CN108779181A

CN108779181A - 生产红细胞蛋白质的方法

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Publication number: CN108779181A
Application number: CN201680065732.6A
Authority: CN
Inventors: I.穆罗-尚特劳普; S.格内特特
Original assignee: National Institute Of Blood Transfusion; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: National Institute Of Blood Transfusion; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2018-11-09
Also published as: WO2017064294A1; JP2018531626A; CA3001637A1; US10844109B2; JP2021101705A; US20190023765A1; EP3362481A1

Abstract

本发明涉及用于合成红细胞蛋白质的新方法，其中在至少一种非离子型去污剂、脂质体或纳米盘的存在下在无细胞***中合成所述蛋白质以生产蛋白质。本发明还涉及包含以此方式生产的蛋白质的组合物。

Description

生产红细胞蛋白质的方法

导言

血型是由根据遗传标准分组为***的一组表面抗原决定的。目前，有35种血型***(ABO，Rhesus，Kell、Duffy、MNS等)，定义超过300种红细胞抗原。虽然一些具有广泛的组织分布，如ABO，但其它抗原如Rhesus(Rh)对红细胞是特异性的。由红细胞携带的某些抗原是高度免疫原性的，特别是Rh和Kell***的那些。

Rhesus(Rh)***是最复杂的血型***，因为从输血的观点来看，它是最多态性和最免疫原性的。常见的Rh表型包含由RHD基因编码的主要抗原RH1(D)和由RHCE基因编码的RH2(C)、RH3(E)、RH4(c)和RH5(e)抗原。根据等位形式，区分8种典型的单倍型。

Rh***在输血医学中起着重要作用。事实上，在血型不相容的情况下，其抗原可以是接受体或孕妇中同种抗体形成的起源，从而导致新生儿的溶血性事故和/或溶血性疾病(HDN)。在RhD阴性孕妇中，抗D同种免疫(alloimmunization)对应于响应胎儿RhD阳性红细胞经胎盘通过进入母体循环的抗D IgG抗体的合成。继而，横穿胎盘进入胎儿循环中的母体抗D引起RhD阳性胎儿的溶血和贫血。

目前，尽管抗D抗体的最终形成在大多数不相容的情况下通常可以通过RHD阴性孕妇的高效筛查测试和有效预防得以避免，但是仍然有同种免疫的情况。具体而言，具有D-阳性表型的某些受试者可以形成针对一种或多种缺少的表位的抗D同种抗体，定义“部分D”表型，其可以通过存在或不存在一个或多个位于RHD蛋白的胞外环内的D表位区分(Cartron等，1996)。因此，D抗原是一种复合抗原，因为它由表位拼接组成，其中至少有9个(epD1到epD9)已经通过一系列单克隆抗体定义(Tippett等1996)。

目前，鉴定针对Rh抗原的血浆抗体需要使用由表达不同Rh表型的测试红细胞制成的组。尽管这些表型中的大多数是常见的，但是某些对应于罕见的血型，其可用性可以是一个重要问题，在某些情况下使得难以鉴别针对这些抗原的抗体。另外，组的使用涉及样品中传染源的风险。

正是在患者血清中存在的抗Rh同种抗体的血液安全性鉴定的背景中，我们提出开发用于其快速且有效表征的新工具，其不依赖于罕见血液的可用性。因此，RhD蛋白以及更一般地Rh蛋白的产生作为克服检测针对低流行性抗原以及甚至更常见抗原的同种抗体的这些问题的备选出现。

自从发现编码Rh蛋白的基因以来，已经鉴定出Rh表型的分子基础(Mouro-Chanteloup等，1993)，并且在不同的异源***中进行了重组Rh蛋白的表达。此外，还描述了体外合成膜蛋白的技术，例如使用纳米盘(nanodiscs)(WO2007/038755；WO2005/081743；WO2015/095854)来溶解和稳定膜蛋白。为了使体外表达的蛋白质能够以功能性构象合成，纳米盘的脂质组成是必不可少的。某些纳米盘，特别是商业纳米盘不允许保留所有待获得的膜蛋白的结构和/或活性的构象(Bernhard Frank等(2015)。与Rh非红细胞蛋白(RHCG)合成相反，难以获得保留由抗体识别的表位的构象的RHCE和RHD蛋白的显著膜表达，所述Rh非红细胞蛋白的表达水平在提取质膜后允许蛋白脂质体中的功能性重构(Mouro，Chanteloupet等，2010)。由于它们复杂的寡聚构造，这些蛋白质仅可以在相关的RHAG蛋白(Rh相关糖蛋白)的存在下表达(Cartron等1999，Mouro-Chanteloup等，2002)(Goossens等，Plos one，2013)。然而，后者仅可以以10,000个拷贝/细胞(其在红细胞上表达的10％)在异源***中表达。这些表达水平与重组Rh蛋白作为检测患者血清中的抗体，特别是用于低滴度或低亲和力的抗体的工具的用途不相容。

因此，仍需要允许以天然构型并且以足以实现诊断用途的水平表达红细胞蛋白的***。

描述

本发明涉及一种红细胞蛋白质生产***，该***使大量的这些蛋白质能够以其天然状态获得。

尽管迄今为止，无论使用的***如何都不可能生产红细胞蛋白如RhD、RHCE、RhAG和UTB，但是本发明人已经显示了当在去污剂、脂质体或纳米盘的存在下，优选在具有POPC类型的脂质组成的纳米盘的存在下体外生产时，可以获得大量的这些红细胞蛋白，所述红细胞蛋白质处于允许它们保留由抗体识别的表位的构象。

由发明人优化的用于红细胞蛋白质如RhD、RHCE、RhAG或UTB的无细胞生产的方法已经允许以比现有技术方法可能获得的量更大的量获得包含所述蛋白质的新组合物。以特别令人惊讶的方式，所述用于红细胞蛋白质如RhD的无细胞生产的方法允许使用相关蛋白RHAG(Rh相关糖蛋白)来生产所述蛋白RhD以免于现有技术的教导(Mouro-Chanteloup等,Blood 2002,Goossens等,Plos one,2013)，与现有技术的教导形成对比。

因此，本发明涉及用于生产红细胞蛋白质如RhD、RHCE、RhAG或UTB的无细胞***，其特征在于存在去污剂或脂质体或纳米盘。

“红细胞蛋白质”在本文中指在红细胞系的细胞中表达的蛋白质。“红细胞系”在本文中指其分化直接或间接导致红细胞的所有细胞类型(包括红细胞)。就本发明而言，红细胞系尤其包括原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞和红细胞。就本发明而言，优选地，红细胞蛋白质是主要在红细胞系中表达的蛋白质。

本发明的红细胞蛋白质特别是膜蛋白。所述蛋白质可以是整合膜蛋白或与膜结合的蛋白质。优选地，本发明的红细胞蛋白质是整合膜蛋白；更优选地，它是一种多起源蛋白质(polytopic protein)；甚至更优选地，所述多起源蛋白质携带血型抗原。

在与本发明特别相关的红细胞蛋白质中，可以提及RhD、RHCE、RhAG和UTB蛋白及其变体。事实上，目前不可能大量生产天然形式的这些蛋白质。在细胞***中产生红细胞Rh蛋白是可能的，但是以极低的产率，其完全不足以用于诊断用途。此外，细胞生产需要与RhAG的共表达以正确靶向某些蛋白质(例如RhD和RHCE)。然而，由本发明人开发的用于生产带有血型抗原，即特别是RhAG、RhD、RHCE和UTB的红细胞膜的整合多起源蛋白质的方法允许以比现有技术方法可能获得的量更大的量获得包含所述蛋白质的新组合物。

“RhD蛋白”指417个氨基酸的非糖基化膜蛋白，其具有12个跨膜域和胞质内N和C端末端。D抗原是均沿着RhD蛋白的依赖于构象的表位集合。有许多识别RhD蛋白的这些构象性表位的单克隆抗体。这些抗体特别允许验证所述RhD蛋白的正确折叠或表征其变体(Advent和Reid，2000)。优选地，RhD蛋白质是具有SEQ ID NO.5(NP_001121163)所示序列的蛋白质。甚至更优选地，RhD蛋白质由RHD基因编码，所述RHD基因的序列由SEQ ID NO.1(NM_001127691)表示。

“RHCE蛋白”指417个氨基酸的未糖基化膜蛋白，其具有12个跨膜域和胞质内N和C端末端。优选地，RHCE蛋白质是具有以SEQ ID NO.6(NP_065231)所示序列的蛋白质。甚至更优选地，RHCE蛋白由RHCE基因编码，所述RHCE基因的序列由SEQ ID NO.2(NM_020485)表示。RHCE基因与RHD基因具有很高的同源性：这两个基因具有约96％的同一性。

如在本发明的含义内所理解，“RhAG蛋白”是具有12个跨膜域的409个氨基酸的糖基化膜蛋白。此蛋白质具有铵转运蛋白活性。优选地，RhAG蛋白质是具有SEQ ID NO.7(NP_000315)所示序列的蛋白质。甚至更优选地，RhAG蛋白由RHAG基因编码，所述RHAG基因的序列由SEQ ID NO.3(NM_000324)表示。

“UTB蛋白”在本文中指具有10个跨膜域和胞质内N和C端末端的尿素转运蛋白。UTB蛋白携带Kidd抗原。优选地，UTB蛋白质是具有SEQ ID NO.8(NP_001 122060)所示序列的蛋白质。甚至更优选地，UTB蛋白由SLC14A1基因编码，所述SLC14A1基因的序列由SEQ ID NO.3(NM_001 12858 8)表示。

对于这些基因座中的每个，许多表型变体是已知的，并且特别对于RHD基因座是已知(参见例如Advent and Reid,The Rh blood group System:areview Blood 95(2):375-387,2000；The Blood Group Antigen FactsBook,第3版,Marion E.Reid编,ChristineLomas-Francis,Martin L.Olsson,Academic Press,2012,ISBN:978-0-12-415849-8)。

如本文所用，基因或给定蛋白质的“变体”指下述多核苷酸或多肽，其序列分别与所述基因或所述蛋白质的序列具有至少95％、优选97％、更优选98％、甚至更优选99％的同源性。这些变体可以通过至少四种机制发生：(1)染色体重排；(2)导致一个或多个氨基酸改变的点突变；(3)无义突变和(4)导致终止密码子出现的核苷酸缺失。

影响本发明的红细胞蛋白基因的染色体重排是公知的。例如，高度同源(超过96％同一性)的RHCE和RHD基因串联排列，这有助于这些基因之间的基因重排和“杂合基因”的出现。

此外，RHD和RHCE基因显示高度多态性。类似地，RHAG和SLC14A1基因的每一个存在多种变体。已经描述了这些基因中的许多突变(参见例如：The Blood Group AntigenFactsBook,3rd Edition,Ed.Marion E.Reid,Christine Lomas-Francis,MartinL.Olsson,Academic Press,2012,ISBN:978-0-12-415849-8)。还可以参考“血型抗原基因突变数据库”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/rbc/xslcgi.fcgi？cmd＝bgmut/systems_info&system＝rh)，其编译在这些基因之每种中找到的不同突变。

本发明的方法不仅可以允许生产RhD、RHCE和UTB蛋白质之每种，而且可以允许生产这些蛋白质之每种的所有变体。

在某些实施方案中，编码感兴趣的红细胞蛋白质的核苷酸序列的密码子选择经优化而用于源自除人之外的不同生物体(例如，细菌如大肠杆菌(E.coli))的无细胞***中。本文，术语“密码子优化”指编码感兴趣多肽的核苷酸序列经修饰以优化用于在特定生物体中表达而不改变所述多肽的氨基酸序列的过程。“密码子”是在细胞中翻译成特定氨基酸的三个核苷酸的序列。公知的是，存在64种可能的三核苷酸的序列的组合，而只有20种天然氨基酸。因此，大多数氨基酸由几种密码子编码。给定物种中的某些密码子通常比编码相同氨基酸的其它密码子更好地翻译。另外，密码子选择的偏好因物种而异。因此，观察到来自一种物种的基因的表达在将此基因引入另一物种时可以不是最佳的。技术人员将容易理解，通过利用遗传密码的简并性可以克服此问题。因此，修饰编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得所述序列现在含有在感兴趣物种中有效使用的密码子但不改变编码多肽的序列。可能确定哪些密码子在感兴趣的生物体中最广泛使用。对于许多生物体，包括最常用的无细胞***来源的生物体(大肠杆菌、兔、小麦)，这已经完成。技术人员因此将能够完全确定每种感兴趣生物体的密码子选择。

根据具体的实施方案，本发明的无细胞蛋白质与标签序列融合以促进随后的回收或甚至纯化。此类序列是技术人员公知的。它们包括HA、FLAG、V5和myc表位、以及壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和Strep标签。也可以使用6个组氨酸的序列。可以将这些序列添加到感兴趣的蛋白质的N端或C端。

因此，本发明涉及合成选自RhD、RHCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在至少一种非离子型去污剂、脂质体或纳米盘的存在下将编码所述蛋白质或其变体的核酸与无细胞蛋白质生产***接触；以及

b)所述蛋白质的合成。

根据优选的实施方案，本发明涉及合成选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在至少一种非离子型去污剂、脂质体或纳米盘的存在下将编码所述蛋白质或与其具有至少95％同一性的同源物的核酸与无细胞蛋白质生产***接触；以及

b)所述蛋白质的合成。

就本发明而言，“无细胞***蛋白质生产”指在不存在细胞的情况下合成蛋白质的生物化学***。就本发明而言，用于蛋白质生产的无细胞***因此包含在不存在细胞的情况下生产蛋白质的所有必需元件。具体而言，此***特别包含来自细胞的转录和翻译机器(machinery)。

这些体外***是特别有利的，因为它们允许合成细胞毒性膜蛋白或调控或不稳定的蛋白质，所述蛋白质不能在活生物体中表达从而在体内***中常规表达。具体而言，无细胞***特别适用于表达膜蛋白，如本发明的红细胞蛋白。事实上，膜蛋白非常难以在细胞中表达、在细胞膜上的表达，其需要胞内运输和适当的靶向。大多数适用于可溶性蛋白质的技术不能处理不溶性聚集体，特别是在提取和纯化阶段期间。相反，无细胞***相对于常规蛋白质合成***的优点在于它们提供相当简单地改变蛋白质的反应环境的能力，例如通过添加促进正确折叠的试剂。事实上，每个反应参数(如pH、氧化还原电位、离子强度等)可以根据要生产的靶蛋白质而改变。另外，在这些***中，所得到的重组蛋白代表反应的主要产物。

无细胞蛋白质合成的模板可以是任何类型的多核苷酸、RNA或DNA。优选地，使用的基质是DNA分子。在此情况下，无细胞***可以通过偶联转录和翻译反应将包含在DNA模板中的信息转换成蛋白质。

特别用于大肠杆菌***的偶联***从包含可识别启动子的DNA模板连续产生mRNA。在此***中，可以使用内源性RNA聚合酶，但优选将外源性RNA聚合酶(通常是T7噬菌体或噬菌体SP6的RNA聚合酶)添加到反应混合物。***可以与任何感兴趣的基因一起使用。特别地，本发明的DNA模板包含用于表达感兴趣的红细胞蛋白质的表达盒。

“表达盒”在本文中指DNA片段，其包含与一种或多种控制基因序列表达的调节元件，例如启动子序列和“增强子”序列可操作连接的感兴趣多核苷酸，例如编码本发明的红细胞蛋白的多核苷酸。

在下述情况时多核苷酸与调节元件“可操作连接”，即这些不同的核酸序列与单一核酸片段联合，从而一种核酸序列的功能受其它核酸序列影响。例如，在下述情况下调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“可操作连接”，即两个序列定位为使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(换言之，编码DNA序列处于启动子的转录控制下)。编码序列可以以有义方向和反义方向两者与调节序列可操作连接。优选地，本发明的编码序列以有义方向与调节序列可操作连接。

“调节序列”或“调节元件”在本文中指对于影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类调节序列特别包括转录终止序列、启动子序列和“增强子”序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定化的序列；改善翻译效率的序列(例如Kozak序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及必要时增强蛋白质分泌的序列。

优选地，本发明的调节序列包括启动子序列，即，编码本发明的红细胞蛋白的基因优选与允许表达相应mRNA的启动子可操作连接。编码蛋白质红细胞的基因优选当它位于后者的下游时与启动子可操作连接，从而形成表达盒。

如本文所用，“启动子”指最常位于编码序列上游(5’)的核苷酸序列，其由RNA聚合酶和对于转录所需要的其它因子识别，并且因此控制所述编码序列的表达。如本文所用，“启动子”特别包括最小启动子，即由TATA盒和其它序列构成的短DNA序列，所述其它序列使得可能规定转录位点起始。就本发明而言，“启动子”还包括包含最小启动子和能够控制编码序列表达的调节元件的核苷酸序列。例如，本发明的启动子序列可以含有调节序列，诸如可以影响基因表达水平的“增强子”序列。

有利地，根据本发明的启动子是与用于感兴趣的无细胞体系的RNA聚合酶一起操作的启动子。例如，由SP6和T7噬菌体RNA聚合酶识别的启动子对于本领域技术人员而言是公知的。因此，在下文的实验部分中使用携带由T7RNA聚合酶识别的启动子的pIVEX载体(Rogé和Betton，2005)。含有此类启动子的载体也是商品化的。

根据本发明，在蛋白质合成期间，或者优选甚至在蛋白质合成开始之前，将去污剂、脂质体或纳米盘添加到反应介质。优选地，将每ml多达几毫克此脂质添加到反应介质，通常在0.5和10mg/ml之间。

如本文所用，“去污剂”意指含有疏水基团和亲水基团两者的两亲性分子。这些分子含有极性亲水基团和长疏水性碳链。术语“非离子型去污剂”指含有其中亲水部分不带电荷的去污剂的分子。根据本发明的非离子去污剂尤其包括烷基多聚葡萄糖苷(alkylpolyglucosides)、八乙二醇单十二烷基醚(octaethylene glycol monododecyl ether,C12E8)、Brij家族的去污剂，例如Brij35(C12E23聚氧乙二醇十二烷基醚(Polyoxyethyleneglycol dodecyl ether))或Brij 58(C16E20聚氧乙二醇十二烷基醚)、Genapol、glucanids如MEGA-8、-9、-10、辛基葡糖苷、Pluronic F127、Triton家族去污剂如Triton X-100(C14H220(C2H40)n)或Triton X-114(C24H4206)、Tween家族去污剂，特别是Tween 20(聚山梨酯20)和Tween 80(聚山梨酯80)。优选地，本发明的非离子型去污剂选自Brij 35和Brij 58。更优选地，本发明的非离子型去污剂是Brij35。

根据此优选实施方案，本发明因此涉及如上所述的方法，其中根据步骤a)的接触在至少一种选自Brij 35和Brij 58的非离子型存在去污剂的情况下发生。

根据本发明的方法产生红细胞蛋白质的最有效的去污剂浓度因去污剂而异。它们随去污剂的低临界胶束浓度，即形成胶束的浓度而变化。尽管如此，这些浓度通常为0.1-5％，更特别为0.1-1％。例如，Brij 35和Brij 58通常以0.5％使用。根据给定的去污剂是固体还是液体，％分别指的是w/v％或v/v％比率。

如本文所用，“脂质体”意指由同心脂质双层形成的人工囊泡，所述同心脂质双层之间捕获水性区室。脂质体可以由任何合适的脂质制成，包括但不限于极性脂质如磷脂，如磷酸甘油酯，如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，心磷脂或其组合。也可以将其它脂质化合物掺入到脂质体中，如三酰甘油、蜡、鞘脂和固醇及其脂肪酸酯或其组合。

脂质囊泡对应于直径约100nm的球体形式的脂质双层，其使用本领域技术人员已知的方案制备。

这些脂质囊泡可以在引入反应介质之前用去污剂处理。根据第一个实施方案，所使用的脂质囊泡是天然来源的，优选来自大豆或蛋。此类脂质可购自Avanti PolarLipids，其在法国由Coger转售。或者，脂质囊泡可以是合成起源的脂质体，即由合成脂质产生。

根据优选的实施方案并且特别是在合成脂质的情况下，用于本发明上下文中的脂质体是聚乙二醇(PEG)分子或PEG衍生物(官能化PEG)，如N-羰基-甲氧基聚乙二醇2000的载体。

如本文所用，术语“纳米盘”指至少一个由蛋白质框架稳定化的脂质双层。优选地，所述框架围绕脂质双层以形成盘状结构。

如本文所用，“脂质”指任何天然的脂溶性分子(即亲脂性)。脂质是具有许多基本生物学功能的异质性的一组化合物。这些化合物作为细胞膜的结构成分、以及能量贮存源或作为信号传导中的中间体分子发挥功能。可以将脂质定义为完全或部分起源自酮酰基或异戊二烯基的小疏水性或两亲性分子。对于所有脂质类别的概述，可以有利地参考“脂质代谢物和途径策略(脂质体图谱)***分类("Lipid Metabolites and Pathways Strategy(LIPID MAPS)System classification)”(国立通用医学科学研究所(National Instituteof General Medical Sciences)，Bethesda，MD)。脂质可以形成胶束、单层膜和双层膜，若必要的话，脂质可以与其它组分一起自组装以形成纳米盘，就本发明而言，脂质包括脂肪、蜡、磷脂、鞘脂(如鞘磷脂)、固醇(如胆固醇)、脑苷脂和源自这些脂质基团之每种的化合物。就本发明而言，纳米盘中的脂质优选为磷脂。就本发明而言，“磷脂”是含有作为单酯或二酯的磷酸基团的脂质。可用于本发明纳米盘的磷脂包含合成的、天然的、饱和的、不饱和的磷脂、它们的衍生物(例如酰基、二醚和溶血性(lyso))以及不同类别或相同类别的磷脂的任何组合，其可以促进表达的蛋白的良好***和构象以及出于同样的原因促进其被配体或抗体的识别。磷脂尤其包括磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸、心磷脂及其衍生物。在优选的实施方案中，磷脂包含二油酰基、二肉豆蔻酰基、棕榈酰油酰基-甘油基-磷酸胆碱(DOPC、DMPC、POPC)、棕榈酰基-油酰基、二肉豆蔻酰基和二油酰基磷酸甘油酯(POPG、DMPG和DOPG)。在甚至更优选的实施方案中，磷脂包含二油酰基、二肉豆蔻酰基、棕榈酰基-油酰基-甘油磷酸胆碱(DOPC、DMPC、POPC)。根据特别有利的实施方案，本发明的磷脂与胆酸钠组合。根据此实施方案，例如通过透析除去此盐能够使纳米盘从磷脂和本发明的蛋白质框架获得。

如本文所用，术语“蛋白质框架”包括能够在含水环境中与两亲性脂质组装并且将所述两亲性脂质构造成双层的任何蛋白质。优选地，本发明的蛋白质框架必须是两亲性的，其结构的一部分或多或少具有亲水性并且面向含水溶剂，而另一部分或多或少具有疏水性并面向疏水双层的中心从而稳定化。因此，术语“蛋白质框架”包括但不限于载脂蛋白、lipophorines、其衍生物(诸如例如截短和串联排列的序列)及其片段(即肽的片段)，如载脂蛋白E4、22K片段、liphorine III、载脂蛋白A1和类似分子。蛋白质框架也可以由专门为此目的设计的人工两亲性肽构成。在一些具体的实施方案中，这些肽是两亲性螺旋肽，其模拟与两亲性脂质的脂肪酸链垂直定向的载脂蛋白α螺旋，特别是磷脂的那些。在母案申请WO2008/141230A1中描述了此类肽。

优选地，本发明的纳米盘的蛋白质框架由MSP1蛋白或其衍生物构成。MSP1是A1载脂蛋白的截短形式，其具有与完整蛋白质相同的两亲性螺旋结构。MSP1蛋白具有序列：GLKLLSNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO.9)。

已经构建了此蛋白质的衍生物(参见例如Grinkova等,2010,WO 02/40501,WO2005/081743,US 7,083,958B2)。这些衍生物中的一些包含允许蛋白质和掺入它们的纳米盘的容易纯化的序列。因此，可以将标签序列添加到蛋白质。此类序列对于本领域技术人员而言是公知的。它们包含HA、FLAG、V5或myc表位、以及壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和Strep标签或6个组氨酸的序列。例如，可以将6个组氨酸的序列与MSP1蛋白的N末端融合。MSP1的某些衍生物含有由TEV蛋白酶识别的位点，该TEV蛋白酶位点已经被修饰以引起完全和特异性切割。MSP1衍生物还可以在MSP1的N端包含额外的截短Δ(1-11)。此截断给出更稳定的盘，第一螺旋的全部不是与脂质相互作用所需要的。因此，M1PD1蛋白(SEQ ID NO.10)包含与N端的His6序列和TEV位点融合的截短Δ(1-11)。MSP1D1蛋白产生直径约9.7nm的纳米盘，其通常含有120至160个脂质分子和2个MSP每纳米盘。本领域技术人员通常使用的另一种衍生物是蛋白质MSP1E3D1(SEQ ID NO.11)，其包含MSP1D1蛋白质的螺旋3和4之间的三个另外的螺旋(4、5和6)的***。因此，此蛋白质包含MSP1D1蛋白质的螺旋4、5和6的重复。因此，它产生具有比用MSP1D1蛋白获得的尺寸更大的尺寸：约12.9nm的纳米盘。这两种衍生物MSP1D1和MSP1E3D1最常用于生成纳米盘。它们也都是商品化的(来自Sigma-Aldrich或Cube Biotech等)。非常优选地，本发明的MSP蛋白是具有选自SEQ ID NO.9、10或11的序列的蛋白质。

根据此优选实施方案，本发明涉及如上所述的方法，其中根据步骤a)的接触在纳米盘的存在下进行，所述纳米盘包含选自SEQ ID NO.9、10或11的蛋白质的MSP蛋白。

因此，本发明涉及如上所述的方法，其中根据步骤a)的接触在选自Brij 35或Brij58的至少一种非离子型去污剂或包含选自SEQ ID NO.9、10或11的蛋白质的MSP蛋白的纳米盘的存在下进行。

发明人已经显示了使用纳米盘使本发明的红细胞蛋白质能够以可溶形式且大量获得。特别地，他们已经显示了使用足够的纳米盘浓度来优化生产是非常重要的。在此方面，小于80μM的纳米盘浓度特别适合于获得大量处于可溶状态的蛋白质。例如，20μM、40μM或60μM的纳米盘浓度使得能够获得至少与存在去污剂的情况下获得的产率一样好的产率。

用脂质(优选磷脂)和可以形成框架的蛋白质产生纳米盘的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Denisov等，2004)。因此，它们不会在本文详述，但是注意，此外，许多公司提供纳米盘(例如Cube Biotech、Sigma Aldrich、Nanodiscs Inc.)。

作为基本原理，无细胞***具有使用生物体的转录和翻译机器从外源遗传信息产生特定重组蛋白。提取机器的生物体是多种多样的，并且源自原核生物和真核生物。

此类***几十年来一直为本领域技术人员所公知(关于综述，参见例如：Carlson等，2012)。许多方法可用于在无细胞***中合成蛋白质(参见例如Cell-free ProteinSynthesis:Methods and protocols,Alexander S.Spirin和James R.编Swartz2008.Wiley-VCH,Weinheim,Germany)。也可以使用各家公司提供的试剂盒：Qiagen、Ambion、Promega、Invitrogen、Thermo Scientific、Roche Diagnostics、CellFreeScience&Co等。

优选地，用于产生本发明蛋白质的无细胞***包含细胞提取物。尽管可以使用任何生物体作为细胞提取物的来源，但优选使用大肠杆菌、兔网织红细胞、小麦胚芽或昆虫细胞的提取物。大肠杆菌提取物是特别有利的。首先，本领域技术人员已经对该***具有丰富的经验，该***迄今为止最受欢迎。这些提取物可以容易且以低成本制备。与其它***相比，它们可以以更低的能量成本提供非常高的产率。由于许多公司目前在销售使用大肠杆菌提取物的蛋白质无细胞表达试剂盒：Qiagen、Promega、Invitrogen、Thermo Scientific、Roche Diagnostics等，此***是容易商品化的。

有两种进行无细胞反应的方式。在不连续反应中，也称为分批反应，在含有所有必需组分的反应体积中进行转录和翻译。由于各种原因，诸如能量供应的快速消耗，诸如核苷酸等组分的降解以及Mg²⁺游离离子浓度的降低，分批***中的反应通常在约1-2小时后达到平稳状态。使用优化的体外分批表达***通常产生高达500μg蛋白质/ml，尽管有时可以以额外优化为代价实现更高的量。

在透析模式中，在小反应室中进行无细胞转录/翻译反应，所述小反应室通过透析膜(通常10至15kDa截留)与含有低分子量试剂的大10至20倍左右的储库分开。

在透析模式的***的第一种中，即连续流动无细胞生产***或连续流动无细胞(Continuous Flow Cell Free，CFCF)中，反应介质被超滤膜隔离，并通过泵连续供应。此膜允许感兴趣的蛋白质通过进入缓冲液区室中并在连续补料反应的情况下回收，并且因此将实验进行几十小时。

在具有连续交换的无细胞生产***(连续交换无细胞(Continuous ExchangeCell Free)或CECF)中，含有细胞裂解物和遗传信息的反应室通过透析膜与含有辅因子、氨基酸、缓冲液和其它组分的营养物区室分开。透析膜允许废物分子流出，但允许组分的进入，所述组分由于源自合成活性的浓度梯度而使反应能够进行。此配置可以显著增加反应时间和生产的蛋白质水平。在商业(RTS,Roche Applied Science)和自制***两者的情况下，对用此方法的大肠杆菌***报告了反应体积中多达5mg/ml的产率。

本发明的无细胞***是分批或透析模式的***。优选地，此***是透析模式***。更优选地，此***是具有连续交换的无细胞生产***。

无细胞***的优点是它提供了精确控制反应参数的能力。除提取物外，用于蛋白质生产的无细胞***还包括许多元件，其浓度可能对反应效率是至关重要的。

二价Mg²⁺离子在许多生物反应中是必需的。在本文，发明人已经显示了，包含在14和22mM之间，优选在16和20mM之间的镁浓度使得可以获得红细胞蛋白质的相当大的产率。因此，根据本发明的无细胞蛋白质生产***包含14至22mM，优选16至20mM的镁浓度。

也可以添加其它盐，特别是生物相关的盐，如锰。钾通常以至少约50mM且不超过约250mM的浓度存在。铵可以通常以小于200mM的浓度，一般以小于约100mM的浓度存在。通常，将反应维持于约5至10的pH范围以及约20℃-50℃的温度；更一般于约6-9的pH范围中以及约25-40℃的温度。有利地，在pH＝7.5进行反应。此外，20℃的温度对于此反应是特别有利的。对于特定的感兴趣的条件，可以扩展这些范围。

相反，不需要添加外源辅因子来激活氧化磷酸化。化合物如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD⁺或乙酰辅酶A可用于补充蛋白质合成产率，但不是要求的。添加草酸(磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)的代谢抑制剂)可以有利于提高蛋白质产率，但并非必要。

本发明的红细胞蛋白是膜蛋白。因此，无细胞***中生产的膜蛋白正确折叠并且有功能是重要的。特别地，避免聚集体的形成是重要的。在此方面，本发明人已经显示了反应时间包含在2至24小时之间，优选在6至12小时之间，更优选约8小时，使得有可能在避免聚集体的情况下使产率最大化。

根据具体的实施方案，本发明的方法包括回收生产的蛋白质的步骤。此步骤可以通过使用标签序列来促进。根据具体的实施方案，将此序列与感兴趣的红细胞蛋白融合。应当注意的是，当在纳米盘的存在下生产本发明的红细胞蛋白质时，可以有利的是将包含纳米盘的蛋白质与标签序列融合并使用它回收本发明的蛋白质。

可以通过本领域技术人员已知的任何手段来实现本发明的红细胞蛋白的分离(或纯化)。实例包括差异沉淀或超速离心。通过离子交换层析、亲和层析、分子分筛或等电聚焦纯化感兴趣的片段也可以是有利的。所有这些技术记载于Voet D and Voet JG,Techniques of Protein and Nucleic Acid Purification,第6章,Biochemistry,第2版。优选地，可以通过使用例如针对此蛋白质的抗体的免疫沉淀来回收感兴趣的蛋白质。或者，若必要的话，可以通过使用标签序列的亲和层析来分离感兴趣的蛋白质。

在某些应用中可能特别有用的是将感兴趣的红细胞蛋白质偶联到固体支持物上，例如以检测针对由受试者血清中的蛋白质携带的同种抗原的抗体。所述蛋白质的偶联可以是直接或间接的。当蛋白质在不以另一种蛋白质为中介的情况下与固体支持物相互作用时，蛋白质的偶联是直接的。例如，当通过针对感兴趣的蛋白质的抗体实现偶联时就是此类情况。当将感兴趣的蛋白自身与标签序列融合时，情况也是如此。本发明上下文中的间接偶联指由另一种蛋白介导的偶联，例如通过MSP或通过MSP蛋白与标签序列之间的融合。在此情况下，所述其它蛋白质与固体支持物偶联，并且感兴趣的蛋白质自身仅在其与所述其它蛋白质相互作用的程度上与固体支持物偶联。例如，当在其中的MSP蛋白与所述固体支持物结合的纳米盘中表达时，感兴趣的蛋白质间接偶联至固体支持物。该偶联模式在不干扰感兴趣蛋白质的三维构造方面可以是有利的。

根据此具体实施方案，本发明的方法包括将红细胞蛋白质或其变体和/或MSP蛋白固定到固体支持物上的附加步骤。有利地，将与红细胞蛋白质或其变体和/或MSP蛋白特异性相互作用的化合物接枝在所述固体支持物上。例如，所述化合物是针对感兴趣的红细胞蛋白质或针对MSP蛋白的抗体。优选地，此化合物由红细胞蛋白或其变体和/或MSP蛋白的标签序列识别。此化合物可以是识别特定表位，例如HA、FLAG、V5或myc的抗体。它也可以是由蛋白质(分别为CBP、MBP和GST)结合的糖(例如壳多糖或麦芽糖)或代谢物(如谷胱甘肽)。所述化合物还可以是任选地通过基因工程修饰的肽，其被特定的肽序列识别并结合：因此，Strep-Tactin肽通过遗传修饰从链霉抗生物素蛋白衍生并且被特定的序列Strep-标签结合。最后，此化合物可以是二价离子，如Ni²⁺，它由6个组氨酸的序列结合。将这些化合物偶联到固体支持物的方法是本领域技术人员公知的。因此，本文未详细覆盖它们。

可以用于本发明的固体载体不受任何限制，只要它是固体支持物或由不溶性材料(例如，可以通过过滤、沉淀、磁性分离或任何其它合适的技术从反应混合物中分离的材料)构成。

构成所述固体支持物的材料包括但不限于纤维素、Teflon^TM、硝酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚二亚乙烯基二氟化物、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、晶圆硅、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖、蛋白质(例如白蛋白)、碳及其组合。

固体支持物可以具有任何形状，包括但不限于珠、磁珠、薄膜、微管、滤器、板、微板、碳纳米管、传感器芯片等的形状。平固体支持物如膜或薄板还可以包括孔、管、滤器排水管(filter drain)等，如本领域中已知。实际上，固体支持物可以是由标签序列识别的化合物可以结合的任何表面。根据本发明的固体支持物尤其包括微量滴定板、珠、盘、芯片、载玻片和任何其它合适的支持物。

在本发明的一个实施方案中，固体支持物由具有约25nm至约1mm的球径的磁珠组成。在一个优选的实施方案中，磁珠具有约50nm至约10μm的直径。磁珠的大小可以根据预期的用途来选择。

根据本发明的另一个实施方案，固体支持物包含由高度交联的球形琼脂糖(例如sepharose)组成的珠。优选地，所述珠具有约24μm和约165μm之间的直径。在更优选的实施方案中，所述珠具有约24μm和约44μm之间的直径。这些高度交联的球形琼脂糖珠的大小可以根据预期用途来选择。

具有疏水表面的固体支持物尤其包含聚苯乙烯胶乳珠，如可购自Polysciences,Warrington,PA或Spherotech,Liberville,IL的那些。

经二氧化硅(SiO₂)处理或基于二氧化硅(SiO₂)的固体支持物的实例包含可购自Polysciences,Warrington,PA的超顺磁性二氧化硅珠。也可以使用可购自Dynal Biotech的M-280等。

具有亲水表面的磁珠可用于本发明的方法中。这些磁珠的实例包括在名称 carboxyl下可购自Polysciences,Warrington,PA或在MC02N珠名称/2928下可购自Bangs Laboratory,Inc.,Fishers,IN的珠。也可以使用可购自Dynal Biotech的M-270等。

根据另一方面，本发明涉及在纳米盘、脂质体或非离子型去污剂中表达的红细胞蛋白或与其具有至少95％同一性的同源物，其中所述蛋白质或变体可通过上述方法获得。

根据另一方面，本发明涉及选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体，其中所述蛋白质或变体能够通过上述方法获得，并且偶联至固体支持物。有利地，根据本发明的红细胞蛋白选自RhD、RhCE、RhAG和UTB或与其具有至少95％同一性的同源物，其中所述蛋白质或同源物能够通过根据本发明的方法获得，并且与固体支持物偶联。与从红细胞中提取蛋白质而不保留构象的现有技术相反，如此获得的红细胞蛋白是适当折叠的。实际上，发明人已经显示了通过本发明的方法生产的RhD蛋白由通常用于表征天然内源蛋白的构象抗体识别。有利地，通过本发明的方法获得的红细胞蛋白是功能性的。

根据另一方面，本发明涉及包含选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体的组合物。优选地，所述组合物中所述蛋白质的浓度大于0.01mg/ml，更优选大于0.1mg/ml，甚至更优选大于0.5mg/ml，还更优选大于1mg/ml。

在本发明的方法中使用脂质体或纳米盘产生脂质和蛋白质的颗粒、蛋白脂质体或纳米盘，其包括感兴趣的红细胞蛋白质和脂质两者。因此，另一方面，本发明涉及包含选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白或其变体和一种或多种脂质的组合物。优选地，所述组合物中所述蛋白质的浓度大于0.01mg/ml，更优选大于0.1mg/ml，甚至更优选大于0.5mg/ml，还更优选大于1mg/ml。

根据另一方面，本发明涉及组合物，其包含选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体，和选自SEQ ID NO.9、10或11的蛋白质的MSP蛋白。当在本发明的方法中使用纳米盘时特别获得此类组合物。优选地，本发明的组合物还包含脂质。优选地，此类组合物中包含的红细胞蛋白的浓度大于0.01mg/ml，更优选大于0.1mg/ml，甚至更优选大于0.5mg/ml，还更优选大于1mg/ml。

根据另一方面，本发明涉及选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体，其中所述蛋白质偶联于固体支持物。如上文解释，所述蛋白质的偶联可以是直接或间接的。

本发明的蛋白质特别重要，因为它们可以简单地用于检测抗红细胞同种抗体的测试。这些是针对存在于红细胞表面上的抗原并且可以诱导其溶血的抗体。针对外来红细胞抗原产生抗红细胞同种抗体。例如通过输血、怀孕期间或出生时发生免疫。若此类IgG抗体穿过胎盘屏障，则它们可以诱发儿童红细胞的加速破坏或胎儿红细胞生成的阻断。

根据本发明的此新方面，本发明涉及红细胞蛋白质或包含红细胞蛋白质的组合物在同种抗体检测测试中的用途。

值得注意地，受试者的生物样品中此类同种抗体的存在包括使所述样品与如上所述的红细胞蛋白质或包含红细胞蛋白质的组合物接触，随后在适当时检测红细胞蛋白质和针对它的抗体之间的相互作用。

如本文所用，“受试者”指哺乳动物，优选人，例如孕妇或输血患者。如本文所用，术语“生物样品”或“样品”指整个生物体或其组织、细胞或组分部分的子集。此外，“生物样品”指从整个生物体或其组织、细胞或组分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，或其级份或部分。优选地，根据本发明的“生物样品”是可以包含同种抗体的任何组织。如本文所用，“生物样品”意指例如体液样品如血液、骨髓液和淋巴液以及固体样品如***、血管、骨髓、脑、脾和皮肤。更优选地，本发明的生物样品是血液、血浆或骨髓的样品。

通过本领域技术人员已知的任何手段检测感兴趣的红细胞蛋白质与相应的同种抗体之间的相互作用。它们特别可以使用公知的技术，诸如免疫沉淀、免疫组织学、western印迹法、点印迹、ELISA或ELISPOT、蛋白质阵列、抗体微阵列或与免疫组织化学偶联的组织芯片。可以使用的其它技术包括FRET或BRET技术、显微术或组织化学的方法，包括基于使用一种或多种激发波长的共焦显微术和电子显微术方法和适合作为电化学方法的光学方法(伏安法(voltametry)和电流分析法(amperometry)技术)、原子力显微术和射频方法，诸如多极共振光谱学、共焦和非共焦、荧光检测、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折射率(例如通过表面等离子体共振、通过椭圆测量法、通过共振镜法(resonantmirror method)等)、流式细胞术、放射性同位素或磁共振成像、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE分析)；HPLC-质谱法、液相层析/质谱法/质谱法(LC-MS/MS)。所有这些技术对于本领域技术人员是公知的，并且在本文没有必要详细它们。

将使用下述实施例更为精确描述本发明。

附图简述

图1.通过Western印迹法检测RHD蛋白。通过离心将不同合成的总蛋白质分成可溶性级份和不溶性级份，通过LOR-15C9抗体和与HRP缀合的抗人二抗(1/1000)揭示RHD蛋白。分子量标志物(kDa)在左侧和右侧指示。

图2.在Brij 35 0.5％存在下生产的蛋白质的琼脂糖HA上的纯化。使用抗HA抗体(1/2000)的纯化步骤的Western印迹分析(A)以及通过用硝酸银染色分析洗脱液(B)。SM级分是RHD蛋白的体外合成产物，NR：未被树脂保留的级分，E：洗脱液LE：洗脱清洗和MW：分子量标志物(kDa)。

图3.通过Western印迹法检测RHD和MSP蛋白。分析纳米盘或Brij 35存在下的RHD蛋白质合成产物。(A)通过LOR-15C9抗体和与HRP缀合的抗人二抗(1/1000)揭示RHD蛋白质。(B)通过与HRP缀合的抗His抗体(1/10,000)揭示MSP蛋白。MW是分子量标志物(kDa)。

图4.通过Western印迹法检测RHD和MSP蛋白。在存在50μM纳米盘(N1，N2)的情况下或存在0.5％Brij35的情况下RHD蛋白生产的可溶性级份和不可溶级份的分析。(A)通过LOR-15C9抗体和与HRP缀合的抗人二抗(1/800)揭示RHD蛋白。(B)通过与HRP缀合的抗His抗体(1/10,000)揭示纳米盘的MSP蛋白。MW是分子量标志物(kDa)。

图5.通过Western印迹法检测RHD和MSP蛋白。分析在40μM纳米盘(IP抗RHD Cter)存在下生产的RHD蛋白的不同纯化步骤，并与20和60μM(IP抗HA)的存在下生产的纯化的RHD蛋白的洗脱级分比较。(A)通过LOR-15C9抗体和与HRP缀合的抗人二抗(1/800)揭示的RHD蛋白。(B)通过与HRP缀合的抗His抗体(1/10,000)揭示纳米盘的MSP蛋白。SM级分是RHD蛋白的体外合成产物，NR：未被树脂保留的级分，L1、L2、L3，各次清洗的级分，E 20/40/60：洗脱级分，MW，分子量标志物(kDa)。

图6.通过Western印迹法检测RHD和MSP蛋白。蔗糖梯度的级分1-11的分析。(A)通过LOR-15C9抗体和与HRP缀合的抗人二抗(1/800)揭示了RHD蛋白。(B)通过与HRP缀合的抗His抗体(1/10,000)揭示纳米盘的MSP蛋白。MW是分子量标志物(kDa)。P Ctrl在Brij 35存在下产生的RHD蛋白，N Ctrl：仅纳米盘。

图7.通过不同抗体识别RHD蛋白的演示：对与不同抗体温育的红细胞进行流式细胞术。(A)(B)通过抗ep D2和抗ep D5抗体识别用作阴性对照的Rh(-)红细胞的定量分析。(C)(D)通过抗ep D2和抗ep D5抗体识别Rh(+)红细胞的定量分析。(E)(F)选择研究的群体和亚群体。

实施例

材料和方法

I.材料

在-20℃贮存的RTS 100大肠杆菌HY试剂盒由5PRIME提供。在-80℃贮存的MSP1E3D1-His_POPC纳米盘(500μM)来自Cube Biotech。使用的ELISA板为Nunc MaxiSorp96孔型(Dutscher)的ELISA板，并且FACS板来自Corning。A sepharose 4B蛋白树脂来自GEHealthcare Life Sciences。琼脂糖HA树脂和20％并且贮存于-20℃的去污剂(C₁₂E₈,Brij35,Brij 58)购自Sigma-Aldrich。

MPC8兔多克隆抗体识别RHD蛋白C端的残基408-416(Apoilet等，1997)，而LOR-15C9抗体是识别RHD蛋白的残基320-331和350-354的单克隆抗体(Apoilet等，1997)。从P.A.R.I.S(Western印迹)和Jackson(ELISA)获得针对人IgG的与HRP(辣根过氧化物酶)缀合的二抗。与HRP缀合的鼠抗五His抗体与来自Qiagen的试剂盒(RGS-His HRP偶联物试剂盒)一起提供。山羊抗人IgG抗体与R-藻红蛋白(PE)(Beckman)缀合。

已经开发了用于无细胞***中RHD蛋白表达的pIVEX-HA定制载体。它是通过用HA标签替换载体plVEX2.3d(5PRIME)的His标签而产生的，所述HA标签允许获得在C端中与HA标签融合的蛋白质。

II.方法

II.1.无细胞蛋白质表达

体外蛋白质表达的原则是在含有对于蛋白质合成必需的元件的反应介质中引入含有编码感兴趣蛋白质的可读框的质粒DNA。所有转录和翻译机器由大肠杆菌S30细胞裂解物提供。

使用两种类型的***。使用第一种***来筛选不同的表达条件，其中所有组分在单一区室中混合(“分批”方法)。第二种***是CECF(连续交换无细胞)(Shirokovet等，2007)，其中蛋白质合成在区室中发生，所述区室通过半渗透膜与贮器分开，允许稀释废物产物并且提供底物。CECF***用于蛋白质的大规模生产，因为与“分批”***相比，长达24小时的连续蛋白质表达提供更好的产率。

II.1.“分批”***中的蛋白质表达

由5PRIME公司开发的实验方案使蛋白质能够在RTS 100大肠杆菌HY试剂盒中以50μl的体积小规模合成。在冰上解冻RTS 100试剂盒和MSP1E3D1-His_POPC纳米盘(500μM)或20％去污剂(C₁₂E₈,Brij 35,Brij 58)。在室温在Eppendorf管中制备在存在纳米盘的情况下RhD蛋白生产所必需的反应混合物(12μl大肠杆菌裂解物；能量混合物10μl；氨基酸12μl；甲硫氨酸1μl；重建缓冲液5μl)。然后将50μl混合物在Eppendorf热混合器中在30℃在以750rpm搅拌的情况下温育5小时。

表达后，将混合物在4℃以22,000g离心10分钟以分开可溶性级(上清液)与不溶性级份(团粒)。

II.1.B在CECF***中的蛋白质表达

CECF***用于在存在大体积(1-2mL)的去污剂或纳米盘的情况下进行蛋白质生产。使用附录中所示的比例进行反应。

II.2.纯化

II.2.用HA琼脂糖进行免疫沉淀

为了免疫沉淀在去污剂(条件1)或纳米盘(条件2)(表1)存在下生产的RHD-HA蛋白，将1ml体外生产的可溶性级份添加至250μl(1CV)用缓冲液A₁或A₂预清洗的抗HA琼脂糖珠。将管在4℃在旋转下温育过夜。然后，通过在4℃以2,000g离心10分钟回收非保留级分。随后，用缓冲液A₁或A₂(18CV)进行几次清洗，然后用缓冲液B₁或B₂(28CV)清洗。为了进行这些清洗，将管在4℃以5,200g离心5分钟，并且除去上清液。最后一次清洗后，将结合有蛋白质的珠再悬浮并在4℃在325μl C₁或C₂洗脱缓冲液中在旋转的情况下温育4小时。在4℃以18,000g离心15分钟后回收洗脱液。

II.2.B用蛋白质A sepharose 4B免疫沉淀

在Eppendorf管中在冰上，将30μl体外生产的可溶性级分在A₃缓冲液(表3)中稀释至1/5，然后在4℃在轮上与10μl纯化的MPC8抗体(1.5mg/ml)一起温育过夜。然后在轮上于4℃将所形成的复合物与预先用A₃缓冲液清洗的50μl蛋白质A sepharose 4B树脂一起温育1小时。

在4℃以15,000g在低减速的情况下离心5分钟后回收未保留的级份。然后通过离心清洗团粒3次，用1mL A₃缓冲液，然后用B₃缓冲液清洗2次，并最后用C₃缓冲液清洗。为了洗脱蛋白质，将树脂在100℃用50μl Laemmli 2X加热5分钟。在以15,000g离心5分钟后，回收洗脱液。

表1.用于纯化RHD蛋白质的缓冲液。

II.3.蔗糖梯度

将合成产物加载到不连续的蔗糖梯度(PBS中的5-10-15 20-30％)上，然后使用TH.Bayburt等，2007所述的条件在4℃以210,000g超速离心18小时。从顶部到底部收集0.5ml级分并通过Western印迹法分析。

II.4.电泳

将样品在加载缓冲液(5mM Tris-HCl，8.56％蔗糖，1％SDS，5％β-巯基乙醇)中变性并加载到10％变性聚丙烯酰胺凝胶或4-12％梯度Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。通过在迁移缓冲液(25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS或50mM MOPS，50mM Tris HCl，0.1％SDS，1mM EDTA)中在180V电泳根据分子量分离蛋白质。

II.5.用硝酸银染色

在固定缓冲液(50％甲醇，12％乙酸，0.05％甲醛)中在搅拌的情况下温育1小时，接着在50％乙醇中漂洗几次后，用1％硫代硫酸钠溶液将凝胶处理1分钟。在水中漂洗几次后，将凝胶在染色混合物(0.2％AgNO₃，0.075％甲醛)中温育20分钟。在水中漂洗两次后，显影液(0.05％甲醛，0.04％硫代硫酸盐，6％Na₂CO₃)揭示凝胶上的蛋白质。通过10％乙酸溶液将反应淬灭30分钟。

II.6.蛋白印迹

一旦迁移完成，在转移缓冲液(12.5mM Tris-HCl，96mM甘氨酸，20％乙醇)中以30V将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Amersham)上2小时。

II.6.A揭示RHD蛋白

转移后，单独用PBS将膜清洗一次，然后在搅拌下在室温在含有稀释的5％乳的PBS溶液中饱和1小时。然后在4℃在旋转板上将膜与LOR-15C9一抗温育过夜。

在0.1％PBS-Tween20中清洗几次后，在搅拌的情况下在PBS 5％乳中稀释至1/800的与HRP缀合的鼠抗人IgG二抗存在下将膜温育1小时。在0.1％PBS-Tween20中清洗几次，然后单独用PBS清洗后，通过化学发光(GE Healthcare Life Sciences)揭示酶促反应。

II.6.B揭示纳米盘的MSP蛋白

通过用与HRP缀合的抗His抗体(Qiagen)的蛋白质印迹法揭示携带聚组氨酸标签的纳米盘的MSP蛋白。

转移后，用仅TBS将膜漂洗两次，然后根据给试剂盒提供的方案在新鲜制备的封闭溶液中在室温封闭1小时。在室温在TBS-0.05％Tween20中清洗2次并在单独的TBS中进行最后清洗后，在室温将膜与封闭溶液中稀释至1/10,000的抗五His-HRP抗体温育1小时。在TBS-0.05％Tween 20和单独的TBS中清洗几次后，通过化学发光揭示酶促反应。

II.7.流式细胞术

通过对红细胞间接加标签来揭示各种抗epD人单克隆抗体对RHD蛋白的识别。

为此，将0.5μl红细胞(5x10⁶个细胞)团粒悬浮于1ml 0.2％BSA-PBS中，然后以5x10⁵个细胞/孔的量在板的不同孔中分配。将板在4℃以100g离心3分钟，并且除去上清液。

第一次清洗后，在4℃将红细胞与针对RHD蛋白的抗体一起温育1小时。然后，将细胞在PBS中的0.2％BSA中清洗两次，并在4℃在黑暗中与在0.2％BSA-PBS中稀释至1/100的与R-藻红蛋白(PE)缀合的人抗-IgG抗体温育1小时。在0.2％BSA-PBS中清洗3次后，将细胞重悬于200μl PBS中并通过流式细胞术(BD FCS Canto II，BD Biosciences)分析。

通过FlowJo软件分析结果。

II.8.ELISA测试

为了揭示各种抗体与感兴趣蛋白之间的相互作用，进行ELISA夹心测试。

将MPC8捕捉抗体以每孔1ng/μl在PBS中在孔中温育。在室温完成捕捉过夜。在PBS中清洗几次后，然后用5％乳-PBS饱和孔，然后用PBS漂洗。

然后，在37℃下在孔中添加在存在纳米盘的情况下在体外生产的RHD蛋白达45分钟。在PBS中漂洗后，在37℃将待测试的抗RHD人抗体与此复合物一起温育45分钟，通过连续清洗消除过量。

使用抗人IgG抗体(PBS中1/50,000)检测形成的复合物，所述抗人IgG抗体针对小鼠和兔IgG消减并且与HRP缀合。在37℃将整体温育30分钟。清洗后，通过在孔中添加TMB(Bio-Rad)揭示与酶结合的复合物。用0.1NH₂SO₄溶液淬灭反应，并在450nm波长处测量吸光度。

结果

I.在存在去污剂的情况下RHD蛋白的表达和溶解度测试

我们研究了不同去污剂与翻译***中RHD蛋白质的体外产生的相容性。

使用三种非离子型去污剂C₁₂E₈、Brij 35、Brij 58。这些去污剂的选择是基于它们在膜蛋白上的非变性性质而进行的。使用的浓度基于它们的低临界胶束浓度(形成胶束的CMC浓度)(对于Brij 35为0.11％，对于Brij 58为0.0086％，且对于C₁₂E₈为0.006％)选择。通过Western印迹法分析在3种去污剂(0.5％C₁₂E₈,0.5％Brij 35,0.5％Brij 58)存在下RHD蛋白的“分批”生产(图1)已经显示了仅在用于含有Brij 35或Brij 58的反应的可溶性部分中存在蛋白质。对于含有C₁₂E₈的反应，在不溶性级份中仅检测到低强度信号，而在不存在去污剂的情况下，蛋白质主要存在于团粒(不溶性级份)中。因此，C₁₂E₈不利于体外合成中RHD蛋白的表达。因此，证明Brij 35是用于生产RHD蛋白质的最相容的去污剂。因此，选择此去污剂以更大规模生产蛋白质。

I.1.在存在去污剂的情况下大规模生产和纯化RHD蛋白质

一旦建立了最佳表达和溶解度条件，在选择的去污剂(0.5％Brij 35)存在下，使用CECF***进行2ml反应体积中的大规模生产。基于通过琼脂糖-HA树脂识别与蛋白质融合的HA标签来纯化可溶性级分。通过与HA肽竞争实现洗脱。通过用0.3％C₁₂E₈替换Brij35进行整个纯化，所述C₁₂E₈先前由该小组成功用于脂质体中的RHCG蛋白(同源非红细胞Rh蛋白)的纯化和功能重建(Mouro-Chanteloup等，2010)的去污剂。

图2中显示的结果指示可溶性RHD蛋白主要存在于洗脱液和洗脱清洗液中。还观察到蛋白质的一部分未固定于树脂，并且存在于未保留的级份(NR)中。硝酸银中洗脱液的分析显示了它仅含有RHD蛋白。选择用于产生可溶性RHD蛋白的反应时间为8小时反应，因为存在RHD蛋白从16小时反应聚集的风险。

II.在存在纳米盘的情况下RHD蛋白的表达和溶解度测试

我们研究了纳米盘对RHD蛋白表达水平的影响。在不同浓度的纳米盘(例如MSP1E3D1-His_POPC(20,40,60,80μΜ))存在下产生蛋白质。

通过Western印迹法分析每次生产的合成产物。与在0.5％Brij 35存在下产生的蛋白质一样，在存在纳米盘的情况下产生的大部分蛋白质位于可溶性级份中(图3)。浓度20、40、60μM的纳米盘的存在使得可以获得与在Brij35存在下一样高的合成产率。然而，高浓度纳米盘(80μM)的存在引起减少的合成。如预期，可溶性级份中MSP蛋白的信号强度随着纳米盘的浓度而增加。我们还注意到，可溶性和不溶性级份的迁移模式是不同的，此差异是由于大肠杆菌裂解物中聚合物的存在所致，如给RTS 100试剂盒提供的方案中报告。

II.1在存在纳米盘的情况下大规模生产RHD蛋白(CECF)

在存在浓度50μM的纳米盘的情况下以1ml的终体积进行两次大规模生产。根据小规模表达测试，此浓度似乎适合于以良好的产率生产RHD蛋白。平行进行在存在0.5％Brij35的情况下的生产对照。通过Western印迹法分析构建体显示RHD蛋白质基本上在可溶性级份和纳米盘中产生。注意到不溶性部分中更大的纳米盘沉积物，提示聚集体的形成(图4)。

III.在存在纳米盘的情况下生产的RHD蛋白的不同纯化方法

关于在存在去污剂的情况下的生产，在存在纳米盘的情况下生产的蛋白质存在于也含有大肠杆菌的几种细菌裂解物蛋白质的可溶性级分中。因此，其纯化以及从空纳米盘中分离完整的纳米盘(其中***了蛋白质)是必要的。已经使用两种方法来纯化***纳米盘中的RHD蛋白。第一种方法是使用两种方案免疫沉淀RHD蛋白，第二种方法是在蔗糖梯度中超速离心合成产物(Bayburt等，2007)。

测试的第一种免疫沉淀方法包括用HA琼脂糖树脂保留与HA标签融合的RHD蛋白。在存在HA肽的情况下进行洗脱，所述HA肽通过竞争将RHD蛋白质分离。

在第二种方案中，使用蛋白质A sepharose 4B树脂使蛋白质免疫沉淀。将体外生产与兔抗RH多克隆抗体(MPC8)接触，然后将复合物与蛋白质ASepharose 4B树脂一起温育，该树脂固定与蛋白质复合的抗体。最后，通过在存在Laemmli缓冲液的情况下加热洗脱蛋白质。

在2种方案的洗脱级分中，将纳米盘与RHD蛋白共洗脱，尽管存在有低产率，在纯化的不同阶段期间有损失，如通过Western印迹法观察到(图5)。

根据免疫沉淀结果，在洗脱液中发现RHD蛋白质和纳米盘，这指示蛋白质***纳米盘中。

也通过合成产物的蔗糖梯度分析发现此结果。从顶部到底部收集来自前11个级份的样品，然后通过Western印迹法分析(图6)。注意到纳米盘的RHD蛋白和MSP蛋白处于相同的级分6-11中，对应于浓度10-15％的蔗糖，而少数的空纳米盘在较高的级份中(4-5)。

IV.在存在纳米盘的情况下生产的RHD蛋白抗原的免疫测定

为了验证在存在去污剂的情况下体外翻译的蛋白质的构象，我们希望根据Tippett分类使用针对9种D表位的构象单克隆抗体(抗ep D)开发“夹心ELISA”测试。这些抗体仅识别天然形式的蛋白质，因此它们的反应性取决于所述蛋白质的构象。非构象LOR-15C9抗体也用于本试验中作为阳性对照。

IV.1.通过流式细胞术测试抗体

在此ELISA测试的开发之前，通过对表达RHD蛋白质的红细胞的流式细胞术分析来自不同实验室并含有未知浓度的抗ep D抗体的上清液。测试了几种稀释液(纯的、1/4、1/16)，并将RHD(-)红细胞用作阴性对照(图7A-B)。

结果显示构象抗体根据其浓度识别或不识别RHD蛋白的不同表位(图7C)。分析在“单细胞”亚群中进行以消除成簇细胞。结果还显示在所研究的测试样品内的高同质性(图7E-F)。

V.ELISA测试的开发

在确定抗体将用于进行ELISA测试的稀释度后，必须优化其它参数，如捕获抗体的选择和板阻断。

作为捕捉抗体，我们具有抗HA或MPC8的选择。然而，抗HA仅可以用于粗级分而不用于通过用HA琼脂糖免疫沉淀纯化的蛋白质。事实上，洗脱级分中的HA肽的存在可以大大降低测试的灵敏度。因此，我们保留了MPC8作为捕捉抗体，其可以在所有粗级份或纯化级分的情况下使用。

用各种先前优化的条件，以1/32使用LOR-15C9抗体作为一抗(表2)，和抗人缀合抗体一式两份在第一种ELISA测试(1/40,1/80,1/160)中使用在存在40μΜ纳米盘的情况下合成的产物的不同稀释度。在不存在蛋白质或LOR-15C9一抗的情况下进行对照孔。

在表2中，测试孔中的信号强度随着蛋白质浓度而增加。尽管存在背景噪音，但是此强度高于对照孔的强度。

表2.***纳米盘中的RHD蛋白质的合成产物的不同稀释度的ELISA测试结果。

参考文献

Apoil,P.A.,M.E.Reid,G.Halverson,I.Mouro,Y.Colin,F.Roubinet,J.P.Cartron,and A.Blancher.1997.A human monoclonal anti-D antibody whichdetects a nonconformation-dependent epitope on the RhD protein byimmunoblot.Br J Haematol98:365-374.

Avent,N.D.,and M.E.Reid.2000,The Rh blood group system:a review.Blood95(2):375-387,

Bayburt,T.H.,A.J.Leitz,G.Xie,D.D.Oprian,andS.G.Sligar.2007.Transducin activation by nanoscale lipid bilayers containingone and two rhodopsins.J BiolChem282:14875-14881.

Carlson,E.D.,R.Gan,C.E.Hodgman,and M.C.Jewett.2012Cell-Free ProteinSynthesis:Applications Come of Age,Biotechnol Adv.30(5):1185–1194.

Cartron,J.P.1999.RH blood group system and molecular basis of Rh-deficiency.Baillieres Best Pract Res ClinHaematol12:655-689.

Cartron,J.P.,C.Rouillac,C.Le Van Kim,I.Mouro,andY.Colin.1996.Tentative model for the mapping of D epitopes on the RhDpolypeptide.TransfusClinBiol3:497-503.

Denisov,I.G.,Y.V.Grinkova,A.A.Lazarides,and S.G.Sligar.2004.Directedself-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlledsize.J Am ChemSoc126:3477-3487.

Goossens D,da Silva N,Metral S,Cortes U,Callebaut I,Picot J,Mouro-Chanteloup I,Cartron JP.2013.Mice expressing RHAG and RHD human blood groupgenes.PLoS One 8(11):e80460.Grinkova,Y.V.,I.G.Denisov,and S.G.Sligar.2010Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of solublenanoscale lipid bilayers.Protein Eng Des Sel.23(11):843-848.

Mouro-Chanteloup,I.,S.Cochet,M.Chami,S.Genetet,N.Zidi-Yahiaoui,A.Engel,Y.Colin,O.Bertrand,and P.Ripoche.2010.Functional reconstitution intoliposomes of purified human RhCG ammonia channel.PLoS One 5:e8921.

Mouro-Chanteloup,I.,A.M.D'Ambrosio,P.Gane,C.Le Van Kim,V.Raynal,D.Dhermy,J.P.Cartron,and Y.Colin.2002.Cell-surface expression of RhD bloodgroup polypeptide is posttranscriptionally regulated by theRhAGglycoprotein.Blood 100:1038-1047.

Mouro,I.,Y.Colin,B.Cherif-Zahar,J.P.Cartron,and C.Le VanKim.1993.Molecular genetic basis of the human Rhesus blood group system.NatGenet 5:62-65.

Rogé,J.,and J.M.Betton.2005 Use of pIVEX plasmids for proteinoverproduction in Escherichia coli,Microb Cell Fact.4:18.

Shirokov,V.A.,A.Kommer,V.A.Kolb,and A.S.Spirin.2007.Continuous-exchange protein-synthesizing systems.Methods MolBiol375:19-55.

Tippett,P.,C.Lomas-Francis,and M.Wallace.1996.The Rh antigen D:partial D antigens and associated low incidence antigens.Vox Sang 70:123-131.

序列表

<110> 国立输血研究院

国家健康和医学研究院(INSERM)

巴黎大学迪德罗特第七分校

<120> 生产红细胞蛋白质的方法

<130> B371202D35276

<150> FR1559895

<151> 16-10-2015

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2549

<212> DNA

<213> 人

<220>

<221> misc_feature

<223> RHD

<400> 1

ggtgttggag agaggggtga tgcctggtgc tggtggaacc cctgcacaga gacggacaca 60

ggatgagctc taagtacccg cggtctgtcc ggcgctgcct gcccctctgg gccctaacac 120

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gattttaagc aaaagcatcc aagaaaaaca aggcctgttc aaaaacaaga caacttcctc 1080

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aacaacatct tggtaaacaa cagactgcat atatgatggt ggtcatccag taagctaagg 1320

ttaatttatt attattcctt gttttttttt tttttttttt ttttttgaga tgtagtctta 1380

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<212> DNA

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<221> misc_feature

<223> RHAG

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aacatcacca agccaacaga catgggcata ttctttgagt tatatcctct gttccaagat 720

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tatggaccag agtgaataga tcctaagtcc caaatggcca gtgtaaaaat gtccttatgt 1980

ctgatgctgt ctcttgctct tcaatgatta attgagggga tgttactcat aaaacagata 2040

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<210> 4

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<221> misc_feature

<223> SLC14A1

<400> 4

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tgtgctatgt ccatgacttg cccaattttc tcaagtgcat tgaattccat gctcagcaaa 900

tgggacctcc ccgtcttcac cctccctttc aacatggcgt tgtcaatgta cctttcagcc 960

acaggacatt acaatccatt ctttccagcc aaactggtca tacctataac tacagctcca 1020

aatatctcct ggtctgacct cagtgccctg gagttgttga aatctatacc agtgggagtt 1080

ggtcagatct atggctgtga taatccatgg acagggggca ttttcctggg agccatccta 1140

ctctcctccc cactcatgtg cctgcatgct gccataggat cattgctggg catagcagcg 1200

ggactcagtc tttcagcccc atttgaggac atctactttg gactctgggg tttcaacagc 1260

tctctggcct gcattgcaat gggaggaatg ttcatggcgc tcacctggca aacccacctc 1320

ctggctcttg gctgtgccct gttcacggcc tatcttggag tcggcatggc aaactttatg 1380

gctgaggttg gattgccagc ttgtacctgg cccttctgtt tggccacgct attgttcctc 1440

atcatgacca caaaaaattc caacatctac aagatgcccc tcagtaaagt tacttatcct 1500

gaagaaaacc gcatcttcta cctgcaagcc aagaaaagaa tggtggaaag ccctttgtga 1560

gaacaagccc catttgcagc catggtcacg agtcatttct gcctgactgc tccagctaac 1620

ttccagggtc tcagcaaact gctgtttttc acgagtatca actttcatac tgacgcgtct 1680

gtaatctgtt cttatgctca ttttgtattt tcctttcaac tccaggaata tccttgagca 1740

tatgagagtc acatccaggt gatgtgctct ggtatggaat ttgaaacccc aatggggcct 1800

tggcactaag actggaatgt atataaagtc aaagtgctcc aacagaagga ggaagtgaaa 1860

acaaactatt agtatttatt gatattcttg gtgtttagct ggctcgatga tgttaacagt 1920

attaaaaatt aaaccccata aaccaactaa gccttatgga attcacagtc acaaaatcga 1980

agttaatcca gaattctgtg ataagcagct tggctttttt tttaaatcaa tgcaagttac 2040

acattatagc cagaatctgt atcacagagg tgcaagctga cagcagagct cagtccccac 2100

ttcctgcaaa caatggcctg caccctatcc cttgtgtgtg tgacattctc tcatgggaca 2160

atgttggggt ttttcagact gacaggactg caagagggag aaaggaattt tgtcaatcaa 2220

aattattctg tattgcaact tttctcagag attgcaaagg attttttagg tagagattat 2280

ttttccttat gaaaaatgat ctgttttaaa tgagataaaa taggagaagt tcctggctta 2340

acctgttctt acatattaaa gaaaagttac ttactgtatt tatgaaatac tcagcttagg 2400

catttttact ttaaccccta aattgatttt gtaaatgcca caaatgcata gaattgttac 2460

caacctccaa agggctcttt aaaatcatat tttttattca tttgaggatg tcttataaag 2520

actgaaggca aaggtcagat tgcttacggg tgttattttt ataagttgtt gaattcctta 2580

atttaaaaaa gctcattatt ttttgcacac tcacaatatt ctctctcaga aatcaatggc 2640

atttgaacca ccaaaaagaa ataaagggct gagtgcggtg gctcacgcct gtaatcccag 2700

cactttgggg agcccaggcg ggcagattgc ttgaacccag gagttcaaga ccagcctggg 2760

cagcatggtg aaaccctgta tctacaaaaa atacaaaaat tagccaggca tggtggtggg 2820

tgcctgtagt tccagctact tgggaggctg aggtgggaaa atgacttgag cccaggagga 2880

ggaggctgca gtgagctaag attgcaccac tgcactccaa cctgggcgac aagagtgaaa 2940

ctgtgtctct caaaaaaaaa aaaaaacaaa caaaaacaaa aacaaaacaa aacaaaacaa 3000

aacaaaacag gtaaggattc ccctgttttc ctctctttaa ttttaaagtt atcagttccg 3060

taaagtctct gtaaccaaac atactgaaga cagcaacaga agtcacgttc agggactggc 3120

tcacacctgt aatcccagca ctttgggaga tggaggtaaa aggatctctt gagcccagga 3180

gttcaagacc agcttgggca acatagcaag actccatctc ttaaaaaata aaaatagtaa 3240

cattagccag gtgtagcagc acacatctgc agcagctact caggaggctg aggtggaaag 3300

atcgcttgtg cacagaagtt cgaggctgca gtgagctata tgatcatgtc actgcactcc 3360

agcctgtgtg accgagcaag accctatctc aaaaaaatta attaattaat taattaatta 3420

atttaaaaag gaagtcatgt tcatttactt tccacttcag tgtgtatcgt gtagtatttt 3480

ggaggttgga aagtgaaacg taggaatcct gaagattttt tccacttcta gtttgcagtg 3540

ctcagtgcac aatatacatt ttgctgaatg aataaacaga aatagggaag taaacctaca 3600

aatattttag ggagaagctc acttcttcct tttctcagga aaccaagcaa gcaaacatat 3660

cgttccaatt ttaaaaccca gtgaccaaag cctttggaac tatgaatttg caactgtcat 3720

aggtttatgg atattgctgt ggagaagctc aattttcagt gtttgaactg aaccctttct 3780

tgttagggaa cgtgtgaaag aagaattgtg gggaaaaaaa agcaagcata accaaagatc 3840

atcagcagtg aagaatctag gctgtggctg agagaaccag aggcctctaa aatggacccg 3900

agtcgatctt cagaacaggg atctaccatg caggagcttc ttgtgctcac acaaatctgt 3960

aaatgggaac attgtacatt gtcgaattta aatgatatta attttctcaa gctatttttg 4020

ttactatttt cctaaaattg aatatttgca gggagcactt atactttttc ctaatgtctg 4080

tataacaaat ttctatgcaa gtacatgaat aaattatgct cacagctca 4129

<210> 5

<211> 321

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(321)

<223> RhD

<400> 5

Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr

20 25 30

His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr

35 40 45

Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn

65 70 75 80

Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly

85 90 95

Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser

100 105 110

Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Leu Ser Val Leu Ile Ser Val Asp

115 120 125

Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu

130 135 140

Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Asn Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile

145 150 155 160

Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Met Met His Ile Tyr Val Phe Ala

165 170 175

Ala Tyr Phe Gly Leu Ser Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Glu Asp Lys Asp Gln Thr Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser

195 200 205

Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Phe Asn

210 215 220

Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Glu Arg Lys Asn Ala Val Phe Asn

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Ala Val Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser

245 250 255

Ser Leu Ala His Pro Gln Gly Lys Ile Ser Lys Thr Tyr Val His Ser

260 265 270

Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile

275 280 285

Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile

290 295 300

Ser Val Gly Gly Ala Lys Tyr Leu Pro Phe Pro His Leu Ala Val Gly

305 310 315 320

Phe

<210> 6

<211> 417

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(417)

<223> RhCE

<400> 6

Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr

20 25 30

His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr

35 40 45

Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Leu Gly Leu Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Ser Asn Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn

65 70 75 80

Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly

85 90 95

Phe Leu Ser Gln Phe Pro Pro Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser

100 105 110

Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Met Ser Val Leu Ile Ser Ala Gly

115 120 125

Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu

130 135 140

Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Thr Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile

145 150 155 160

Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Leu Arg His Phe Tyr Val Phe Ala

165 170 175

Ala Tyr Phe Gly Leu Thr Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro

180 185 190

Lys Gly Thr Glu Asp Asn Asp Gln Arg Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser

195 200 205

Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Val Asn

210 215 220

Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn Ala Met Phe Asn

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Ala Leu Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser

245 250 255

Ser Leu Ala His Pro Gln Arg Lys Ile Ser Met Thr Tyr Val His Ser

260 265 270

Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile

275 280 285

Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile

290 295 300

Ser Ile Gly Gly Ala Lys Cys Leu Pro Val Cys Cys Asn Arg Val Leu

305 310 315 320

Gly Ile His His Ile Ser Val Met His Ser Ile Phe Ser Leu Leu Gly

325 330 335

Leu Leu Gly Glu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu His Thr Val

340 345 350

Trp Asn Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly

355 360 365

Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Thr Ser Gly Leu Leu Thr

370 375 380

Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Val Ala Lys

385 390 395 400

Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly

405 410 415

Phe

<210> 7

<211> 409

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(409)

<223> RhAG

<400> 7

Met Arg Phe Thr Phe Pro Leu Met Ala Ile Val Leu Glu Ile Ala Met

1 5 10 15

Ile Val Leu Phe Gly Leu Phe Val Glu Tyr Glu Thr Asp Gln Thr Val

20 25 30

Leu Glu Gln Leu Asn Ile Thr Lys Pro Thr Asp Met Gly Ile Phe Phe

35 40 45

Glu Leu Tyr Pro Leu Phe Gln Asp Val His Val Met Ile Phe Val Gly

50 55 60

Phe Gly Phe Leu Met Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Gly Phe Ser Ser Val

65 70 75 80

Gly Ile Asn Leu Leu Val Ala Ala Leu Gly Leu Gln Trp Gly Thr Ile

85 90 95

Val Gln Gly Ile Leu Gln Ser Gln Gly Gln Lys Phe Asn Ile Gly Ile

100 105 110

Lys Asn Met Ile Asn Ala Asp Phe Ser Ala Ala Thr Val Leu Ile Ser

115 120 125

Phe Gly Ala Val Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Gln Met Leu Ile Met

130 135 140

Thr Ile Leu Glu Ile Val Phe Phe Ala His Asn Glu Tyr Leu Val Ser

145 150 155 160

Glu Ile Phe Lys Ala Ser Asp Ile Gly Ala Ser Met Thr Ile His Ala

165 170 175

Phe Gly Ala Tyr Phe Gly Leu Ala Val Ala Gly Ile Leu Tyr Arg Ser

180 185 190

Gly Leu Arg Lys Gly His Glu Asn Glu Glu Ser Ala Tyr Tyr Ser Asp

195 200 205

Leu Phe Ala Met Ile Gly Thr Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser

210 215 220

Phe Asn Ser Ala Ile Ala Glu Pro Gly Asp Lys Gln Cys Arg Ala Ile

225 230 235 240

Val Asn Thr Tyr Phe Ser Leu Ala Ala Cys Val Leu Thr Ala Phe Ala

245 250 255

Phe Ser Ser Leu Val Glu His Arg Gly Lys Leu Asn Met Val His Ile

260 265 270

Gln Asn Ala Thr Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Cys Ala Asp

275 280 285

Met Ala Ile His Pro Phe Gly Ser Met Ile Ile Gly Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Met Val Ser Val Leu Gly Tyr Lys Phe Leu Thr Pro Leu Phe Thr Thr

305 310 315 320

Lys Leu Arg Ile His Asp Thr Cys Gly Val His Asn Leu His Gly Leu

325 330 335

Pro Gly Val Val Gly Gly Leu Ala Gly Ile Val Ala Val Ala Met Gly

340 345 350

Ala Ser Asn Thr Ser Met Ala Met Gln Ala Ala Ala Leu Gly Ser Ser

355 360 365

Ile Gly Thr Ala Val Val Gly Gly Leu Met Thr Gly Leu Ile Leu Lys

370 375 380

Leu Pro Leu Trp Gly Gln Pro Ser Asp Gln Asn Cys Tyr Asp Asp Ser

385 390 395 400

Val Tyr Trp Lys Val Pro Lys Thr Arg

405

<210> 8

<211> 445

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(445)

<223> UTB

<400> 8

Met Asn Gly Arg Ser Leu Ile Gly Gly Ala Gly Asp Ala Arg His Gly

1 5 10 15

Pro Val Trp Lys Asp Pro Phe Gly Thr Lys Ala Gly Asp Ala Ala Arg

20 25 30

Arg Gly Ile Ala Arg Leu Ser Leu Ala Leu Ala Asp Gly Ser Gln Glu

35 40 45

Gln Glu Pro Glu Glu Glu Ile Ala Met Glu Asp Ser Pro Thr Met Val

50 55 60

Arg Val Asp Ser Pro Thr Met Val Arg Gly Glu Asn Gln Val Ser Pro

65 70 75 80

Cys Gln Gly Arg Arg Cys Phe Pro Lys Ala Leu Gly Tyr Val Thr Gly

85 90 95

Asp Met Lys Glu Leu Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Pro Val Val Leu

100 105 110

Gln Phe Ile Asp Trp Ile Leu Arg Gly Ile Ser Gln Val Val Phe Val

115 120 125

Asn Asn Pro Val Ser Gly Ile Leu Ile Leu Val Gly Leu Leu Val Gln

130 135 140

Asn Pro Trp Trp Ala Leu Thr Gly Trp Leu Gly Thr Val Val Ser Thr

145 150 155 160

Leu Met Ala Leu Leu Leu Ser Gln Asp Arg Ser Leu Ile Ala Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Gly Tyr Asn Ala Thr Leu Val Gly Val Leu Met Ala Val Phe

180 185 190

Ser Asp Lys Gly Asp Tyr Phe Trp Trp Leu Leu Leu Pro Val Cys Ala

195 200 205

Met Ser Met Thr Cys Pro Ile Phe Ser Ser Ala Leu Asn Ser Met Leu

210 215 220

Ser Lys Trp Asp Leu Pro Val Phe Thr Leu Pro Phe Asn Met Ala Leu

225 230 235 240

Ser Met Tyr Leu Ser Ala Thr Gly His Tyr Asn Pro Phe Phe Pro Ala

245 250 255

Lys Leu Val Ile Pro Ile Thr Thr Ala Pro Asn Ile Ser Trp Ser Asp

260 265 270

Leu Ser Ala Leu Glu Leu Leu Lys Ser Ile Pro Val Gly Val Gly Gln

275 280 285

Ile Tyr Gly Cys Asp Asn Pro Trp Thr Gly Gly Ile Phe Leu Gly Ala

290 295 300

Ile Leu Leu Ser Ser Pro Leu Met Cys Leu His Ala Ala Ile Gly Ser

305 310 315 320

Leu Leu Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser Ala Pro Phe Glu Asp

325 330 335

Ile Tyr Phe Gly Leu Trp Gly Phe Asn Ser Ser Leu Ala Cys Ile Ala

340 345 350

Met Gly Gly Met Phe Met Ala Leu Thr Trp Gln Thr His Leu Leu Ala

355 360 365

Leu Gly Cys Ala Leu Phe Thr Ala Tyr Leu Gly Val Gly Met Ala Asn

370 375 380

Phe Met Ala Glu Val Gly Leu Pro Ala Cys Thr Trp Pro Phe Cys Leu

385 390 395 400

Ala Thr Leu Leu Phe Leu Ile Met Thr Thr Lys Asn Ser Asn Ile Tyr

405 410 415

Lys Met Pro Leu Ser Lys Val Thr Tyr Pro Glu Glu Asn Arg Ile Phe

420 425 430

Tyr Leu Gln Ala Lys Lys Arg Met Val Glu Ser Pro Leu

435 440 445

<210> 9

<211> 201

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(201)

<223> MSP1

<400> 9

Gly Leu Lys Leu Leu Ser Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser

1 5 10 15

Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn

20 25 30

Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu

35 40 45

Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys

50 55 60

Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu

65 70 75 80

Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln

85 90 95

Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala

100 105 110

His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu

115 120 125

Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly

130 135 140

Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr

145 150 155 160

Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu

165 170 175

Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu

180 185 190

Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

195 200

<210> 10

<211> 211

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(211)

<223> MSP1D1

<400> 10

Gly His His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu

1 5 10 15

Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu

20 25 30

Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu

35 40 45

Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys

50 55 60

Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met

65 70 75 80

Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu

85 90 95

Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu

100 105 110

Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg

115 120 125

Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala

130 135 140

Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr

145 150 155 160

His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys

165 170 175

Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser

180 185 190

Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu

195 200 205

Asn Thr Gln

210

<210> 11

<211> 278

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(278)

<223> MSP1E3D1

<400> 11

Met Gly His His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr

1 5 10 15

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln

20 25 30

Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr

35 40 45

Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala

50 55 60

Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu

65 70 75 80

Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln

85 90 95

Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro

100 105 110

Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu

115 120 125

Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln

130 135 140

Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu

165 170 175

Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp

180 185 190

Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg

195 200 205

Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu

225 230 235 240

Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val

245 250 255

Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr

260 265 270

Lys Lys Leu Asn Thr Gln

275

Claims

1.合成选自RhD、RhCE、RhAG和UTB的红细胞蛋白质或其变体的方法，所述方法包括以下步骤：

b)所述蛋白质的合成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在至少一种选自Brij 35或Brij58的非离子型去污剂或包含选自SEQ ID NO:9、10或11的蛋白质的MSP蛋白的纳米盘的存在下发生根据步骤a)的接触。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于用于蛋白质生产的所述无细胞***是分批***或具有连续交换的无细胞***。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于纳米盘中的浓度小于80μM。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所述红细胞蛋白质或其变体和/或选自SEQ ID NO.9、10或11的蛋白质的MSP蛋白与标签序列融合。

6.纳米盘、脂质体或非离子型去污剂中表达的红细胞蛋白质，其可通过权利要求1至5中任一项所述的方法获得。

7.根据权利要求6所述的红细胞蛋白质，其特征在于所述蛋白质选自RhD、RhCE、RhAG和UTB，或与其具有至少95％同一性的同源物，并被偶联至固体支持物。

8.组合物，其包含根据权利要求6所述的红细胞蛋白和选自SEQ ID NO.9、10或11的蛋白质的MSP蛋白。

9.组合物，其以大于0.01mg/ml，优选大于0.1mg/ml的浓度包含权利要求6的红细胞蛋白质。

10.根据权利要求6或7中任一项所述的蛋白质或根据权利要求8或9中任一项所述的组合物在同种抗体检测的体外测试中的用途。