。常见的生物手段是用农杆菌转化。几十年来已经用于各种不同的植物材料。病毒载体介导的植物转化代表将遗传物质引入感兴趣的细胞的进一步策略。在植物生物学中找到应用的物理手段是粒子轰击,也称为生物射弹转染或微粒介导的基因转移,其是指用于将包含感兴趣的核酸或遗传构建体的包被微粒或纳米粒子转移到靶细胞中的物理输送方法或组织。物理引入装置适合于引入核酸,即RNA和/或DNA和蛋白质。同样,存在用于将感兴趣的核酸或氨基酸构建体特异性引入植物细胞中的特定转化或转染方法,包括电穿孔,显微注射,纳米颗粒和细胞穿透肽(CPP)。此外,存在基于化学的转染方法以引入基因构建体和/或核酸和/或蛋白质,其中包括用磷酸钙转染,用脂质体例如阳离子脂质体转染或用阳离子聚合物转染,包括DEAD-葡聚糖或聚乙烯亚胺,或其组合。所述递送方法和递送载体或货物因此与用于其他真核细胞(包括动物和哺乳动物细胞)的递送工具本质上不同,并且每种递送方法都必须进行特定的微调和优化,使得用于介导基因组编辑的感兴趣的构建体可以以全功能和主动的方式引入感兴趣的目标细胞的特定隔室中。单独或组合的上述递送技术可用于将根据本发明的至少一种分子复合物,即碱基编辑复合物和/或位点特异性效应物复合物或其至少一种亚组分,即至少一个SSN,至少一个gRNA,至少一个RT或至少一个碱基编辑器,或编码前述亚组分的序列,根据本发明在体内或体外转化至靶细胞。
根据本发明,物理和化学递送方法是特别优选的,因为所述方法允许共同递送以及因此将各种感兴趣的工具平行引入到至少一个植物细胞中。
在某些实施方案中,gRNA的crRNA部分包含茎环或优化的茎环结构或优化的二级结构。在另一实施方案中,成熟crRNA在直接重复序列中包含茎环或优化的茎环结构,其中茎环或优化的茎环结构对于裂解活性是重要的。在某些实施方案中,成熟crRNA优选包含单一茎环。在某些实施方案中,直接重复序列优选包含单个茎环。在某些实施方案中,通过引入影响茎环RNA双链体结构的突变来修饰效应蛋白复合物的裂解活性。在优选的实施方案中,可以引入保持茎环的RNA双链体的突变,由此维持效应蛋白复合物的切割活性。在其他优选的实施方案中,可以引入破坏茎环的RNA双链体结构的突变,由此完全消除效应蛋白复合物的裂解活性。
值得注意的是,根据本发明各方面的方法,第一和/或第二靶向修饰不限于编码氨基酸的编码区内的修饰的。也设想对调控序列进行修改。具有表观遗传效应的任何修饰也可以通过本发明的方法来解决。
在一实施方案中,待修饰的至少一个基因组靶序列可以是调控序列,如启动子,其中启动子的编辑包括用不同的启动子(也称为置换启动子)或启动子替换启动子或启动子片段片段(也称为替代启动子片段),其中所述启动子替代导致以下任一种或以下任何一种组合:增加的启动子活性,增加的启动子组织特异性,降低的启动子活性,减少的启动子组织特异性,新的启动子活性,诱导型启动子活性,延伸的基因表达窗口,相同细胞层或其他细胞层中基因表达的时间或发育进程的修饰,例如花药绒毡层延长基因表达的时间,DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的启动子(或启动子片段)可以是对正在编辑的细胞是内源的、人造的、预先存在的或转基因的启动子(或启动子片段)。替换启动子或其片段可以是对正在编辑的细胞是内源的、人造的、预先存在的或转基因的启动子或其片段。
在一实施方案中,所述至少一种基因组靶序列可以是其中编码启动子包括用植物泛素启动子替代天然EPSPS1启动子的启动子。在另一实施方案中,待修饰的至少一个基因组靶序列可以是启动子,其中待编辑的启动子选自玉米-PEPC1启动子(Kausch等,PlantMolecular Biology,45:1-15,2001),玉米泛素启动子(UBI1ZM PRO,Christensen等,植物分子生物学18:675-689,1992),水稻肌动蛋白启动子(McElroy等,The Plant Cell,Vol 2,163-171,1990年2月),玉米-GOS2启动子(美国专利号6,504,083)或玉米油质蛋白启动子(美国专利号8,466,341)。
在一实施方案中,所述至少一个位点特异性效应复合物可以与共递送的RT组合使用,以允许将启动子或启动子元件***感兴趣的基因组核苷酸序列中而不掺入可选择的转基因标记,其中启动子***(或启动子元件***)导致以下任何一种或以下任何一种组合:增加的启动子活性。即增加的启动子强度,增加的启动子组织特异性,降低的启动子活性,降低的启动子组织特异性,新的启动子活性,诱导型启动子活性,延伸的基因表达窗口,修饰基因表达的时间或发育进程DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待***的启动子元件可以是但不限于启动子核心元件,例如但不限于CAAT盒,CCAAT盒,Pribnow盒,和/或TATA盒,翻译调控序列和/或用于诱导型表达的阻遏物***,如TET操纵阻遏物/操纵基因/诱导物元件或磺酰脲阻遏物/操纵基因/诱导物元件。在含有9bp保守核心序列TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki,K。和Shinozaki,CA)的干旱响应基因rd29A的启动子中首先鉴定出脱水响应元件(DRE)为顺式作用启动子元件。K.(1994)Plant Cell 6,251-264)将DRE***内源启动子可赋予下游基因的干旱诱导型表达。另一个例子是ABA反应元件(ABRE),其含有发现存在于许多ABA和/或胁迫调节基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(BuskPK,Pages M.(1998)Plant Mol.Biol。37:425-435)。将35S增强子或MMV增强子***内源启动子区域将增加基因表达(美国专利号5,196,525)。待***的启动子或启动子元件可以是内源的、人造的、预先存在的或转基因于正在编辑的细胞的启动子或启动子元件。
在一实施方案中,所述至少一个位点特异性效应物复合物可用于在内源性FMT1启动子前***增强子元件,例如但不限于花椰菜花叶病毒35S增强子,以增强FTM1的表达。在另一实施方案中,所述至少一种位点特异性效应物复合物可以用于将TET操纵阻遏物/操纵基因/诱导物***的组分或磺酰脲阻遏物/操纵基因/诱导物***的组分***植物基因组中以产生或控制诱导型表达***而不掺入可选择的转基因标记。
在另一实施方案中,所述至少一个位点特异性效应物复合物可用于允许缺失启动子或启动子元件,其中启动子缺失(或启动子元件缺失)导致以下任一种或任何一种如下:永久失活的基因座,增加的启动子活性(增加的启动子强度),增加的启动子组织特异性,降低的启动子活性,降低的启动子组织特异性,新的启动子活性,诱导型启动子活性,基因表达,基因表达的时间或发育进程的修饰,DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的启动子元件可以是但不限于启动子核心元件、启动子增强子元件或35S增强子元件。待缺失的启动子或启动子片段可以是正在编辑的细胞的内源的、人造的、预先存在的或转基因的。
在又一实施方案中,待修饰的至少一个感兴趣的基因组靶位点可以是终止子,其中终止子的编辑包括替换也称为“终止子交换”或“终止子替换”的终止子或终止子片段具有不同的终止子,也称为替代终止子或终止子片段,也称为替换终止子片段,其中终止子替换导致以下任一种或以下任何一种组合:增加的终止子活性,增加的终止子活性终止子组织特异性,降低的终止子活性,降低的终止子组织特异性,DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的终止子或其片段可以是对正在编辑的细胞是内源的、人造的、预先存在的或转基因的终止子。替代终止子可以是终止子或其片段,其对正在编辑的细胞是内源的、人造的、预先存在的或转基因的。
在一实施方案中,待修饰的至少一个基因组靶位点可以是终止子,其中待编辑的终止子选自玉米Argos 8或SRTF18基因的终止子或其他终止子,如马铃薯PinII终止子,高粱肌动蛋白终止子(WO 2013/184537 A1),水稻T28终止子(WO 2013/012729 A2),AT-T9TERM(WO 2013/012729 A2)或GZ-W64A TERM(美国专利号7,053,282)。
在一实施方案中,根据本发明的所述至少一种位点特异性效应复合物可以与共递送的RT序列组合使用,以允许将终止子或终止子元件***感兴趣的基因组核苷酸序列中,其中终止子(元件)***导致以下任何一种或下列任何一种组合:增加的终止子活性,即增加的终止子强度,增加的终止子组织特异性,降低的终止子活性,降低的终止子组织特异性,DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。
待***的终止子或元件或其片段可以是终止子(或终止子元件),其是正被编辑的细胞的内源的、人造的、预先存在的或转基因的。
在又一实施方案中,所述至少一种位点特异性效应物复合物可以用于允许终止子或终止子元件的缺失,其中终止子缺失(或终止子元件缺失)导致以下任何一种或任何一种组合:终止子活性增加(终止子强度增加),终止子组织特异性增加,终止子活性降低,终止子组织特异性降低,DNA结合元件突变和/或DNA结合元件增加。待缺失的终止子或终止子片段可以是正在编辑的细胞的内源的、人造的、预先存在的或转基因的。
在一实施方案中,本发明的至少一种位点特异性效应复合物可用于修饰或置换细胞基因组中的调节序列而不掺入可选择的转基因标记。调控序列是核酸分子的片段,其能够增加或减少生物体内特定基因的表达和/或能够改变生物体内基因的组织特异性表达。调节序列的实例包括但不限于3'UTR(非翻译区),5'UTR区,转录激活因子,转录增强子转录抑制因子,翻译阻遏物,剪接因子,miRNA,siRNA,人工miRNA,启动子元件,CAMV35S增强子,MMV增强子元件,SECIS元件,聚腺苷酸化信号和多聚遍在蛋白化位点。在一些实施方案中,以本发明的至少一种靶向修饰物形式进行编辑或调节元件的替换导致蛋白质翻译,RNA切割,RNA剪接,转录终止或翻译后修饰改变。在一实施方案中,可以在启动子内鉴定调控元件,并且可以编辑或修饰这些调控元件以优化这些调控元件以上调或下调启动子。
在一实施方案中,待修饰的至少一个基因组靶位点是多聚泛素化位点,其中多聚泛素位点的修饰导致蛋白质降解速率的改变。泛素标签募集蛋白质被蛋白酶体或自噬降解。已知蛋白酶体抑制剂会导致蛋白质过度生成。对编码感兴趣蛋白质的DNA序列进行的修饰可导致感兴趣蛋白质的至少一个氨基酸修饰,其中所述修饰允许蛋白质的多聚泛素化(翻译后修饰),导致蛋白质降解的修饰。
在另一实施方案中,待修饰的至少一个感兴趣基因组靶位点是玉米EPSPS基因上的多聚泛素化位点,其中由于EPSPS蛋白质降解速率较慢,修饰多聚泛素化位点导致蛋白质含量增加。
在又一实施方案中,待修饰的至少一个感兴趣的基因组靶位点是内含子位点,其中所述修饰包括将内含子增强基序***到内含子中,其导致调节包含所述基因的基因的转录活性内含子。
现在将通过以下实施例来说明本发明,这些实施例不被解释为限制本发明的范围。
实施例12:开发基于ZmALS-P197或ZmALS-G654的玉米的共编辑***
1.用碱基编辑器产生赋予除草剂抗性的氨基酸转换
选择玉米的靶氨基酸用于转化成氨基酸,所述氨基酸在对除草剂如咪唑啉酮和磺酰脲类具有抗性的杂草中出现。图5中的绿色箭头是编码或非编码链的向导序列以获得期望的转化。注意:本实施例中氨基酸残基的编号的坐标是对来自拟南芥的原型ALS基因进行标准化的。这些残基在玉米和小麦肽序列中的位置会有所不同。
2.玉米ALS中除草剂敏感的P197密码子可由碱基编辑器有效编辑
所有实验均在玉米原生质体***中进行。制备用Pol III启动子的sgRNA-Guide用于修饰ALS1和ALS2基因的P197基因座(图6,左图,顶部)和G654基因座(图6,右图,顶部)。碱基编辑器是一个单一载体,在这种情况下,由pUbi1驱动碱基编辑器和ZmU3驱动向导RNA。上面显示的结果是针对向导RNA中每个C计算的%C至T转换频率,并且均减去针对ALS1和ALS2阴性对照的背景。此处显示的频率没有说明P197密码子中的一个或两个C是否在同一个细胞中发生变化。在G654位点,变化也很明显,但程度较小。
3.除草剂敏感性残基以达6%的处理细胞的频率转化为除草剂抗性(图7)
分析图6中所示数据的另一种方式是通过计数显示所需氨基酸密码子转换的读段的数量。最终的%数据标准化为原生质体转化效率。
上图:-显示在ALS1和ALS2基因座处脯氨酸197已经被转化为亮氨酸或丝氨酸的读段的百分比。数据来自使用Pol III启动子的实验。
中图:-显示在ALS1和ALS2基因座处脯氨酸197已被转化为亮氨酸或丝氨酸的读段的百分比。数据来自实验,其中使用了Pol II启动子和用于sgRNA的核酶传递策略。
底部图:-显示在ALS1和ALS2基因座处甘氨酸654已经转化为天冬氨酸的读段的百分比。数据来自实验,其中使用了Pol III启动子和用于sgRNA的核酶传递策略。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 不使用转基因标记序列分离细胞的方法
<130> NTD142650
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APOBEC1 XTEN nCas9(D10A) UGI NLS construct
<400> 1
atgagctcag agactggccc agtggctgtg gaccccacat tgagacggcg gatcgagccc 60
catgagtttg aggtattctt cgatccgaga gagctccgca aggagacctg cctgctttac 120
gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180
cacgtcgaag tcaacttcat cgagaagttc acgacagaaa gatatttctg tccgaacaca 240
aggtgcagca ttacctggtt tctcagctgg agcccatgcg gcgaatgtag tagggccatc 300
actgaattcc tgtcaaggta tccccacgtc actctgttta tttacatcgc aaggctgtac 360
caccacgctg acccccgcaa tcgacaaggc ctgcgggatt tgatctcttc aggtgtgact 420
atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 480
ccgagtaatg aagcccactg gcctaggtat ccccatctgt gggtacgact gtacgttctt 540
gaactgtact gcatcatact gggcctgcct ccttgtctca acattctgag aaggaagcag 600
ccacagctga cattctttac catcgctctt cagtcttgtc attaccagcg actgccccca 660
cacattctct gggccaccgg gttgaaaagc ggcagcgaga ctcccgggac ctcagagtcc 720
gccacacccg aaagtgataa aaagtattct attggtttag ccatcggcac taattccgtt 780
ggatgggctg tcataaccga tgaatacaaa gtaccttcaa agaaatttaa ggtgttgggg 840
aacacagacc gtcattcgat taaaaagaat cttatcggtg ccctcctatt cgatagtggc 900
gaaacggcag aggcgactcg cctgaaacga accgctcgga gaaggtatac acgtcgcaag 960
aaccgaatat gttacttaca agaaattttt agcaatgaga tggccaaagt tgacgattct 1020
ttctttcacc gtttggaaga gtccttcctt gtcgaagagg acaagaaaca tgaacggcac 1080
cccatctttg gaaacatagt agatgaggtg gcatatcatg aaaagtaccc aacgatttat 1140
cacctcagaa aaaagctagt tgactcaact gataaagcgg acctgaggtt aatctacttg 1200
gctcttgccc atatgataaa gttccgtggg cactttctca ttgagggtga tctaaatccg 1260
gacaactcgg atgtcgacaa actgttcatc cagttagtac aaacctataa tcagttgttt 1320
gaagagaacc ctataaatgc aagtggcgtg gatgcgaagg ctattcttag cgcccgcctc 1380
tctaaatccc gacggctaga aaacctgatc gcacaattac ccggagagaa gaaaaatggg 1440
ttgttcggta accttatagc gctctcacta ggcctgacac caaattttaa gtcgaacttc 1500
gacttagctg aagatgccaa attgcagctt agtaaggaca cgtacgatga cgatctcgac 1560
aatctactgg cacaaattgg agatcagtat gcggacttat ttttggctgc caaaaacctt 1620
agcgatgcaa tcctcctatc tgacatactg agagttaata ctgagattac caaggcgccg 1680
ttatccgctt caatgatcaa aaggtacgat gaacatcacc aagacttgac acttctcaag 1740
gccctagtcc gtcagcaact gcctgagaaa tataaggaaa tattctttga tcagtcgaaa 1800
aacgggtacg caggttatat tgacggcgga gcgagtcaag aggaattcta caagtttatc 1860
aaacccatat tagagaagat ggatgggacg gaagagttgc ttgtaaaact caatcgcgaa 1920
gatctactgc gaaagcagcg gactttcgac aacggtagca ttccacatca aatccactta 1980
ggcgaattgc atgctatact tagaaggcag gaggattttt atccgttcct caaagacaat 2040
cgtgaaaaga ttgagaaaat cctaaccttt cgcatacctt actatgtggg acccctggcc 2100
cgagggaact ctcggttcgc atggatgaca agaaagtccg aagaaacgat tactccatgg 2160
aattttgagg aagttgtcga taaaggtgcg tcagctcaat cgttcatcga gaggatgacc 2220
aactttgaca agaatttacc gaacgaaaaa gtattgccta agcacagttt actttacgag 2280
tatttcacag tgtacaatga actcacgaaa gttaagtatg tcactgaggg catgcgtaaa 2340
cccgcctttc taagcggaga acagaagaaa gcaatagtag atctgttatt caagaccaac 2400
cgcaaagtga cagttaagca attgaaagag gactacttta agaaaattga atgcttcgat 2460
tctgtcgaga tctccggggt agaagatcga tttaatgcgt cacttggtac gtatcatgac 2520
ctcctaaaga taattaaaga taaggacttc ctggataacg aagagaatga agatatctta 2580
gaagatatag tgttgactct taccctcttt gaagatcggg aaatgattga ggaaagacta 2640
aaaacatacg ctcacctgtt cgacgataag gttatgaaac agttaaagag gcgtcgctat 2700
acgggctggg gacgattgtc gcggaaactt atcaacggga taagagacaa gcaaagtggt 2760
aaaactattc tcgattttct aaagagcgac ggcttcgcca ataggaactt tatgcagctg 2820
atccatgatg actctttaac cttcaaagag gatatacaaa aggcacaggt ttccggacaa 2880
ggggactcat tgcacgaaca tattgcgaat cttgctggtt cgccagccat caaaaagggc 2940
atactccaga cagtcaaagt agtggatgag ctagttaagg tcatgggacg tcacaaaccg 3000
gaaaacattg taatcgagat ggcacgcgaa aatcaaacga ctcagaaggg gcaaaaaaac 3060
agtcgagagc ggatgaagag aatagaagag ggtattaaag aactgggcag ccagatctta 3120
aaggagcatc ctgtggaaaa tacccaattg cagaacgaga aactttacct ctattaccta 3180
caaaatggaa gggacatgta tgttgatcag gaactggaca taaaccgttt atctgattac 3240
gacgtcgatc acattgtacc ccaatccttt ttgaaggacg attcaatcga caataaagtg 3300
cttacacgct cggataagaa ccgagggaaa agtgacaatg ttccaagcga ggaagtcgta 3360
aagaaaatga agaactattg gcggcagctc ctaaatgcga aactgataac gcaaagaaag 3420
ttcgataact taactaaagc tgagaggggt ggcttgtctg aacttgacaa ggccggattt 3480
attaaacgtc agctcgtgga aacccgccaa atcacaaagc atgttgcaca gatactagat 3540
tcccgaatga atacgaaata cgacgagaac gataagctga ttcgggaagt caaagtaatc 3600
actttaaagt caaaattggt gtcggacttc agaaaggatt ttcaattcta taaagttagg 3660
gagataaata actaccacca tgcgcacgac gcttatctta atgccgtcgt agggaccgca 3720
ctcattaaga aatacccgaa gctagaaagt gagtttgtgt atggtgatta caaagtttat 3780
gacgtccgta agatgatcgc gaaaagcgaa caggagatag gcaaggctac agccaaatac 3840
ttcttttatt ctaacattat gaatttcttt aagacggaaa tcactctggc aaacggagag 3900
atacgcaaac gacctttaat tgaaaccaat ggggagacag gtgaaatcgt atgggataag 3960
ggccgggact tcgcgacggt gagaaaagtt ttgtccatgc cccaagtcaa catagtaaag 4020
aaaactgagg tgcagaccgg agggttttca aaggaatcga ttcttccaaa aaggaatagt 4080
gataagctca tcgctcgtaa aaaggactgg gacccgaaaa agtacggtgg cttcgatagc 4140
cctacagttg cctattctgt cctagtagtg gcaaaagttg agaagggaaa atccaagaaa 4200
ctgaagtcag tcaaagaatt attggggata acgattatgg agcgctcgtc ttttgaaaag 4260
aaccccatcg acttccttga ggcgaaaggt tacaaggaag taaaaaagga tctcataatt 4320
aaactaccaa agtatagtct gtttgagtta gaaaatggcc gaaaacggat gttggctagc 4380
gccggagagc ttcaaaaggg gaacgaactc gcactaccgt ctaaatacgt gaatttcctg 4440
tatttagcgt cccattacga gaagttgaaa ggttcacctg aagataacga acagaagcaa 4500
ctttttgttg agcagcacaa acattatctc gacgaaatca tagagcaaat ttcggaattc 4560
agtaagagag tcatcctagc tgatgccaat ctggacaaag tattaagcgc atacaacaag 4620
cacagggata aacccatacg tgagcaggcg gaaaatatta tccatttgtt tactcttacc 4680
aacctcggcg ctccagccgc attcaagtat tttgacacaa cgatagatcg caaacgatac 4740
acttctacca aggaggtgct agacgcgaca ctgattcacc aatccatcac gggattatat 4800
gaaactcgga tagatttgtc acagcttggg ggtgactctg gtggttctac taatctgtca 4860
gatattattg aaaaggagac cggtaagcaa ctggttatcc aggaatccat cctcatgctc 4920
ccagaggagg tggaagaagt cattgggaac aagccggaaa gcgatatact cgtgcacacc 4980
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<213> Artificial Sequence
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gagatcacgc tggccaacgg cgagatccgg aagagaccgc tcatcgagac caacggcgaa 3960
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accacgatcg atcggaagag atacacctcc acgaaggagg tcctggacgc gaccctcatc 4800
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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acctgagcag aaaggctcaa 20
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<220>
<223> APOBEC1 XTEN linker AsCpf1(R1226A) UGI NLS codon optimized
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ctgcggcgga gaatcgagcc acacgagttc gaggtgttct tcgacccaag ggagctccgc 120
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aggtacttct gcccaaacac ccgctgctcc atcacctggt tcctgtcctg gagcccatgc 300
ggcgagtgct ccagggccat caccgagttc ctcagccgct acccacacgt caccctgttc 360
atctacatcg ccaggctcta ccaccacgcc gacccaagga acaggcaggg cctccgcgac 420
ctgatctcca gcggcgtgac catccaaatc atgaccgagc aggagtccgg ctactgctgg 480
aggaacttcg tcaactactc cccaagcaac gaggcccact ggccaaggta cccacacctc 540
tgggtgcgcc tctacgtgct cgagctgtac tgcatcatcc tcggcctgcc accatgcctc 600
aacatcctga ggcgcaagca accacagctg accttcttca ccatcgccct ccaaagctgc 660
cactaccaga ggctcccacc acacatcctg tgggctaccg gcctcaagtc cggcagcgaa 720
acgccaggca cctccgagag cgctacgcct gaacttaaga cccaatttga gggatttacg 780
aatctttatc aagtttcaaa gacgcttagg tttgagctca ttccacaagg aaaaaccttg 840
aagcacattc aagagcaggg ctttatcgag gaagacaagg cacggaatga ccattataaa 900
gaattgaaac ccataatcga tcgcatatac aaaacttatg ccgaccaatg cttgcagctt 960
gtccaactcg actgggaaaa tctctcggct gcgatagact cttacaggaa ggaaaagaca 1020
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ataggcattt tcgtctcaac gagcatagag gaggtcttct cgttcccttt ctataaccag 1500
cttctcaccc agacacagat tgatctctat aatcaactcc ttggtggtat ttcaagggaa 1560
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aatcttgccg acgacatggt caggaactca gccagggacc tcttctatca cgcggttacg 2280
cacgacgccg ttcttgtttt tgaaaatctc tcgcggggtt ttggacggca aggtaagcgg 2340
acctttatga cggaaagaca gtacaccaaa atggaagatt ggctcaccgc gaagctcgcg 2400
tacgaggggc ttacatctaa aacgtacttg tccaaaacac tcgcccagta cactagcaaa 2460
acgtgttcta actgcggctt tacgatcact accgcggact acgacggcat gctcgtcagg 2520
ctcaagaaaa cgtctgacgg atgggcaacc acacttaaca ataaagagct caaggctgaa 2580
ggtcagatca catattataa tagatataag aggcagaccg tggagaagga gctgtcagct 2640
gagcttgaca ggttgtctga ggagtccggc aacaacgata tttctaagtg gacaaaagga 2700
cggagagatg aagcattgtt tctgctcaaa aagcggttct cgcacaggcc cgttcaggag 2760
cagtttgttt gtcttgattg cggtcacgag gtccacgcgg atgagcaggc cgctctcaat 2820
atagcgagga gctggttgtt tttgaactct aattccacag aattcaaaag ctataagtcc 2880
gggaagcaac cgttcgtggg cgcttggcaa gccttttata agcgcaggct caaggaggtt 2940
tggaaaccaa acgctaaacg ccccgcggct acaaagaagg ctggccaggc aaagaagaag 3000
aag 3003
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AsCpf1 (R1226A)
<400> 19
acccaatttg agggatttac gaatctttat caagtttcaa agacgcttag gtttgagctc 60
attccacaag gaaaaacctt gaagcacatt caagagcagg gctttatcga ggaagacaag 120
gcacggaatg accattataa agaattgaaa cccataatcg atcgcatata caaaacttat 180
gccgaccaat gcttgcagct tgtccaactc gactgggaaa atctctcggc tgcgatagac 240
tcttacagga aggaaaagac agaagaaaca agaaacgccc tcattgaaga gcaggctacg 300
tatagaaatg ctattcacga ctatttcatt ggcagaacag ataacttgac ggacgccata 360
aacaaaagac atgcggagat ctacaaggga ttgttcaaag cggagctttt caacggaaaa 420
gttctcaagc agcttggcac ggtcaccact accgaacacg aaaacgcctt gttgaggagc 480
ttcgataagt tcacgacata tttctctggt ttctatgaga atcggaagaa tgtcttctct 540
gcagaagaca tttcaaccgc aatcccacac cggattgtgc aagataactt tccgaaattt 600
aaggaaaact gtcacatctt cactaggttg attacggctg ttccatctct tagagaacac 660
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tcgttccctt tctataacca gcttctcacc cagacacaga ttgatctcta taatcaactc 780
cttggtggta tttcaaggga agccgggacg gagaagatta aggggttgaa tgaagttctc 840
aatctggcga tacagaagaa tgacgaaacc gcccatatta tagcttccct cccacatcgg 900
tttataccgt tgttcaagca gatcctgtcg gaccgcaaca cgctttcttt catactcgaa 960
gagttcaaaa gcgacgagga agtcatacag agcttctgta agtataaaac acttttgagg 1020
aatgaaaacg ttcttgaaac tgccgaggcc ttgtttaacg agctcaacag catagatctt 1080
acgcatattt ttatttccca caaaaaattg gaaactataa gctcagcgct gtgtgatcac 1140
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ggtataaagt tggaaatgga accaagcctc tcattttaca acaaggcgag gaactacgcg 1560
accaagaaac catacagcgt cgaaaagttt aagcttaact ttcaaatgcc aacgctcgct 1620
tccggttggg atgttaacaa agaaaaaaat aacggcgcca tcttgtttgt taaaaacggt 1680
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gctaaaatga tccccaagtg ctcaacacag cttaaagcgg ttaccgccca tttccagact 1860
cacacgaccc caattctctt gtcaaataac tttattgaac ccttggaaat aaccaaagag 1920
atatatgacc ttaataaccc ggagaaagaa cccaagaagt tccagacggc gtacgctaag 1980
aaaacaggag atcagaaggg ctatagggag gccctttgta aatggattga ctttacaagg 2040
gactttttgt cgaaatatac gaagaccact tcaattgacc tttcgtccct gcggccgtct 2100
agccagtata aagatttggg tgagtactat gcggaactta atcctttgtt gtaccacata 2160
tcttttcaac ggattgcaga gaaggagata atggatgcgg tcgaaacagg aaagctctat 2220
ctgttccaga tttacaataa agattttgcc aagggacacc atggaaaacc taacctgcat 2280
actctttact ggacgggtct tttctcgccg gaaaatttgg ctaagacgtc tatcaagttg 2340
aatgggcagg cagaactctt ctatcgccct aagtctagga tgaaacggat ggctcatcgg 2400
ctgggtgaaa aaatgctcaa caaaaagctt aaggatcaaa agacaccaat cccggacaca 2460
ctttatcaag aattgtacga ttacgttaat cacagactct cacatgacct ttcagatgag 2520
gcccgcgctt tgcttcccaa tgttattact aaagaggtct cgcatgagat cataaaagat 2580
agaagattca cgtctgataa gttctttttt catgtgccaa taactctcaa ctatcaggcc 2640
gcaaattcgc cgtccaagtt caaccaaagg gtgaatgcct acctcaagga gcacccggag 2700
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<213> Artificial Sequence
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<223> APOBEC1
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<212> DNA
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<223> UGI
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aagatgctg 249
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PmCDA1
<400> 22
atgaccgacg ctgagtacgt gagaatccat gagaagttgg acatctacac gtttaagaaa 60
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acagaacgtg gcattcacgc cgaaatcttt agcattagaa aagtcgaaga atacctgcgc 240
gacaaccccg gacaattcac gataaattgg tactcatcct ggagtccttg tgcagattgc 300
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atctgggctt gcaaactcta ttacgagaaa aatgcgagga atcaaattgg gctgtggaac 420
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<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protospacer sequence
<400> 23
tgttacttct aaactacata 20
<210> 24
<211> 1307
<212> PRT
<213> Acidaminococcus sp. BV3L6
<400> 24
Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln
20 25 30
Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys
35 40 45
Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln
50 55 60
Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile
65 70 75 80
Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile
85 90 95
Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly
100 105 110
Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile
115 120 125
Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys
130 135 140
Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg
145 150 155 160
Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg
165 170 175
Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg
180 185 190
Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe
195 200 205
Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn
210 215 220
Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val
225 230 235 240
Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp
245 250 255
Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
260 265 270
Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
275 280 285
Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro
290 295 300
Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu
305 310 315 320
Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr
325 330 335
Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu
340 345 350
Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His
355 360 365
Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr
370 375 380
Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys
385 390 395 400
Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu
405 410 415
Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser
420 425 430
Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala
435 440 445
Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys
450 455 460
Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu
465 470 475 480
Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe
485 490 495
Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser
500 505 510
Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val
515 520 525
Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp
530 535 540
Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn
545 550 555 560
Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys
565 570 575
Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys
580 585 590
Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys
595 600 605
Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr
610 615 620
Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln
645 650 655
Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala
660 665 670
Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr
675 680 685
Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr
690 695 700
Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His
705 710 715 720
Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu
725 730 735
Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys
740 745 750
Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu
755 760 765
Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln
770 775 780
Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His
785 790 795 800
Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr
805 810 815
Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His
820 825 830
Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn
835 840 845
Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe
850 855 860
Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln
865 870 875 880
Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu
885 890 895
Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg
900 905 910
Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu
915 920 925
Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
930 935 940
Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
945 950 955 960
Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
965 970 975
His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
980 985 990
Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu
995 1000 1005
Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu
1010 1015 1020
Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly
1025 1030 1035
Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro
1055 1060 1065
Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe
1070 1075 1080
Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe
1100 1105 1110
Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly
1115 1120 1125
Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155
Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170
Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
1175 1180 1185
Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
1190 1195 1200
Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu
1205 1210 1215
Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
1220 1225 1230
Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys
1235 1240 1245
Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp
1250 1255 1260
Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu
1265 1270 1275
Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile
1280 1285 1290
Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305
<210> 25
<211> 670
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 25
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe
1 5 10 15
Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser
20 25 30
Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala
50 55 60
Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys
65 70 75 80
Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe Ile Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gln Pro
85 90 95
Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val
100 105 110
Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln
115 120 125
Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu
130 135 140
Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys
145 150 155 160
Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val
165 170 175
Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile
180 185 190
Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu
195 200 205
Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu
210 215 220
Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Ile Ile Glu Glu Ala Phe Phe
225 230 235 240
Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys
245 250 255
Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg
260 265 270
Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His
275 280 285
Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu
290 295 300
Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe
305 310 315 320
Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His
340 345 350
Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala
370 375 380
Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu
385 390 395 400
Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu
420 425 430
Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys
435 440 445
Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro
450 455 460
Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile
465 470 475 480
Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr
485 490 495
Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala
500 505 510
Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro
515 520 525
Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn
530 535 540
Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val
545 550 555 560
Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp
565 570 575
Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala
580 585 590
Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys
595 600 605
Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala
610 615 620
Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile
625 630 635 640
Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr
645 650 655
Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr
660 665 670
<210> 26
<211> 537
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 26
Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser
1 5 10 15
Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu
20 25 30
Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu
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Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly
50 55 60
Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro
65 70 75 80
Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly
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Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly
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Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp
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Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr
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Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala
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Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu
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Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys
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<210> 27
<211> 444
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 27
Lys Ala Ser Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Leu
1 5 10 15
Ile Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu
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130 135 140
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165 170 175
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<210> 28
<211> 534
<212> PRT
<213> Amaranthus tuberculatus
<400> 28
Met Val Ile Gln Ser Ile Thr His Leu Ser Pro Asn Leu Ala Leu Pro
1 5 10 15
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Asn Ile Ser Glu Arg Glu Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val Ala Val
35 40 45
Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Asp Gly Phe Ile Trp Asp Glu Gly Ala
85 90 95
Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ala Glu Val Ser Ser Leu Ile Asp Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Leu Ser Ala Lys Ser Lys Leu Gln Ile
145 150 155 160
Met Leu Glu Pro Phe Leu Trp Arg Lys His Asn Ala Thr Glu Leu Ser
165 170 175
Asp Glu His Val Gln Glu Ser Val Gly Glu Phe Phe Glu Arg His Phe
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Val Asp Tyr Val Ile Asp Pro Phe Val Ala Gly Thr
195 200 205
Cys Gly Gly Asp Pro Gln Ser Leu Ser Met His His Thr Phe Pro Glu
210 215 220
Val Trp Asn Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Phe Ala Gly Leu Ile
225 230 235 240
Gln Ser Thr Leu Leu Ser Lys Lys Glu Lys Gly Gly Glu Asn Ala Ser
245 250 255
Ile Lys Lys Pro Arg Val Arg Gly Ser Phe Ser Phe Gln Gly Gly Met
260 265 270
Gln Thr Leu Val Asp Thr Met Cys Lys Gln Leu Gly Glu Asp Glu Leu
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530