JP6045025B2 - 抗菌剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規抗菌剤を見出すための技術に関する。
市中および病院内において、各種感染症を引き起こす病原体として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）等の数多くの細菌が知られている。現在までに多くの抗菌剤が市販されているが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に代表されるように、各種抗菌剤に対して、耐性を獲得した株が増加してきている。これらの耐性菌による院内感染はしばしば重篤化するため、臨床上大きな問題となっている。したがって、作用機序が既存の抗菌薬等とは異なる薬剤を見出すことが望まれている。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦｔｓＷは、１０回膜貫通型タンパク質であり、菌の***機構に必須であることが知られている（非特許文献１）。
Ｅ．ｃｏｌｉのＦｔｓＱ（ｄｉｖｌＢ）は、１回膜貫通型タンパク質であり、細胞***に関与することが知られている。ＦｔｓＱは、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＬ、ＦｔｓＢまたはＦｔｓＫと結合するとの報告がなされている（非特許文献２、３）。
Ｅ．ｃｏｌｉのＦｔｓＫ（ｓｐｏＩＩＩＥ）は、４回膜貫通型タンパク質であり、染色体分配に関与するＤＮＡトランスロカーゼである。ＦｔｓＫは、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＬ、ＦｔｓＱまたはＦｔｓＺとの相互作用が知られている（非特許文献３）。
しかし、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱまたはＦｔｓＫを用いた抗菌剤のスクリーニング方法は知られていない。
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ２１６， Ｉｓｓｕｅ １， ２３−３２， ２００２
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ６７， １１４３−１１５５， ２００８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １８８， ｎｏ． １， １９−２７， ２００６
本発明の目的は、新規抗菌剤を見出すための新規技術を提供することにある。
本発明者らは、抗菌スペクトルが広く、強力な抗菌活性をもつスタロバシンに注目をし、研究を行った。
スタロバシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０由来の天然化合物である（特許第２６１４９２０号明細書、特許第３５４２１５０号明細書、特許第３５６８９７８号明細書）。抗菌スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つことが知られている。本発明者らはスタロバシンの作用機序を解明することができれば、スタロバシンと同じ作用機序の抗菌剤のスクリーニングを行うことができ、スタロバシンと同様に、スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つ物質を得ることが可能になると考え、鋭意研究を行った。その結果、ＦｔｓＷがスタロバシンの標的タンパク質であることを見出した。さらに、特に、ＦｔｓＷの９／１０ループが、スタロバシンとの結合に重要であることを見出した。
また、スタロバシンによって、ＦｔｓＷとＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの複合体形成が阻害されることを見出した。
さらに、ＦｔｓＷおよびＦｔｓＱが黄色ブドウ球菌において生存必須遺伝子であることを見出した。
上記より、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫ、それらの部分ペプチドを用いて新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングを行うことができる。
また、ＦｔｓＷがスタロバシンの強力な抗菌活性と強く関連づいていることから、スタロバシンを用いてＦｔｓＷと結合するタンパク質を探索することもできる。見出されたタンパク質は、新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングに利用することができる。
スタロバシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０由来の天然化合物である（特許第２６１４９２０号明細書、特許第３５４２１５０号明細書、特許第３５６８９７８号明細書）。抗菌スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つことが知られている。本発明者らはスタロバシンの作用機序を解明することができれば、スタロバシンと同じ作用機序の抗菌剤のスクリーニングを行うことができ、スタロバシンと同様に、スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つ物質を得ることが可能になると考え、鋭意研究を行った。その結果、ＦｔｓＷがスタロバシンの標的タンパク質であることを見出した。さらに、特に、ＦｔｓＷの９／１０ループが、スタロバシンとの結合に重要であることを見出した。
また、スタロバシンによって、ＦｔｓＷとＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの複合体形成が阻害されることを見出した。
さらに、ＦｔｓＷおよびＦｔｓＱが黄色ブドウ球菌において生存必須遺伝子であることを見出した。
上記より、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫ、それらの部分ペプチドを用いて新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングを行うことができる。
また、ＦｔｓＷがスタロバシンの強力な抗菌活性と強く関連づいていることから、スタロバシンを用いてＦｔｓＷと結合するタンパク質を探索することもできる。見出されたタンパク質は、新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングに利用することができる。
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１−１）ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程、および
該ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（１−２）被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
該ポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（１−３）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、９／１０ループを含むペプチドである、（１−１）または（１−２）に記載のスクリーニング方法。
（１−４）該ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱおよびＦｔｓＫが、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドである、（１−１）〜（１−３）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（１−５）ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
本発明は、さらに、以下を含有する。
（１−６）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、１／２ループを含むペプチドである、（１−１）または（１−２）に記載のスクリーニング方法。
（１−７）スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体存在下で接触させることを特徴とする、（１−１）〜（１−４）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（１−８）抗ＦｔｓＷ抗体またはスタロバシンを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（１−１）ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程、および
該ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（１−２）被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
該ポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（１−３）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、９／１０ループを含むペプチドである、（１−１）または（１−２）に記載のスクリーニング方法。
（１−４）該ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱおよびＦｔｓＫが、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドである、（１−１）〜（１−３）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（１−５）ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
本発明は、さらに、以下を含有する。
（１−６）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、１／２ループを含むペプチドである、（１−１）または（１−２）に記載のスクリーニング方法。
（１−７）スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体存在下で接触させることを特徴とする、（１−１）〜（１−４）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（１−８）抗ＦｔｓＷ抗体またはスタロバシンを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
また、本発明には、以下も含まれる。
（２−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（２−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（２−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（２−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（３−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子またはＦｔｓＱの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。
（３−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（３−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
さらに、本発明には、以下も含まれる。
（４−１）被検物質の存在下で、
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、ＦｔｓＷ結合タンパク質のスクリーニング方法。
（４−２）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、１／２ループまたは９／１０ループを含むペプチドである、（４−１）記載のスクリーニング方法。
（４−３）該ＦｔｓＷが、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドである、（４−１）または（４−２）に記載のスクリーニング方法。
（４−１）被検物質の存在下で、
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、ＦｔｓＷ結合タンパク質のスクリーニング方法。
（４−２）該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、１／２ループまたは９／１０ループを含むペプチドである、（４−１）記載のスクリーニング方法。
（４−３）該ＦｔｓＷが、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドである、（４−１）または（４−２）に記載のスクリーニング方法。
本発明のスクリーニング方法により、新規作用メカニズムを持つ抗菌剤をスクリーニングすることができる。該方法により、スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つ新規な抗菌剤を得ることができる。
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、特に指示のない限り、遺伝子組換え技術、細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法、分子生物学的手法および免疫学的手法等は公知の方法が採用される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （２００３）に記載された方法等が挙げられる。
本発明においては、特に指示のない限り、遺伝子組換え技術、細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法、分子生物学的手法および免疫学的手法等は公知の方法が採用される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （２００３）に記載された方法等が挙げられる。
「抗菌剤」とは、細菌の増殖を抑制したり、細菌を死滅させたりする働きのある化合物を意味する。細菌としては、例えば、グラム陽性菌（ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、腸球菌、ジフテリア菌、結核菌、らい菌、炭疽菌、枯草菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌等）、グラム陰性菌（淋菌、脳膜炎菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑膿菌、赤痢菌、インフルエンザ菌、百日咳菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、アシネトバクター、カンピロバクター、レジオネラ菌、ヘリコバクター等）等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法で得られる抗菌剤の対象となる細菌は、特に限定されない。該抗菌剤は、スタロバシンのように、抗菌スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つ物質であることが期待される。
「スタロバシン」とは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＰＢＪ−５３６０由来の天然化合物であり、Ａ〜Iまでの９種類の化合物が特定されている。化合物の詳細や取得方法は、特許第２６１４９２０号明細書、特許第３５４２１５０号明細書、特許第３５６８９７８号明細書に記載されている。好ましくは、特許第３５６８９７８号明細書に記載されているスタロバシンIである。
「ＦｔｓＷ」とは、細菌が持つ１０回膜貫通型タンパク質である。細菌由来のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、該タンパク質と同等の機能を有する誘導体であってもよい。細菌としては、大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、炭疽菌、レンサ球菌等が挙げられる（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．， ７（４）， ３２４−３８， ２００８）。
本発明で用いるＦｔｓＷとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷは、ＳＡ０９６２と称されることもある。具体的には、配列番号４８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
本発明で用いるＦｔｓＷとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷは、ＳＡ０９６２と称されることもある。具体的には、配列番号４８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
「ＦｔｓＷの部分ペプチド」とは、上記ＦｔｓＷの断片である。ＦｔｓＷのアミノ酸配列中の連続した５個以上のアミノ酸残基であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個等からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。特に好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの断片である。
ＦｔｓＷは１０回膜貫通型タンパク質であり、細胞外ループはＮ端側から５つ存在することが知られている。各ループをＮ端側より１／２ループ、３／４ループ、５／６ループ、７／８ループ、９／１０ループとする。各細菌のＦｔｓＷのアミノ酸配列上の細胞外ループの位置は、公知のタンパク質構造予測の手法（例えば、ＳＯＳＵＩ、インターネット＜ＵＲＬ：http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/＞）により、推定することができる。
本発明で用いるＦｔｓＷの部分ペプチドとして、好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの細胞外ループを含むペプチド（１／２ループ 配列番号６、３／４ループ 配列番号２０、５／６ループ 配列番号２１、７／８ループ 配列番号２２、９／１０ループ 配列番号２３）である。さらに好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの１／２ループ（配列番号６）または９／１０ループ（配列番号２３）を含むペプチドである。特に好ましくは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１３のアミノ酸配列を含むペプチドであり、例えば、配列番号２４または配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドである。
ＦｔｓＷは１０回膜貫通型タンパク質であり、細胞外ループはＮ端側から５つ存在することが知られている。各ループをＮ端側より１／２ループ、３／４ループ、５／６ループ、７／８ループ、９／１０ループとする。各細菌のＦｔｓＷのアミノ酸配列上の細胞外ループの位置は、公知のタンパク質構造予測の手法（例えば、ＳＯＳＵＩ、インターネット＜ＵＲＬ：http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/＞）により、推定することができる。
本発明で用いるＦｔｓＷの部分ペプチドとして、好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの細胞外ループを含むペプチド（１／２ループ 配列番号６、３／４ループ 配列番号２０、５／６ループ 配列番号２１、７／８ループ 配列番号２２、９／１０ループ 配列番号２３）である。さらに好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの１／２ループ（配列番号６）または９／１０ループ（配列番号２３）を含むペプチドである。特に好ましくは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１３のアミノ酸配列を含むペプチドであり、例えば、配列番号２４または配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドである。
「ＦｔｓＱ」とは、細菌が持つ１回膜貫通型タンパク質である。細菌由来のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、該タンパク質と同等の機能を有する誘導体であってもよい。細菌としては、大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、炭疽菌、レンサ球菌等が挙げられる。
本発明で用いるＦｔｓＱとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱは、ＳＡ１０２７と称されることもある。具体的には、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４３００）からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
本発明で用いるＦｔｓＱとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱは、ＳＡ１０２７と称されることもある。具体的には、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４３００）からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
「ＦｔｓＱの部分ペプチド」とは、上記ＦｔｓＱの断片である。ＦｔｓＱのアミノ酸配列中の連続した５個以上のアミノ酸残基であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個等からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。特に好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱの断片である。
「ＦｔｓＫ」とは、細菌が持つ４回膜貫通型タンパク質である。細菌由来のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、該タンパク質と同等の機能を有する誘導体であってもよい。細菌としては、大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、炭疽菌、レンサ球菌等が挙げられる。
本発明で用いるＦｔｓＫとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＫである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＫは、ＳＡ１１１９と称されることもある。具体的には、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４３９２）からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
本発明で用いるＦｔｓＫとして、特に好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＫである。黄色ブドウ球菌のＦｔｓＫは、ＳＡ１１１９と称されることもある。具体的には、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４３９２）からなるポリペプチド、または、その誘導体である。
「ＦｔｓＫの部分ペプチド」とは、上記ＦｔｓＫの断片である。ＦｔｓＫのアミノ酸配列中の連続した５個以上のアミノ酸残基であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個等からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。特に好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＫの断片である。
「タンパク質の同等の機能を有する誘導体」とは、該タンパク質のアミノ酸配列において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列」からなるポリペプチドが挙げられる。「１もしくは数個のアミノ酸」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個のアミノ酸を意味する。欠失、置換、挿入または付加によっても、細菌由来のタンパク質と同等の機能を有する限り、該ポリペプチドを本発明に利用することができる。
例えば、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷおよびＦｔｓＱは、本発明者らが、鋭意研究の結果、生存必須遺伝子であることを見出したことから、その誘導体が黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷまたはＦｔｓＱと「同等の機能を有する」か否かの確認には、細菌増殖機能の相補性試験において、該誘導体が増殖機能を相補するものであればよい。
細菌増殖機能の相補性試験は、慣用の遺伝子導入方法で、ＦｔｓＷまたはＦｔｓＱの温度感受性変異株に、該誘導体をコードする遺伝子を導入し、得られた形質転換体を、野生型の黄色ブドウ球菌は生育し、温度感受性変異株は生育できない条件下に培養することにより行なわれうる。ここで、前記形質転換体が生育した場合、該誘導体は本発明に用いることができる。
例えば、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷおよびＦｔｓＱは、本発明者らが、鋭意研究の結果、生存必須遺伝子であることを見出したことから、その誘導体が黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷまたはＦｔｓＱと「同等の機能を有する」か否かの確認には、細菌増殖機能の相補性試験において、該誘導体が増殖機能を相補するものであればよい。
細菌増殖機能の相補性試験は、慣用の遺伝子導入方法で、ＦｔｓＷまたはＦｔｓＱの温度感受性変異株に、該誘導体をコードする遺伝子を導入し、得られた形質転換体を、野生型の黄色ブドウ球菌は生育し、温度感受性変異株は生育できない条件下に培養することにより行なわれうる。ここで、前記形質転換体が生育した場合、該誘導体は本発明に用いることができる。
「抗ＦｔｓＷ抗体」とは、ＦｔｓＷに結合する抗体およびその断片が挙げられる。ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。該抗体は公知の抗体の作製方法により得ることができる。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体またはその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。
本発明の抗ＦｔｓＷ抗体としては、例えば、１／２ループに対する抗体等が挙げられる。
１／２ループに対するモノクローナル抗体の例としては、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＤＡＭＳ（配列番号２７）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＭＳＳＧＧＹＳＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号２８）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＲＦＧＳＤＤＥＷＦＡＭＤＹ（配列番号２９）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＲＫＮＹＬＴ（配列番号３０）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３１）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ（配列番号３２）を有する抗体（１１Ｅ８）、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３３）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＮＩＮＰＤＳＧＳＳＤＹＮＥ（配列番号３４）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＲＧＨ（配列番号３５）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＳＨＡＶＡ（配列番号３６）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＳＡＳＮＲＦＴ（配列番号３７）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号３８）を有する抗体（２３Ｃ７）、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＮＹＬＩＥ（配列番号３９）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＶＩＮＰＶＲＧＶＴＹＹＮＥＫＦＫＤ（配列番号４０）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＮＳＧＦＦ（配列番号４１）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＡＧＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号４２）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＬＶＳＥＬＤＳ（配列番号４３）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＷＱＧＳＨＦＰＲＴ（配列番号４４）を有する抗体（１１Ｂ１１）、
等を挙げることができる。
本発明の抗ＦｔｓＷ抗体としては、例えば、１／２ループに対する抗体等が挙げられる。
１／２ループに対するモノクローナル抗体の例としては、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＤＡＭＳ（配列番号２７）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＭＳＳＧＧＹＳＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号２８）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＲＦＧＳＤＤＥＷＦＡＭＤＹ（配列番号２９）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＲＫＮＹＬＴ（配列番号３０）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３１）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ（配列番号３２）を有する抗体（１１Ｅ８）、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３３）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＮＩＮＰＤＳＧＳＳＤＹＮＥ（配列番号３４）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＲＧＨ（配列番号３５）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＳＨＡＶＡ（配列番号３６）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＳＡＳＮＲＦＴ（配列番号３７）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号３８）を有する抗体（２３Ｃ７）、
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＮＹＬＩＥ（配列番号３９）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＶＩＮＰＶＲＧＶＴＹＹＮＥＫＦＫＤ（配列番号４０）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＮＳＧＦＦ（配列番号４１）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＡＧＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号４２）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＬＶＳＥＬＤＳ（配列番号４３）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＷＱＧＳＨＦＰＲＴ（配列番号４４）を有する抗体（１１Ｂ１１）、
等を挙げることができる。
上記のＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する生物学的活性（たとえば、親和性や細胞傷害阻害活性等）が保持される範囲内であれば、上記３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを有するような改変体も本発明に含まれる。
本発明の抗菌剤のスクリーニング方法は、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫ、それらの部分ペプチド、抗ＦｔｓＷ抗体、またはスタロバシンを用いたスクリーニング方法であることを特徴とする。以下に、詳細に説明する。
（Ａ）ＦｔｓＷと結合する抗菌剤のスクリーニング方法
具体的には、
（１−１）ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程、および
該ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
具体的には、
（１−１）ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程、および
該ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
該スクリーニング方法によって、ＦｔｓＷと結合することにより抗菌活性を示す抗菌剤をスクリーニングすることができる。該方法によれば、ＦｔｓＷへの結合を介してＦｔｓＷの機能を阻害する物質を選択することができるため、選択された抗菌剤は、直接的に該タンパク質に結合してその機能を阻害するという特徴的な性質を有する。
「被検物質」としては、いかなる化合物も使用することができる。例えば、有機化合物（アミノ酸、ポリペプチドまたはその誘導体、核酸またはその誘導体、低分子化合物、糖、高分子化合物等）、無機化合物等を使用することができる。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、アプタマー、デコイ核酸等も含まれる。本発明の被検物質としては、例えば、市販されている化合物のライブラリーを用いてもよい。
「ＦｔｓＷの部分ペプチド」としては、好ましくは黄色ブドウ球菌の断片である。より好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの細胞外ループである。具体的には、１／２ループ（配列番号６）、３／４ループ（配列番号２０）、５／６ループ（配列番号２１）、７／８ループ（配列番号２２）、９／１０ループ（配列番号２３）を含むペプチド等が挙げられる。さらに好ましくは黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷの１／２ループ（配列番号６）および９／１０ループ（配列番号２３）を含むペプチドである。特に好ましくは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むペプチド、例えば、配列番号２４または１３のアミノ酸配列からなるペプチドである。
ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの調製方法は、特に制限されないが、例えば、ＦｔｓＷをコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、または、インビトロで前記ポリペプチドを発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
「ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程」は、ＦｔｓＷの本来の機能を妨げない溶液中において、被検物質とＦｔｓＷを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。
「ＦｔｓＷの本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。
「反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜９．０、より好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．０で、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは、２５℃〜３７℃、さらに好ましくは、２５℃、１分〜１時間、好ましくは、３分〜３０分、より好ましくは５分〜２０分、さらに好ましくは、１０分維持すること、または０℃〜２０℃、好ましくは、２℃〜１０℃、より好ましくは、３℃〜８℃、さらに好ましくは、４℃で、２０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜１２時間、より好ましくは、４０分〜２時間、さらに好ましくは、１時間維持すること等が挙げられる。より具体的には、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、８０ｍＭ ＫＣｌ、５％ グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ｐｏｌｙｄＩｄＣ、５０ｎｇ／ｍｌ ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０％ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ中、前記条件下に維持することが挙げられる。
「ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質のバインディングアッセイ等により行なわれうる。
該スクリーニング方法は、スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体を用いて、競合実験を行うこともできる。つまり、スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体の存在下で、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させることにより、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドに対する結合力が、スタロバシンや利用した抗ＦｔｓＷ抗体と比較して強い被検物質を選択することができる。
（Ｂ）ＦｔｓＷとＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの複合体形成を阻害する抗菌剤のスクリーニング方法
具体的には、
（１−２）被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドから選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
該ポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
具体的には、
（１−２）被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドから選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
該ポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
大腸菌において、ＦｔｓＷとＦｔｓＱが直接的に結合すること、また、ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＬ、ＦｔｓＢ、ＦｔｓＸ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＺが相互作用して機能することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１８８， ｎｏ．１， １９−２７， ２００６）。該スクリーニング方法によって、ＦｔｓＷとＦｔｓＱの結合を検出、ＦｔｓＷとＦｔｓＫの結合を検出、または、ＦｔｓＷとＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体の結合を検出することによって、該複合体形成を阻害することにより抗菌活性を示す抗菌剤をスクリーニングすることができる。各タンパク質の代わりに、各タンパク質の部分ペプチドを用いることもできる。
「被検物質」および「ＦｔｓＷの部分ペプチド」は、スクリーニング方法（Ａ）と同じである。
「ＦｔｓＱの部分ペプチド」または「ＦｔｓＫの部分ペプチド」は、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合可能であれば、長さや部位に限定されない。特に好ましくは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの断片である。ＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの部分ペプチドがＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合可能か否かは、公知のバインディングアッセイ等により確認することができる。
「被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドから選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程」は、ＦｔｓＷとＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの本来の機能を妨げない溶液中において、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドから選ばれる１以上のポリペプチド（例えば、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＱの部分ペプチド、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＫの部分ペプチド、ＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体、ＦｔｓＱの部分ペプチド／ＦｔｓＫの複合体、ＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの部分ペプチドの複合体、ＦｔｓＱとＦｔｓＫの混合物等）を混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。
「ＦｔｓＷとＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの本来の機能を妨げない溶液」は、スクリーニング方法（Ａ）の「ＦｔｓＷの本来の機能を妨げない溶液」と同じである。
「反応条件」は、スクリーニング方法（Ａ）と同じである。
ＦｔｓＷとＦｔｓＱの「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＱのバインディングアッセイ、ＦｔｓＱを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＷのバインディングアッセイ等により行なわれうる。各タンパク質のいずれかが部分ペプチドであったとしても、同様に行うことができる。
ＦｔｓＷとＦｔｓＫの「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＫのバインディングアッセイ、ＦｔｓＫを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＷのバインディングアッセイ等により行なわれうる。各タンパク質のいずれかが部分ペプチドであったとしても、同様に行うことができる。
ＦｔｓＷとＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体の「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体のバインディングアッセイ、ＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体を保持した担体への被検物質およびＦｔｓＷのバインディングアッセイ等により行なわれうる。各タンパク質のいずれかが部分ペプチドであったとしても、同様に行うことができる。
ＦｔｓＷとＦｔｓＫの「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＫのバインディングアッセイ、ＦｔｓＫを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＷのバインディングアッセイ等により行なわれうる。各タンパク質のいずれかが部分ペプチドであったとしても、同様に行うことができる。
ＦｔｓＷとＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体の「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷを保持した担体への被検物質およびＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体のバインディングアッセイ、ＦｔｓＱ／ＦｔｓＫの複合体を保持した担体への被検物質およびＦｔｓＷのバインディングアッセイ等により行なわれうる。各タンパク質のいずれかが部分ペプチドであったとしても、同様に行うことができる。
該スクリーニング方法は、スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体を用いて、競合実験を行うこともできる。つまり、スタロバシンまたは抗ＦｔｓＷ抗体、および被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドから選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとを接触させることにより、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、ＦｔｓＱまたはＦｔｓＫの複合体形成に対する阻害力が、スタロバシンや利用した抗ＦｔｓＷ抗体と比較して強い被検物質を選択することができる。
また、全長のＦｔｓＷとＦｔｓＷの部分ペプチドを用いて被検物質と部分ペプチドの競合実験を行うこともできる。
また、全長のＦｔｓＷとＦｔｓＷの部分ペプチドを用いて被検物質と部分ペプチドの競合実験を行うこともできる。
（Ｃ）ＦｔｓＷ遺伝子またはタンパク質の発現を抑制する抗菌剤のスクリーニング方法
具体的には、
（２−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
具体的には、
（２−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
本発明者らは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷが生存必須タンパク質であることを見出した。該スクリーニング方法によって、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷの発現を抑制することにより抗菌活性を示す抗菌剤をスクリーニングすることができる。
より具体的には、以下の方法が挙げられる。
（２−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
（２−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＷの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（２−１）記載のスクリーニング方法。
「被検物質」は、スクリーニング方法（Ａ）と同じである。
「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞」または「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞」とは、発現可能な細胞であれば、特に限定されない。原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子またはＦｔｓＷを発現できるものであればいずれも用いることができる。黄色ブドウ球菌を用いることも可能である。
「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞」または「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞」と被検物質との接触は、該細胞が成育可能な条件下で培養しながら行うことができる。また、該条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（ｐＨ、温度、培地等）を選択することができる。
被検物質と接触させる際の該細胞の細胞数は、例えば、９８ウェルプレートを用いる場合、例えば１．０×１０３〜１．０×１０４個／ウェル、好ましくは１．０×１０４〜１．０×１０５個／ウェル、より好ましくは１．０×１０５〜１．０×１０６個／ウェルである。
「対照細胞」とは、「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞」または「黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞」において、被検物質を接触させない場合の細胞を意味する。被検物質を接触させない場合とは、被検物質の代わりに被検物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合、ＦｔｓＷをコードする遺伝子の発現またはＦｔｓＷの産生に影響を与えないコントロール物質を添加する場合等がある。
上記（２−２）に記載のスクリーニング方法で用いられるＦｔｓＷをコードする遺伝子の発現量の測定方法としては、特に制限されないが、例えば、該細胞から調製したＲＮＡまたはＲＮＡから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いる、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等のほか、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲを利用する方法、前記ＲＮＡ鎖を直接測定する方法等の迅速な測定が可能な方法が挙げられる。
前記のように検出・定量したＦｔｓＷをコードする遺伝子の発現レベルに基づき、ＦｔｓＷをコードする遺伝子の発現抑制物質を選択することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞におけるＦｔｓＷをコードする遺伝子の発現が、前記被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して、７０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは１０％以下であれば、前記被験物質は、発現抑制物質として選択することができる。
上記（２−３）に記載のスクリーニング方法で用いられるＦｔｓＷの発現量の測定方法としては、特に制限されないが、例えば、ＦｔｓＷに特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法が挙げられる。前記免疫学的測定方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ等が挙げられる。前記抗体は、前記ＦｔｓＷを用いて従来公知の方法で作製でき、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
（Ｄ）ＦｔｓＱ遺伝子またはタンパク質の発現を抑制する抗菌剤のスクリーニング方法
具体的には、
（３−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子またはＦｔｓＱの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
具体的には、
（３−１）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子またはＦｔｓＱの発現を抑制する物質を探索する工程を含む、抗菌剤のスクリーニング方法
を意味する。
本発明者らは、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱが生存必須タンパク質であることを見出した。該スクリーニング方法によって、黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子またはＦｔｓＱの発現を抑制することにより抗菌活性を示す抗菌剤をスクリーニングすることができる。
より具体的には、以下の方法が挙げられる。
（３−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−２）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
（３−３）被検物質と黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
被検物質を接触させた細胞または該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量を測定する工程、および
該測定量が、被検物質を接触させない対照細胞もしくは該細胞画分の該ＦｔｓＱの発現量と比較して、少ない被検物質を選択する工程を含む、（３−１）記載のスクリーニング方法。
詳細は、スクリーニング方法（Ｃ）と同じである。
本発明のスクリーニング方法（Ａ）〜（Ｄ）により得られた被検物質は、例えば、細菌に、該被検物質を投与し、細胞数を指標として細菌の増殖抑制生活性を評価する方法等により行なわれうる。
本発明のスクリーニング方法（Ａ）〜（Ｄ）により得られた抗菌剤は、広いスペクトル、強い抗菌活性を発揮することが期待される。
抗菌剤中における化合物の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物または高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチドまたはその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇであることが望ましい。
上記の医薬組成物は、前記化合物を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。
上記の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。
また、上記の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物または高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチドまたはその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
また、本発明には、スタロバシンを用いて、ＦｔｓＷと結合するタンパク質を探索する方法も含まれる。
（Ｅ）ＦｔｓＷと結合するタンパク質を探索する方法
具体的には、
（４−１）被検物質の存在下で、
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、ＦｔｓＷ結合タンパク質のスクリーニング方法
を意味する。
（Ｅ）ＦｔｓＷと結合するタンパク質を探索する方法
具体的には、
（４−１）被検物質の存在下で、
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、ＦｔｓＷ結合タンパク質のスクリーニング方法
を意味する。
本発明者らの研究により、スタロバシンを細菌に投与すると、ＦｔｓＷとスタロバシンが複合体を形成することが明らかになった。よって、上記スクリーニング方法によって、スタロバシンとＦｔｓＷの結合を検出することによって、該複合体形成を阻害する細菌由来のタンパク質をスクリーニングすることができる。該方法によって得られたタンパク質は、ＦｔｓＷへの結合を介して細菌内で機能を果たすタンパク質を選択することができる。したがって、新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングに利用することができる。
「ＦｔｓＷの部分ペプチド」は、スクリーニング方法（Ａ）と同じである。
「被検物質」は、細菌由来のタンパク質が挙げられる。例えば、大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌等のタンパク質が挙げられる。
「スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程」は、ＦｔｓＷの本来の機能を妨げない溶液中において、被検物質とＦｔｓＷを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。
「ＦｔｓＷの本来の機能を妨げない溶液」および「反応条件」は、スクリーニング方法（Ａ）と同じである。
スタロバシンと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドの「結合の検出」は、例えば、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを保持した担体への被検物質およびスタロバシンのバインディングアッセイ等により行なわれうる。
該スクリーニング方法で得られるタンパク質は、ＦｔｓＷへの結合を介して細菌内で機能を果たすタンパク質を選択することができる。したがって、スクリーニング方法（Ｂ）と同様に、ＦｔｓＷとの得られたタンパク質の複合体形成を阻害する抗菌剤のスクリーニング方法、という、新規作用機序の抗菌剤のスクリーニングに利用することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるＦｔｓＷもしくはその部分ペプチド、抗ＦｔｓＷ抗体、ＦｔｓＱもしくはその部分ペプチド、ＦｔｓＫもしくはその部分ペプチドまたはスタロバシン等は、本発明のスクリーニング方法を行なうためのキットとしても提供される。したがって、このようなスクリーニング用キットも本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング用キットとしては、例えば、以下が挙げられる。
（１−５）ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（１−８）抗ＦｔｓＷ抗体またはスタロバシンを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（２−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（３−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（１−５）ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（１−８）抗ＦｔｓＷ抗体またはスタロバシンを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（２−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＷを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
（３−４）黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱをコードする遺伝子を発現可能な細胞または黄色ブドウ球菌のＦｔｓＱを産生可能な細胞若しくは該細胞から調製した細胞画分を含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
本発明のスクリーニング用キットは、検出用試薬、緩衝液、標準物質、標準曲線等をさらに含有してもよい。
本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法を、簡便に、かつ迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができるという優れた効果を発揮する。
以下に本発明の実施例および参考例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１ スタロバシンの結合タンパク質（ＳＡ０９６２）の同定
黄色ブドウ球菌ＳＡ１８８８欠失株の作製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ１８８８の上流配列および下流配列それぞれの増幅を行った。この際、上流配列の両端にはＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、下流配列の両端にはＳａｌＩ、ＰｓｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。上流配列増幅断片およびｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで制限酵素切断し、ライゲーション、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天培地〔組成：１．０重量％ トリプトン、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％塩化ナトリウム、１．５重量％寒天 （ｐＨ７．０±０．２）〕を使用したブルーホワイトセレクションの結果、白コロニーが見出され、ＰＣＲによりインサートの挿入を確認した。このコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことでｐＵＣ１９へＳＡ１８８８の上流配列が組み込まれたプラスミドを得た。続いて、このプラスミドと、下流配列増幅断片をＳａｌＩ、ＰｓｔＩで制限酵素切断し、ライゲーション、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。それをアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種し、生えてきたコロニーに対してＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことでｐＵＣ１９へＳＡ１８８８の上流配列および下流配列が連続した断片（ＳＡ１８８８欠失用配列）が乗ったプラスミドを得た。得られたプラスミドについては、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで制限酵素処理後、電気泳動し、ＳＡ１８８８欠失用配列の断片をゲルから切り出し、精製した。続いて、温度感受性プラスミドｐＣＬ５２．１をＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで制限酵素切断し、ＳＡ１８８８欠失用配列断片とのライゲーション、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。それをスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に播種し、生えてきたコロニーに対してＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ１８８８欠失用プラスミドを構築した。得られたプラスミドについては、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
このプラスミドをエレクトロポレーションによりＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。得られた形質転換体をテトラサイクリン含有ＴＳＡ〔組成：１．５重量％カゼインの膵液消化物、０．５重量％大豆のパパイン消化物、０．５重量％塩化ナトリウム、１．５重量％寒天（ｐＨ７．３±０．２）〕培地上にて４４℃で一晩培養した。ｐＣＬ５２．１は温度感受性の複製開始点を有するので、４４℃という高温条件下では、相同組換えが起こり、プラスミドがゲノム上へ組み込まれた株のみが良好に生育できる。培養の結果、相同組換えが起こったと考えられる大きなコロニーが出現した。これらのコロニーに対してＰＣＲを行い、ゲノム上へプラスミドが組み込まれている目的の株であることを確認した。
続いて、テトラサイクリン非含有培地にて３０℃で一晩培養し、ゲノム上でＳＡ１８８８の欠失用配列が相同組換えを起こし、テトラサイクリン感受性になった株を選別した。それらの株に対してコロニーＰＣＲでＳＡ１８８８欠失型の株を確認し、ＳＡ１８８８欠失株を獲得した。
黄色ブドウ球菌ＳＡ１８８８欠失株の作製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ１８８８の上流配列および下流配列それぞれの増幅を行った。この際、上流配列の両端にはＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、下流配列の両端にはＳａｌＩ、ＰｓｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。上流配列増幅断片およびｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで制限酵素切断し、ライゲーション、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天培地〔組成：１．０重量％ トリプトン、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％塩化ナトリウム、１．５重量％寒天 （ｐＨ７．０±０．２）〕を使用したブルーホワイトセレクションの結果、白コロニーが見出され、ＰＣＲによりインサートの挿入を確認した。このコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことでｐＵＣ１９へＳＡ１８８８の上流配列が組み込まれたプラスミドを得た。続いて、このプラスミドと、下流配列増幅断片をＳａｌＩ、ＰｓｔＩで制限酵素切断し、ライゲーション、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。それをアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種し、生えてきたコロニーに対してＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことでｐＵＣ１９へＳＡ１８８８の上流配列および下流配列が連続した断片（ＳＡ１８８８欠失用配列）が乗ったプラスミドを得た。得られたプラスミドについては、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで制限酵素処理後、電気泳動し、ＳＡ１８８８欠失用配列の断片をゲルから切り出し、精製した。続いて、温度感受性プラスミドｐＣＬ５２．１をＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで制限酵素切断し、ＳＡ１８８８欠失用配列断片とのライゲーション、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行った。それをスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に播種し、生えてきたコロニーに対してＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ１８８８欠失用プラスミドを構築した。得られたプラスミドについては、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
このプラスミドをエレクトロポレーションによりＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。得られた形質転換体をテトラサイクリン含有ＴＳＡ〔組成：１．５重量％カゼインの膵液消化物、０．５重量％大豆のパパイン消化物、０．５重量％塩化ナトリウム、１．５重量％寒天（ｐＨ７．３±０．２）〕培地上にて４４℃で一晩培養した。ｐＣＬ５２．１は温度感受性の複製開始点を有するので、４４℃という高温条件下では、相同組換えが起こり、プラスミドがゲノム上へ組み込まれた株のみが良好に生育できる。培養の結果、相同組換えが起こったと考えられる大きなコロニーが出現した。これらのコロニーに対してＰＣＲを行い、ゲノム上へプラスミドが組み込まれている目的の株であることを確認した。
続いて、テトラサイクリン非含有培地にて３０℃で一晩培養し、ゲノム上でＳＡ１８８８の欠失用配列が相同組換えを起こし、テトラサイクリン感受性になった株を選別した。それらの株に対してコロニーＰＣＲでＳＡ１８８８欠失型の株を確認し、ＳＡ１８８８欠失株を獲得した。
黄色ブドウ球菌ＳＡ１８８８欠失株の培養
ＳＡ１８８８遺伝子を欠失した黄色ブドウ球菌をＬＢ液体培地（０．５％酵母エキス、１％トリプトン、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２−７．５）５００ｍＬで一晩振とう培養した後、その培養液を３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地１５Ｌに加え、３７℃でジャーファーメンターによる培養を行った。培地の吸光度（６２５ｎｍ）が１．０に到達した時点で培養を終了し、４℃、１０，０００ｘｇ、１５分の遠心で集菌した。次に菌体の洗浄操作として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８による懸濁と４℃、１０，０００ｘｇ、１５分の遠心を、交互に３回繰り返した。
ＳＡ１８８８遺伝子を欠失した黄色ブドウ球菌をＬＢ液体培地（０．５％酵母エキス、１％トリプトン、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２−７．５）５００ｍＬで一晩振とう培養した後、その培養液を３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地１５Ｌに加え、３７℃でジャーファーメンターによる培養を行った。培地の吸光度（６２５ｎｍ）が１．０に到達した時点で培養を終了し、４℃、１０，０００ｘｇ、１５分の遠心で集菌した。次に菌体の洗浄操作として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８による懸濁と４℃、１０，０００ｘｇ、１５分の遠心を、交互に３回繰り返した。
膜画分の調製
洗浄菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８で再懸濁した後、終濃度１０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンを加え、３０℃、３０分攪拌しながらインキュベートした。次に、その懸濁液を細胞破砕装置にセットし８０００ｐｓｉで破砕した。破砕液を４℃、２０，０００ｘｇ、１５分で遠心し、その上清を４℃、１００，０００ｘｇ、３５分の条件で超遠心した。得られた沈殿を膜画分として回収した。
洗浄菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８で再懸濁した後、終濃度１０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンを加え、３０℃、３０分攪拌しながらインキュベートした。次に、その懸濁液を細胞破砕装置にセットし８０００ｐｓｉで破砕した。破砕液を４℃、２０，０００ｘｇ、１５分で遠心し、その上清を４℃、１００，０００ｘｇ、３５分の条件で超遠心した。得られた沈殿を膜画分として回収した。
膜画分の可溶化
膜画分を、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティックス、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ）を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（バイオラッド）でタンパク定量した。次に、１ｍｇ／ｍＬタンパク濃度、１％ ＤＤＭ（ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、４℃、１時間攪拌での可溶化操作後、４℃、１００，０００ｘｇ、３０分の超遠心で可溶化上清を回収した。
膜画分を、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティックス、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ）を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（バイオラッド）でタンパク定量した。次に、１ｍｇ／ｍＬタンパク濃度、１％ ＤＤＭ（ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、４℃、１時間攪拌での可溶化操作後、４℃、１００，０００ｘｇ、３０分の超遠心で可溶化上清を回収した。
スタロバシン結合タンパク質の精製
以下、実験操作は４℃で行うと共に、ビーズと上清の分画は、２０００ｘｇ、３０秒の遠心で行った。可溶化上清とモノメリックアビジンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を３０分間転倒混和後、上清を回収した。次に、上清に終濃度４００ｎｇ／ｍＬビオチン化スタロバシンとモノメリックアビジンビーズを加え、１２時間転倒混和した。Ｍｏｃｋ条件には、ビオチン化スタロバシンの代わりに、ビオチンとスペーサーアームからなる化合物を使用した。また、スタロバシンによる競合阻害実験では、ビオチン化スタロバシンに対して約５００倍量のスタロバシンを共存させた。ビーズ懸濁液から上清を除去した後、ビーズを０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳで洗浄した。続いて、ビーズと５ｍＭビオチン、０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳを３０分間転倒混和し、上清を溶出画分として回収した。
なお、本実施例において「スタロバシン」は以下の構造式で示される化合物（スタロバシンＩ）を意味する。
以下、実験操作は４℃で行うと共に、ビーズと上清の分画は、２０００ｘｇ、３０秒の遠心で行った。可溶化上清とモノメリックアビジンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を３０分間転倒混和後、上清を回収した。次に、上清に終濃度４００ｎｇ／ｍＬビオチン化スタロバシンとモノメリックアビジンビーズを加え、１２時間転倒混和した。Ｍｏｃｋ条件には、ビオチン化スタロバシンの代わりに、ビオチンとスペーサーアームからなる化合物を使用した。また、スタロバシンによる競合阻害実験では、ビオチン化スタロバシンに対して約５００倍量のスタロバシンを共存させた。ビーズ懸濁液から上清を除去した後、ビーズを０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳで洗浄した。続いて、ビーズと５ｍＭビオチン、０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳを３０分間転倒混和し、上清を溶出画分として回収した。
なお、本実施例において「スタロバシン」は以下の構造式で示される化合物（スタロバシンＩ）を意味する。
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、汎用されているレムリー法に従った。ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ ＢＰＢ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８）と溶出画分を１：１の割合で混合し、３７℃、３０分インキュベートした。続いて、ポリアクリルアミド１０−２０％グラジエント分離ゲルを利用して電気泳動した。
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、汎用されているレムリー法に従った。ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ ＢＰＢ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８）と溶出画分を１：１の割合で混合し、３７℃、３０分インキュベートした。続いて、ポリアクリルアミド１０−２０％グラジエント分離ゲルを利用して電気泳動した。
タンパク質の検出
電気泳動後のゲルを、固定化液（５０％メタノール、７％酢酸）に浸して３０分間振とうした後、ＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色液（インビトロジェン）に浸して１時間振とうした。最後に、脱色液（１０％メタノール、７％酢酸）に浸し１時間振とうした。タンパク質の検出には、蛍光スキャナー（ＧＥヘルスケア）を利用し、４５７ｎｍで励起し５１０ｎｍの蛍光を検出した。結果を、図１に示す。非特異的に結合するタンパク質も検出されたが、Ｍｏｃｋまたはスタロバシン競合阻害条件では検出されず、ビオチン化スタロバシン条件特異的に、分子量約３５０００のタンパク質を検出した。
電気泳動後のゲルを、固定化液（５０％メタノール、７％酢酸）に浸して３０分間振とうした後、ＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色液（インビトロジェン）に浸して１時間振とうした。最後に、脱色液（１０％メタノール、７％酢酸）に浸し１時間振とうした。タンパク質の検出には、蛍光スキャナー（ＧＥヘルスケア）を利用し、４５７ｎｍで励起し５１０ｎｍの蛍光を検出した。結果を、図１に示す。非特異的に結合するタンパク質も検出されたが、Ｍｏｃｋまたはスタロバシン競合阻害条件では検出されず、ビオチン化スタロバシン条件特異的に、分子量約３５０００のタンパク質を検出した。
タンパク質の同定
ゲル内消化は、Ｍｏｒｉｔａらの方法（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００６， ６， ５８８０-５８９０）に従った。電気泳動ゲルから目的とするタンパク質バンドを切り出し、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼでゲル内消化した。回収された消化ペプチドは、０．１％ギ酸に溶解し、高速液体クロマトグラフ質量分析装置（ブルカーダルトニクス）で質量分析した。ペプチドは、溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸、８０％アセト二トリルを用いて、５％Ｂ（０−５分）、５−６０％Ｂ（５−３５分）、６０−１００％Ｂ（３５−３５．１分）、１００％Ｂ（３５．１−４５分）、１００−５％Ｂ（４５−４５．１分）のグラジエント溶出法で分離した。続いて、得られたマススペクトルからタンパク質同定ソフトウエアＭａｓｃｏｔ（マトリックスサイエンス）を用いてタンパク質を同定した。検索条件は、データベース：ＮＣＢＩｎｒ、種：ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、酵素：トリプシン、許容される未切断部位数：１箇所とした。Ｍａｓｃｏｔ検索結果を表１に、ＭＳＭＳマススペクトルを図２に示す。その結果、ＳＡ０９６２（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４２３１）をスタロバシン結合候補分子として同定した。
ゲル内消化は、Ｍｏｒｉｔａらの方法（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００６， ６， ５８８０-５８９０）に従った。電気泳動ゲルから目的とするタンパク質バンドを切り出し、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼでゲル内消化した。回収された消化ペプチドは、０．１％ギ酸に溶解し、高速液体クロマトグラフ質量分析装置（ブルカーダルトニクス）で質量分析した。ペプチドは、溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸、８０％アセト二トリルを用いて、５％Ｂ（０−５分）、５−６０％Ｂ（５−３５分）、６０−１００％Ｂ（３５−３５．１分）、１００％Ｂ（３５．１−４５分）、１００−５％Ｂ（４５−４５．１分）のグラジエント溶出法で分離した。続いて、得られたマススペクトルからタンパク質同定ソフトウエアＭａｓｃｏｔ（マトリックスサイエンス）を用いてタンパク質を同定した。検索条件は、データベース：ＮＣＢＩｎｒ、種：ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、酵素：トリプシン、許容される未切断部位数：１箇所とした。Ｍａｓｃｏｔ検索結果を表１に、ＭＳＭＳマススペクトルを図２に示す。その結果、ＳＡ０９６２（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ_３７４２３１）をスタロバシン結合候補分子として同定した。
ＳＡ０９６２のクローニング
ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＳ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５株の塩基配列をもとに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＳＡ０９６２遺伝子の全長を増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーＮＦＲ０９６２−Ｓ（配列番号２）と０９６２−ＴＣＳ−ＡＳ（配列番号３）を作成した。これらのプライマーＤＮＡを用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０ ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＮＦＲ０９６２−Ｓプライマーと０９６２−ＴＣＳ−ＡＳプライマー各５０ｐｍｏｌを用いて１回目のＰＣＲを行ない、その後、アガロース電気泳動による分離と精製を行い、１，２２７ｂｐのＤＮＡ断片を含む領域を切り出した。上記のＰＣＲ反応は、９４℃、１５秒、６０℃、３０秒、６８℃、３０秒を１サイクルとする、計３０サイクルで行った。
ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＳ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５株の塩基配列をもとに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＳＡ０９６２遺伝子の全長を増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーＮＦＲ０９６２−Ｓ（配列番号２）と０９６２−ＴＣＳ−ＡＳ（配列番号３）を作成した。これらのプライマーＤＮＡを用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０ ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＮＦＲ０９６２−Ｓプライマーと０９６２−ＴＣＳ−ＡＳプライマー各５０ｐｍｏｌを用いて１回目のＰＣＲを行ない、その後、アガロース電気泳動による分離と精製を行い、１，２２７ｂｐのＤＮＡ断片を含む領域を切り出した。上記のＰＣＲ反応は、９４℃、１５秒、６０℃、３０秒、６８℃、３０秒を１サイクルとする、計３０サイクルで行った。
無細胞合成用ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグのベクター構築
ＰＣＲ法にて増幅した大腸菌無細胞蛋白質合成用ベクターｐＩＶＥＸ３．１の（１）ＭＣＳ上流にあるＴ７プロモータとＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む遺伝子断片ＲＴＳ−Ｎｆｒ、（２）ＭＣＳ下流のスロンビン認識配列（ＴＣＳ）、６ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ配列、Ｔ７ターミネータを含む遺伝子断片ＲＴＳ−ＴＣＳ−Ｃｆｒ−Ｈｉｓ 各５ｎｇと上記「ＳＡ０９６２のクローニング」で取得したＳＡ０９６２遺伝子４０ｎｇを用いて、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法にて無細胞合成用断片を調製した。ＰＣＲには、ＳＡ０９６２遺伝子を含む無細胞合成用断片全長を増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーＲＴＳ−Ｎｆｒ−Ｓ（配列番号４）とＲＴＳ−Ｃｆｒ−ＡＳ（配列番号５）を設計して用いた。上記のＰＣＲ反応は、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、６８℃、２分を１サイクルとする、計３５サイクルの条件で行った。この無細胞合成用の遺伝子断片をアガロース電気泳動による分離と精製を行い、１，５８２ ｂｐのＤＮＡ断片を含む領域を切り出した。ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにＴＡクローニングで導入したが、蛋白質翻訳領域の上流に１塩基変異が認められたため、変異導入ＰＣＲ法により変異を修正し、アンピシリン耐性遺伝子を有する組み換えプラスミドＮｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯを得た。
ＰＣＲ法にて増幅した大腸菌無細胞蛋白質合成用ベクターｐＩＶＥＸ３．１の（１）ＭＣＳ上流にあるＴ７プロモータとＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む遺伝子断片ＲＴＳ−Ｎｆｒ、（２）ＭＣＳ下流のスロンビン認識配列（ＴＣＳ）、６ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ配列、Ｔ７ターミネータを含む遺伝子断片ＲＴＳ−ＴＣＳ−Ｃｆｒ−Ｈｉｓ 各５ｎｇと上記「ＳＡ０９６２のクローニング」で取得したＳＡ０９６２遺伝子４０ｎｇを用いて、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法にて無細胞合成用断片を調製した。ＰＣＲには、ＳＡ０９６２遺伝子を含む無細胞合成用断片全長を増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーＲＴＳ−Ｎｆｒ−Ｓ（配列番号４）とＲＴＳ−Ｃｆｒ−ＡＳ（配列番号５）を設計して用いた。上記のＰＣＲ反応は、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、６８℃、２分を１サイクルとする、計３５サイクルの条件で行った。この無細胞合成用の遺伝子断片をアガロース電気泳動による分離と精製を行い、１，５８２ ｂｐのＤＮＡ断片を含む領域を切り出した。ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにＴＡクローニングで導入したが、蛋白質翻訳領域の上流に１塩基変異が認められたため、変異導入ＰＣＲ法により変異を修正し、アンピシリン耐性遺伝子を有する組み換えプラスミドＮｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯを得た。
ウエスタンブロッティング
上記「ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動」の記述に従い電気泳動後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。次に、ウエスタンブロッティングは、ｏｈｔａらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７８８（２００９） １０９９-１１０７）を一部改変し実施した。ブロッキングを、５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで行った後、Ｈｉｓタグ融合タンパク質の検出には、１次抗体にラビット抗Ｈｉｓタグポリクローナル抗体（サンタクルズ）、２次抗体に西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア）、検出試薬に化学発光試薬ＥＣＬｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を用いた。化学発光量の測定には、ＬＡＳ３０００（富士フィルム）を使用した。
上記「ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動」の記述に従い電気泳動後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。次に、ウエスタンブロッティングは、ｏｈｔａらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７８８（２００９） １０９９-１１０７）を一部改変し実施した。ブロッキングを、５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで行った後、Ｈｉｓタグ融合タンパク質の検出には、１次抗体にラビット抗Ｈｉｓタグポリクローナル抗体（サンタクルズ）、２次抗体に西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア）、検出試薬に化学発光試薬ＥＣＬｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を用いた。化学発光量の測定には、ＬＡＳ３０００（富士フィルム）を使用した。
ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグの無細胞合成
無細胞合成は，大腸菌無細胞蛋白質合成キット ＲＴＳ１００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ ｋｉｔ （５ Ｐｒｉｍｅ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳系のバッチ法にて行った。翻訳反応液には、キット附属の大腸菌濃縮細胞抽出液、反応ミックス、２０アミノ酸のほかに、無細胞合成用プラスミドベクター、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・アプライドサイエンス）、ＭｅｍｂｒａｎｅＭａｘ（インビトロジェン）を添加し、専用インキュベータ（ロシュ・ダイアグノスティクス）中２５μＬスケールで３０℃、１６時間、２００ｒｐｍで振とうして反応させた。標的遺伝子の発現は抗Ｈｉｓ×５抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。以下のアッセイには４℃で１５，０００ｘｇ、 ５分遠心した翻訳反応上清を用いた。
無細胞合成は，大腸菌無細胞蛋白質合成キット ＲＴＳ１００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ ｋｉｔ （５ Ｐｒｉｍｅ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳系のバッチ法にて行った。翻訳反応液には、キット附属の大腸菌濃縮細胞抽出液、反応ミックス、２０アミノ酸のほかに、無細胞合成用プラスミドベクター、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・アプライドサイエンス）、ＭｅｍｂｒａｎｅＭａｘ（インビトロジェン）を添加し、専用インキュベータ（ロシュ・ダイアグノスティクス）中２５μＬスケールで３０℃、１６時間、２００ｒｐｍで振とうして反応させた。標的遺伝子の発現は抗Ｈｉｓ×５抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。以下のアッセイには４℃で１５，０００ｘｇ、 ５分遠心した翻訳反応上清を用いた。
無細胞合成ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグのスタロバシン結合評価
無細胞合成ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグとビオチン化スタロバシンを用いて、上記「スタロバシン結合タンパク質の精製」にて記述した方法に従い、スタロバシン結合画分を調製した。結合したＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグは、上記「ウエスタンブロティング」にて記述した方法で検出した。結果を図３に示す。Ｍｏｃｋ条件に比べ、ビオチン化スタロバシン条件では、有意にＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグが検出された。またその結合は、スタロバシンで阻害されたことから、ＳＡ０９６２はスタロバシンと特異的に結合することを確認した。
無細胞合成ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグとビオチン化スタロバシンを用いて、上記「スタロバシン結合タンパク質の精製」にて記述した方法に従い、スタロバシン結合画分を調製した。結合したＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグは、上記「ウエスタンブロティング」にて記述した方法で検出した。結果を図３に示す。Ｍｏｃｋ条件に比べ、ビオチン化スタロバシン条件では、有意にＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグが検出された。またその結合は、スタロバシンで阻害されたことから、ＳＡ０９６２はスタロバシンと特異的に結合することを確認した。
ＳＡ０９６２発現誘導プラスミドの構築
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ０９６２ ＯＲＦの完全長のＰＣＲ増幅を行った。この際、両端にはＳｍｉＩ、ＮｏｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。このＰＣＲ断片およびｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つベクターｐＳＲ１０００を、それぞれ制限酵素ＳｍｉＩ、ＮｏｔＩで切断し、ライゲーションを行った。精製後、エレクトロポレーションにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。クロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地上に生えてきたコロニーについてＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをクロラムフェニコール含有ＴＳＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ０９６２（配列番号４８）発現誘導用プラスミドを得た。得られたプラスミドについて、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ０９６２ ＯＲＦの完全長のＰＣＲ増幅を行った。この際、両端にはＳｍｉＩ、ＮｏｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。このＰＣＲ断片およびｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つベクターｐＳＲ１０００を、それぞれ制限酵素ＳｍｉＩ、ＮｏｔＩで切断し、ライゲーションを行った。精製後、エレクトロポレーションにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。クロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地上に生えてきたコロニーについてＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをクロラムフェニコール含有ＴＳＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ０９６２（配列番号４８）発現誘導用プラスミドを得た。得られたプラスミドについて、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
黄色ブドウ球菌の形態変化観察
野生型のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株、ＳＡ１８８８欠失株、ＳＡ０９６２の温度感受性株ＴＳ３０２１をＨＩＡ（Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ａｇａｒ）〔組成：１．０重量％ ５００ｇのウシ心臓の浸出液、１．０重量％トリプトース、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天（ｐＨ７．４±０．２）〕スラント培地へ植菌し、ＲＮ４２２０株、ＳＡ１８８８欠失株は３７℃で、ＴＳ３０２１は３０℃で４８時間培養した。１エーゼ分の菌を１０ｍＬの滅菌水で懸濁後、表面が乾燥したスクロース含有ＣＧＰＹ〔０．５重量％グルコース、１重量％バクトペプトン、０．０１重量％酵母エキス、０．６重量％リン酸水素ナトリウム、０．３重量％塩化ナトリウム、０．３重量％リン酸二水素カリウム、０．０１重量％塩化マグネシウム・六水和物、０．２重量％塩化アンモニウム、０．０１５重量％硫酸ナトリウム、０．１２重量％スクロース、０．２重量％寒天（ｐＨ７．０）〕平板に全面行き渡るように流し、余分な菌液は除いた。３７℃のインキュベータ内で１５分間表面を乾燥させ、スタロバシン（１０，０００μｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ溶液２０ｍＬを、抗生物質検定用ペーパーディスク６ｍｍ薄手にしみこませ、３７℃のインキュベータで３０分乾燥させたもの）を置き、３７℃で培養した。２４時間後、スタロバシン影響下にあるろ紙・阻止円周辺およびスタロバシンの影響を受けていないプレート辺縁の菌について、寒天フィルムで転写してスライドガラスに載せ、顕微鏡で菌の形態を観察した。その結果、ＲＮ４２２０およびＳＡ１８８８欠失株は、阻止円付近のスタロバシン影響下では細胞が肥大し、プレート周辺のスタロバシンの影響を受けない部分では無変化であった。一方、ＴＳ３０２１はスタロバシン非存在下でも、細胞が肥大し、スタロバシン作用時と同様の形態を示した（図４）。
野生型のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株、ＳＡ１８８８欠失株、ＳＡ０９６２の温度感受性株ＴＳ３０２１をＨＩＡ（Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ａｇａｒ）〔組成：１．０重量％ ５００ｇのウシ心臓の浸出液、１．０重量％トリプトース、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天（ｐＨ７．４±０．２）〕スラント培地へ植菌し、ＲＮ４２２０株、ＳＡ１８８８欠失株は３７℃で、ＴＳ３０２１は３０℃で４８時間培養した。１エーゼ分の菌を１０ｍＬの滅菌水で懸濁後、表面が乾燥したスクロース含有ＣＧＰＹ〔０．５重量％グルコース、１重量％バクトペプトン、０．０１重量％酵母エキス、０．６重量％リン酸水素ナトリウム、０．３重量％塩化ナトリウム、０．３重量％リン酸二水素カリウム、０．０１重量％塩化マグネシウム・六水和物、０．２重量％塩化アンモニウム、０．０１５重量％硫酸ナトリウム、０．１２重量％スクロース、０．２重量％寒天（ｐＨ７．０）〕平板に全面行き渡るように流し、余分な菌液は除いた。３７℃のインキュベータ内で１５分間表面を乾燥させ、スタロバシン（１０，０００μｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ溶液２０ｍＬを、抗生物質検定用ペーパーディスク６ｍｍ薄手にしみこませ、３７℃のインキュベータで３０分乾燥させたもの）を置き、３７℃で培養した。２４時間後、スタロバシン影響下にあるろ紙・阻止円周辺およびスタロバシンの影響を受けていないプレート辺縁の菌について、寒天フィルムで転写してスライドガラスに載せ、顕微鏡で菌の形態を観察した。その結果、ＲＮ４２２０およびＳＡ１８８８欠失株は、阻止円付近のスタロバシン影響下では細胞が肥大し、プレート周辺のスタロバシンの影響を受けない部分では無変化であった。一方、ＴＳ３０２１はスタロバシン非存在下でも、細胞が肥大し、スタロバシン作用時と同様の形態を示した（図４）。
続いて、エレクトロポレーションによりＴＳ３０２１へＳＡ０９６２の発現誘導プラスミドを導入し、クロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地上に生えてきたコロニーについてＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。
ＲＮ４２２０株をＨＩＡプレートへ植菌し、３７℃で、ＳＡ０９６２発現誘導プラスミド導入ＴＳ３０２１株をクロラムフェニコール含有ＨＩＡプレートへ植菌し、３０℃で、それぞれ２４時間培養した。通常のＣＧＰＹ平板培地と０．５％キシロース含有ＣＧＰＹ平板培地を用意し、１エーゼ分の菌を１０ｍＬの滅菌水で懸濁後、表面が乾燥したＣＧＰＹ平板培地およびキシロース含有ＣＧＰＹ平板培地それぞれに、全面行き渡るように流し、余分な菌液は除いた。３７℃のインキュベータ内で２４時間培養後、寒天フィルムでプレート上の細胞を転写してスライドガラスに載せ、顕微鏡で菌の形態を観察した。
ＲＮ４２２０株をＨＩＡプレートへ植菌し、３７℃で、ＳＡ０９６２発現誘導プラスミド導入ＴＳ３０２１株をクロラムフェニコール含有ＨＩＡプレートへ植菌し、３０℃で、それぞれ２４時間培養した。通常のＣＧＰＹ平板培地と０．５％キシロース含有ＣＧＰＹ平板培地を用意し、１エーゼ分の菌を１０ｍＬの滅菌水で懸濁後、表面が乾燥したＣＧＰＹ平板培地およびキシロース含有ＣＧＰＹ平板培地それぞれに、全面行き渡るように流し、余分な菌液は除いた。３７℃のインキュベータ内で２４時間培養後、寒天フィルムでプレート上の細胞を転写してスライドガラスに載せ、顕微鏡で菌の形態を観察した。
その結果、ＲＮ４２２０株の細胞形態はキシロースの有無に関わらず無変化であった。一方、ＳＡ０９６２発現誘導プラスミド導入ＴＳ３０２１株は、キシロース非含有培地では細胞が肥大し、スタロバシン作用時と同様の形態を呈したが、キシロース含有培地では細胞の肥大が見られず、野性株であるＲＮ４２２０とほぼ同様の形態に戻った（図５）。菌体に温度感受性をもたらすＳＡ０９６２遺伝子の変異は、野生株に対するスタロバシン作用と同じ表現形になった。また、ＳＡ０９６２温度感受性株に正常なＳＡ０９６２を相補することにより、正常な表現系に戻った。このことから、スタロバシンの作用点は、ＳＡ０９６２である可能性が示された。
黄色ブドウ球菌のスタロバシン感受性解析
野生型のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株、ＳＡ０９６２の温度感受性株ＴＳ３０２１をＴＳＡ培地に、ＴＳ３０２１へベクターｐＳＲ１０００を導入したｍｏｃｋ株、ＴＳ３０２１へＳＡ０９６２発現誘導プラスミドを導入した株をクロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地に塗布し、ＲＮ４２２０は３７℃で、それ以外の３株は３０℃で、それぞれ一晩培養し、ＣＡＭＨＢ（陽イオン調整Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ）〔組成：２２．５ｍｇ／ＬＣａ２＋、１１．２５ｍｇ／Ｌ Ｍｇ２＋、０．２重量％牛肉エキス、１．７５重量％カゼインの酸消化物、０．１５重量％可溶性澱粉（ｐＨ７．３±０．１）〕で５×１０６ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈した。一方、スタロバシンの２倍希釈系列を９６穴プレート上で作製した。９６穴プレートの各穴に０．５％キシロース含有ＣＡＭＨＢを８０μＬ、スタロバシンの２倍希釈液を１０μＬ、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの菌液を１０μＬ加えてよく混ぜ、ＴＳ３０２１の生育が可能かつ高温による影響を受けていると予測される３７℃で約１７時間インキュベートした。
野生型のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株、ＳＡ０９６２の温度感受性株ＴＳ３０２１をＴＳＡ培地に、ＴＳ３０２１へベクターｐＳＲ１０００を導入したｍｏｃｋ株、ＴＳ３０２１へＳＡ０９６２発現誘導プラスミドを導入した株をクロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地に塗布し、ＲＮ４２２０は３７℃で、それ以外の３株は３０℃で、それぞれ一晩培養し、ＣＡＭＨＢ（陽イオン調整Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ）〔組成：２２．５ｍｇ／ＬＣａ２＋、１１．２５ｍｇ／Ｌ Ｍｇ２＋、０．２重量％牛肉エキス、１．７５重量％カゼインの酸消化物、０．１５重量％可溶性澱粉（ｐＨ７．３±０．１）〕で５×１０６ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈した。一方、スタロバシンの２倍希釈系列を９６穴プレート上で作製した。９６穴プレートの各穴に０．５％キシロース含有ＣＡＭＨＢを８０μＬ、スタロバシンの２倍希釈液を１０μＬ、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの菌液を１０μＬ加えてよく混ぜ、ＴＳ３０２１の生育が可能かつ高温による影響を受けていると予測される３７℃で約１７時間インキュベートした。
その結果、ＴＳ３０２１株およびｍｏｃｋ株ではスタロバシン感受性が顕著に増大し、野性株であるＲＮ４２２０株とのＭＩＣ値の差はそれぞれ８倍、１６倍であった。一方、 ＴＳ３０２１へＳＡ０９６２発現誘導プラスミドを導入した株のＭＩＣはＲＮ４２２０と同じ値であった（図６）。つまりＳＡ０９６２を相補することで、ＳＡ０９６２のＴＳ株のスタロバシン感受性は、野生株同程度まで戻った。このことは、ＳＡ０９６２がスタロバシンの標的である可能性を強く示唆した。
実施例２ 抗ＳＡ０９６３抗体の作製
免疫原の調製と免疫
ＳＡ０９６２の部分ペプチド（配列番号４８の４１‐６５：１／２ループ）のＣ末端にシステインを導入したペプチドを合成した（配列番号６）。合成したペプチド１０ｍｇを５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１０ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ‐Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものとを混合し、室温にて４時間、さらに、４℃で一晩反応させた。上記の混合液を蒸留水に対して透析後に、凍結乾燥し、ＳＡ０９６２部分ペプチド‐ＫＬＨ複合体を得た。これを免疫原に用いた。調製したＳＡ０９６２ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ａ／Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ雌マウス５匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後、４２日後、６３日後にＳＡ０９６２部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。その後、抗体価の上昇を認めたマウスにＳＡ０９６２部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
免疫原の調製と免疫
ＳＡ０９６２の部分ペプチド（配列番号４８の４１‐６５：１／２ループ）のＣ末端にシステインを導入したペプチドを合成した（配列番号６）。合成したペプチド１０ｍｇを５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１０ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ‐Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものとを混合し、室温にて４時間、さらに、４℃で一晩反応させた。上記の混合液を蒸留水に対して透析後に、凍結乾燥し、ＳＡ０９６２部分ペプチド‐ＫＬＨ複合体を得た。これを免疫原に用いた。調製したＳＡ０９６２ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ａ／Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ雌マウス５匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後、４２日後、６３日後にＳＡ０９６２部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。その後、抗体価の上昇を認めたマウスにＳＡ０９６２部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
ＳＡ０９６２部分ペプチドのビオチン標識
合成したＳＡ０９６２部分ペプチド０．４ｍｇを０．４ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１６０μｇのＭａｌｅｉｍｉｄｅ‐ＰＥＯ２‐ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を８０μｌの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で２時間反応後に、逆相ＨＰＬＣにてビオチン標識されたＳＡ０９６２部分ペプチドを精製した。
合成したＳＡ０９６２部分ペプチド０．４ｍｇを０．４ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１６０μｇのＭａｌｅｉｍｉｄｅ‐ＰＥＯ２‐ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を８０μｌの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で２時間反応後に、逆相ＨＰＬＣにてビオチン標識されたＳＡ０９６２部分ペプチドを精製した。
ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ＳＡ０９６２抗体の選定
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清を加え、室温で２時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、０．０５ｎｇのビオチン標識ＳＡ０９６２部分ペプチドと２ｎｇのＥｕ‐ｌａｂｅｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を含む１５μｌのＤＥＬＦＩＡ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加して、時間分解蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）により測定した。スクリーニングの結果から、ＳＡ０９６２部分ペプチドと反応したハイブリドーマの中から、無細胞合成により調製したＳＡ０９６２蛋白質と結合するクローンを得た。
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清を加え、室温で２時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、０．０５ｎｇのビオチン標識ＳＡ０９６２部分ペプチドと２ｎｇのＥｕ‐ｌａｂｅｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を含む１５μｌのＤＥＬＦＩＡ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加して、時間分解蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）により測定した。スクリーニングの結果から、ＳＡ０９６２部分ペプチドと反応したハイブリドーマの中から、無細胞合成により調製したＳＡ０９６２蛋白質と結合するクローンを得た。
ＳＡ０９６２抗体によるＳＡ０９６２とスタロバシンの結合阻害試験
３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．１５μｇの抗Ｃ２タグ抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を１５μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのＳＡ０９６２−Ｃ２タグを加え、室温で２時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ビオチン標識スタロバシンとＳＡ０９６２抗体を含む緩衝液Ａ（０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含む緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ存在下でのＳＡ０９６２とスタロバシンの結合を１００％とし、抗体濃度１００μｇ／ｍｌで４０％以上の結合阻害活性を示した抗体は、１１Ｅ８、２３Ｃ７、１１Ｂ１１だった。その結果を図７に示す。
３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．１５μｇの抗Ｃ２タグ抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を１５μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのＳＡ０９６２−Ｃ２タグを加え、室温で２時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ビオチン標識スタロバシンとＳＡ０９６２抗体を含む緩衝液Ａ（０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含む緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ存在下でのＳＡ０９６２とスタロバシンの結合を１００％とし、抗体濃度１００μｇ／ｍｌで４０％以上の結合阻害活性を示した抗体は、１１Ｅ８、２３Ｃ７、１１Ｂ１１だった。その結果を図７に示す。
抗ＳＡ０９６２抗体のアミノ酸配列
抗ＳＡ０９６２抗体（１１Ｅ８、２３Ｃ７、１１Ｂ１１）について、常法を用いて可変領域の配列を決定した。
１１Ｅ８の重鎖（配列番号７）、軽鎖（配列番号８）を図８に示す。
２３Ｃ７の重鎖（配列番号９）、軽鎖（配列番号１０）を図９に示す。
１１Ｂ１１の重鎖（配列番号１１）、軽鎖（配列番号１２）を図１０に示す。
抗ＳＡ０９６２抗体（１１Ｅ８、２３Ｃ７、１１Ｂ１１）について、常法を用いて可変領域の配列を決定した。
１１Ｅ８の重鎖（配列番号７）、軽鎖（配列番号８）を図８に示す。
２３Ｃ７の重鎖（配列番号９）、軽鎖（配列番号１０）を図９に示す。
１１Ｂ１１の重鎖（配列番号１１）、軽鎖（配列番号１２）を図１０に示す。
実施例３ ＳＡ０９６２ペプチド実験
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法によってＳＡ０９６２のアミノ酸配列である配列番号４８の３４４−３５５（Ｃ末アミド体：９／１０ループの一部）（配列番号１３）を合成し、逆相ＨＰＬＣ精製後、凍結乾燥して目的物を得た。収量８．９ｍｇ（収率１０％）、ＥＳＩ−ＭＳ：実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１１８７．６（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝１１８７．７）。
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法によってＳＡ０９６２のアミノ酸配列である配列番号４８の３４４−３５５（Ｃ末アミド体：９／１０ループの一部）（配列番号１３）を合成し、逆相ＨＰＬＣ精製後、凍結乾燥して目的物を得た。収量８．９ｍｇ（収率１０％）、ＥＳＩ−ＭＳ：実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１１８７．６（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝１１８７．７）。
無細胞合成用ＳＡ０９６２−Ｃ２タグのベクター構築
コラーゲン２型ネオエピトープタグ（Ｃ２タグ）を付加したＳＡ０９６２遺伝子の構築を行った。まず、Ｎｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（登録商標）を鋳型にＰＣＲで線状化した。このＰＣＲには、フォワード側がＳＡ０９６２ＶＰ３（配列番号１４）、リバース側がＳＡ０９６２ＶＰ２（配列番号１５）のプライマーを用いた。ＰＣＲは９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。次に、ｐＥＴ１５ｂ−ｐ１５（ＨＸＢ２）−Ｃｏｌを鋳型にＣｏｌ２タグ領域をＰＣＲで増幅した。このＰＣＲには、フォワード側がＣｏｌ２ｉｆＦ２（配列番号１６）、リバース側がＣｏｌ２ｉｆＲ（配列番号１７）のプライマーを用いた。ＰＣＲは９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。線状化ベクターとインサート断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅにて融合し、ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｃ２−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯを得た。
コラーゲン２型ネオエピトープタグ（Ｃ２タグ）を付加したＳＡ０９６２遺伝子の構築を行った。まず、Ｎｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（登録商標）を鋳型にＰＣＲで線状化した。このＰＣＲには、フォワード側がＳＡ０９６２ＶＰ３（配列番号１４）、リバース側がＳＡ０９６２ＶＰ２（配列番号１５）のプライマーを用いた。ＰＣＲは９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。次に、ｐＥＴ１５ｂ−ｐ１５（ＨＸＢ２）−Ｃｏｌを鋳型にＣｏｌ２タグ領域をＰＣＲで増幅した。このＰＣＲには、フォワード側がＣｏｌ２ｉｆＦ２（配列番号１６）、リバース側がＣｏｌ２ｉｆＲ（配列番号１７）のプライマーを用いた。ＰＣＲは９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。線状化ベクターとインサート断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅにて融合し、ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｃ２−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯを得た。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグの無細胞合成
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ遺伝子を上記「ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグの無細胞合成」の記述に従い、無細胞合成した。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ遺伝子を上記「ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグの無細胞合成」の記述に従い、無細胞合成した。
結合阻害実験
ストレプトアビジンが固相化された９６穴プレートを使用し、ビオチン化スタロバシンとＳＡ０９６２の結合を評価した。以下に、１穴あたりの実験条件を示す。
まず、ビオチン化スタロバシンの固定化のために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ１００μＬとビオチン化スタロバシン２５ｐｍｏｌを加え、室温、１時間インキュベートし、ビオチン化スタロバシンを固定化した。未固定ビオチン化スタロバシンを除くため、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。２％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで室温、１時間ブロッキング後、ＴＢＳ１００μＬ、ＴＢＳで２５倍希釈した無細胞合成ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグ ５μＬ、スタロバシンもしくはＳＡ０９６２部分合成ペプチド５０μｇを加え、室温で１時間インキュベートした。０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳでプレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ融合抗Ｃ２タグ抗体０．２５μｇ、０．５％スキムミルク、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳを加え、室温で１時間インキュベートした。再度、ＴＢＳで洗浄後、３，３´，５，５´−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）基質 １００μＬを加え、遮光して室温でインキュベートした。１５分後、０．２ｍｏｌ／Ｌの硫酸１００μＬを加え、反応を終了させた。結合したＳＡ０９６２−Ｃ２タグ量は、６２５ｎｍの吸光度で定量した。結果を図１１に示す。
ストレプトアビジンが固相化された９６穴プレートを使用し、ビオチン化スタロバシンとＳＡ０９６２の結合を評価した。以下に、１穴あたりの実験条件を示す。
まず、ビオチン化スタロバシンの固定化のために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ１００μＬとビオチン化スタロバシン２５ｐｍｏｌを加え、室温、１時間インキュベートし、ビオチン化スタロバシンを固定化した。未固定ビオチン化スタロバシンを除くため、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。２％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで室温、１時間ブロッキング後、ＴＢＳ１００μＬ、ＴＢＳで２５倍希釈した無細胞合成ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグ ５μＬ、スタロバシンもしくはＳＡ０９６２部分合成ペプチド５０μｇを加え、室温で１時間インキュベートした。０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳでプレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ融合抗Ｃ２タグ抗体０．２５μｇ、０．５％スキムミルク、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳを加え、室温で１時間インキュベートした。再度、ＴＢＳで洗浄後、３，３´，５，５´−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）基質 １００μＬを加え、遮光して室温でインキュベートした。１５分後、０．２ｍｏｌ／Ｌの硫酸１００μＬを加え、反応を終了させた。結合したＳＡ０９６２−Ｃ２タグ量は、６２５ｎｍの吸光度で定量した。結果を図１１に示す。
スタロバシンとＳＡ０９６２の結合活性が１．４に対し、合成ペプチドを共存させると結合活性が１．２に低下したことから、合成ペプチド（配列番号１３）は，スタロバシンとＳＡ０９６２の結合を阻害することを確認した。この結果からスタロバシンは、ＳＡ０９６２の９／１０ループとその近傍に相互作用すると思われる。
同様に、１／２ループ、３／４ループ、５／６ループ、７／８ループについてもペプチドを合成し、結合阻害実験を行ったが、該ペプチドは結合阻害を示さなかった。
同様に、１／２ループ、３／４ループ、５／６ループ、７／８ループについてもペプチドを合成し、結合阻害実験を行ったが、該ペプチドは結合阻害を示さなかった。
実施例４ ＳＡ０９６２と複合体候補分子の検証
菌体内発現用ＳＡ０９６２−Ｃ２タグのベクター構築
ＳＡ０９６２のＣ末端側にＣ２タグが付加された配列を有するプラスミドＮｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＳＡ０９６２ ＯＲＦのＣ末端側にＣ２タグ配列が融合した断片を得た。この際、両端にＳｍｉＩ、ＮｏｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。このＰＣＲ断片、およびｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つベクター ｐＳＲ１０００を、制限酵素ＳｍｉＩ、ＮｏｔＩで切断し、ライゲーションを行った。精製後、エレクトロポレーションにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。クロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地上に生えてきたコロニーについてＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをクロラムフェニコール含有ＴＳＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ発現誘導用プラスミドを得た。得られたプラスミドについて、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
菌体内発現用ＳＡ０９６２−Ｃ２タグのベクター構築
ＳＡ０９６２のＣ末端側にＣ２タグが付加された配列を有するプラスミドＮｆｒ−ＳＡ０９６２−ＴＣＳ−Ｈｉｓ−ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＳＡ０９６２ ＯＲＦのＣ末端側にＣ２タグ配列が融合した断片を得た。この際、両端にＳｍｉＩ、ＮｏｔＩの制限酵素サイトを付与したプライマーを使用した。このＰＣＲ断片、およびｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つベクター ｐＳＲ１０００を、制限酵素ＳｍｉＩ、ＮｏｔＩで切断し、ライゲーションを行った。精製後、エレクトロポレーションにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株へ導入した。クロラムフェニコール含有ＴＳＡ培地上に生えてきたコロニーについてＰＣＲを行い、インサートの挿入を確認した。このコロニーをクロラムフェニコール含有ＴＳＢ液体培地にて培養し、ミニプレップ法によりプラスミドの抽出、精製を行うことで、ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ発現誘導用プラスミドを得た。得られたプラスミドについて、シーケンス解析を行い、正しい配列を有することを確認した。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ強制発現したＳＡ０９６２温度感受性株の構築
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ発現誘導プラスミドをＳＡ０９６２温度感受性株へエレクトロポレーションにより導入し、Ｃ２タグ融合ＳＡ０９６２発現温度感受性株を構築した。導入したプラスミドはｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つため、この株をキシロース存在下で培養することでＣ２タグ融合ＳＡ０９６２を強制発現させた。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグ発現誘導プラスミドをＳＡ０９６２温度感受性株へエレクトロポレーションにより導入し、Ｃ２タグ融合ＳＡ０９６２発現温度感受性株を構築した。導入したプラスミドはｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つため、この株をキシロース存在下で培養することでＣ２タグ融合ＳＡ０９６２を強制発現させた。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグを強制発現したＳＡ０９６２温度感受性株の培養
培養は、上記「黄色ブドウ球菌ＳＡ１８８８欠失株の培養」に記した方法を一部改変して行った。まず、菌株をＬＢ液体培地５００ｍＬで一晩振とう培養後、その培養液を３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＴＳＢ液体培地（３％トリプティックソイブロス）１５Ｌに加え、３７℃でジャーファーメンターによる培養を行った。６２５ｎｍの吸光度が１．０に到達した時点で集菌し、菌体を洗浄した後回収した。
培養は、上記「黄色ブドウ球菌ＳＡ１８８８欠失株の培養」に記した方法を一部改変して行った。まず、菌株をＬＢ液体培地５００ｍＬで一晩振とう培養後、その培養液を３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＴＳＢ液体培地（３％トリプティックソイブロス）１５Ｌに加え、３７℃でジャーファーメンターによる培養を行った。６２５ｎｍの吸光度が１．０に到達した時点で集菌し、菌体を洗浄した後回収した。
抗Ｃ２タグ抗体のＦａｂ化およびビオチン標識体の調製
２．７ｍｇの２型コラーゲンのネオエピトープ断片（Ｃ２タグ）に対する抗体（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ２０１２， ｉｎ ｐｒｅｓｓ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に、６０μｇのペプシン（ロシュ社製）を加え、３７℃、２４時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりＦ（ａｂ´）２を含む画分を分取した。０．１ｍＭの２‐ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ナカライテスク社製）を４０μｌ添加し、３７℃で２時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりＦａｂ´を含む画分を分取した。その後、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ‐ＰＥＯ２‐ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を添加し、４℃で２４時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりビオチン標識Ｆａｂ´を含む画分を分取し、抗Ｃ２タグ抗体‐Ｆａｂ‐ビオチン体とした。
２．７ｍｇの２型コラーゲンのネオエピトープ断片（Ｃ２タグ）に対する抗体（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ２０１２， ｉｎ ｐｒｅｓｓ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に、６０μｇのペプシン（ロシュ社製）を加え、３７℃、２４時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりＦ（ａｂ´）２を含む画分を分取した。０．１ｍＭの２‐ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ナカライテスク社製）を４０μｌ添加し、３７℃で２時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりＦａｂ´を含む画分を分取した。その後、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ‐ＰＥＯ２‐ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を添加し、４℃で２４時間反応した。反応液からゲルろ過ＨＰＬＣによりビオチン標識Ｆａｂ´を含む画分を分取し、抗Ｃ２タグ抗体‐Ｆａｂ‐ビオチン体とした。
抗Ｃ２タグＦａｂ抗体固定化ビーズの作製
ビオチン化抗Ｃ２タグＦａｂ抗体２μｇは、ストレプトアビジン磁性ビーズと室温、１５分間転倒混和して固定化した。磁石を用いて上清を除去した後、ビーズとビオチン溶液（２ｍＭ ｂｉｏｔｉｎ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３６．８９ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を再混合し、室温、１５分間転倒混和で未反応のストレプトアビジンをブロックした。ビーズは、０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳで３回洗浄した後、使用するまで４℃で保存した。
ビオチン化抗Ｃ２タグＦａｂ抗体２μｇは、ストレプトアビジン磁性ビーズと室温、１５分間転倒混和して固定化した。磁石を用いて上清を除去した後、ビーズとビオチン溶液（２ｍＭ ｂｉｏｔｉｎ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３６．８９ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を再混合し、室温、１５分間転倒混和で未反応のストレプトアビジンをブロックした。ビーズは、０．２％ＤＤＭを含むＴＢＳで３回洗浄した後、使用するまで４℃で保存した。
ＳＡ０９６２結合タンパク質の精製
膜画分の調製ならびに可溶化は、上記「膜画分の調製」と「膜画分の可溶化」の記述に従い実施した。以降の磁性ビーズと上清の分画操作は、磁石を用いて行った。まず、可溶化上清と抗Ｃ２タグＦａｂ抗体固定化ビーズを４℃、１２時間転倒混和した。スタロバシンによる結合阻害条件では、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるようにスタロバシンを共存させた。上清を除いた後、ビーズを０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳで３回洗浄した。次に、ビーズを０．１ｕｎｉｔトロンビン（シグマ・アルドリッチ）、０．１％ Ｒａｐｉｇｅｓｔ（ウォーターズ）を含む１００ｍＭ 重炭酸アンモニウムと混合し４℃、１２時間転倒混和後、ＳＡ０９６２結合タンパク質画分として上清を回収した。
膜画分の調製ならびに可溶化は、上記「膜画分の調製」と「膜画分の可溶化」の記述に従い実施した。以降の磁性ビーズと上清の分画操作は、磁石を用いて行った。まず、可溶化上清と抗Ｃ２タグＦａｂ抗体固定化ビーズを４℃、１２時間転倒混和した。スタロバシンによる結合阻害条件では、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるようにスタロバシンを共存させた。上清を除いた後、ビーズを０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳで３回洗浄した。次に、ビーズを０．１ｕｎｉｔトロンビン（シグマ・アルドリッチ）、０．１％ Ｒａｐｉｇｅｓｔ（ウォーターズ）を含む１００ｍＭ 重炭酸アンモニウムと混合し４℃、１２時間転倒混和後、ＳＡ０９６２結合タンパク質画分として上清を回収した。
ＳＡ０９６２結合タンパク質の溶液内酵素消化
ＳＡ０９６２結合タンパク質画分に終濃度５ｍＭ ジチオトレイトールを加え、６０℃、３０分還元処理後、更に終濃度１５ｍＭ ヨウドアセトアミドを加え、室温、遮光、３０分アルキル化処理を行った。次に、０．５μｇリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃、１２時間インキュベート、続いて０．５μｇトリプシンを加えて３７℃、３時間インキュベートし、酵素消化した。
ＳＡ０９６２結合タンパク質画分に終濃度５ｍＭ ジチオトレイトールを加え、６０℃、３０分還元処理後、更に終濃度１５ｍＭ ヨウドアセトアミドを加え、室温、遮光、３０分アルキル化処理を行った。次に、０．５μｇリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃、１２時間インキュベート、続いて０．５μｇトリプシンを加えて３７℃、３時間インキュベートし、酵素消化した。
ペプチドの精製
消化ペプチド溶液に終濃度０．５％ＴＦＡを加え３７℃、４５分インキュベート後、１５，０００ｘｇ、５分遠心し、Ｒａｐｉｇｅｓｔを分解除去した。次に、上清からＪｕｒｉ Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒらの方法（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００３， ７５， ６６３−６７０）に従い、ペプチドを精製した。得られたペプチド溶液は、遠心エバポレーターで乾固した。
消化ペプチド溶液に終濃度０．５％ＴＦＡを加え３７℃、４５分インキュベート後、１５，０００ｘｇ、５分遠心し、Ｒａｐｉｇｅｓｔを分解除去した。次に、上清からＪｕｒｉ Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒらの方法（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００３， ７５， ６６３−６７０）に従い、ペプチドを精製した。得られたペプチド溶液は、遠心エバポレーターで乾固した。
ＳＡ０９６２結合タンパク質の同定
上記「タンパク質同定」の内容を一部改変して実施した。回収された消化ペプチドは、０．１％ギ酸に溶解し、高速液体クロマトグラフ質量分析装置で質量分析した。ペプチドの分離条件は、溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸、８０％アセト二トリルを用いて、５％Ｂ（０−５分）、５−６０％Ｂ（５−１２５分）、６０−１００％Ｂ（１２５−１２５．１分）、１００％Ｂ（１２５．１−１３５分）、１００−５％Ｂ（１３５−１３５．１分）とした。得られたマススペクトルからタンパク質同定ソフトウエアＭａｓｃｏｔを用いてタンパク質を同定した後、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて、スタロバシン存在下もしくは非存在下の差分解析を、同定されたペプチド配列を元に実施した。差分解析結果から得られたスタロバシン存在下で結合が阻害されるタンパク質のリストを表２に示す。
上記「タンパク質同定」の内容を一部改変して実施した。回収された消化ペプチドは、０．１％ギ酸に溶解し、高速液体クロマトグラフ質量分析装置で質量分析した。ペプチドの分離条件は、溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸、８０％アセト二トリルを用いて、５％Ｂ（０−５分）、５−６０％Ｂ（５−１２５分）、６０−１００％Ｂ（１２５−１２５．１分）、１００％Ｂ（１２５．１−１３５分）、１００−５％Ｂ（１３５−１３５．１分）とした。得られたマススペクトルからタンパク質同定ソフトウエアＭａｓｃｏｔを用いてタンパク質を同定した後、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて、スタロバシン存在下もしくは非存在下の差分解析を、同定されたペプチド配列を元に実施した。差分解析結果から得られたスタロバシン存在下で結合が阻害されるタンパク質のリストを表２に示す。
以上の結果から、スタロバシン存在下で結合が阻害される候補分子として１７分子を同定した。
このリストには、細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅとしてＳＡ０９６２と相互作用する可能性があるＳＡ１０２７とＳＡ１１１９が含まれたことから、スタロバシンの作用機序は、細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅ形成の阻害であることが予想された。
このリストには、細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅとしてＳＡ０９６２と相互作用する可能性があるＳＡ１０２７とＳＡ１１１９が含まれたことから、スタロバシンの作用機序は、細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅ形成の阻害であることが予想された。
スタロバシン存在下におけるＳＡ０９６２結合タンパク質の定量比較
「ＳＡ０９６２結合タンパク質の同定」から得た細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅ形成に関与するＳＡ０９６２、ＳＡ１０２７、ＳＡ１１１９について、スタロバシンあり／なしの条件で定量比較を行った。解析方法は、「ＳＡ０９６２結合タンパク質の同定」の内容を一部変更して実施した。まず、ＳＡ０９６２を定量するには、ＳＡ０９６２として同定されたペプチド（配列番号４５）の、プリカーサーイオンｍ／ｚ９１６．０をＭＳＭＳして得られるプロダクトイオンｍ／ｚ１０１７．５について測定した。同様に、ＳＡ１０２７では、同定されたペプチド（配列番号４６）のプリカーサーイオンｍ／ｚ１０７５．６から得られるプロダクトイオンｍ／ｚ９３３．５、ＳＡ１１１９は同定されたペプチド（配列番号４７）のプリカーサーイオンｍ／ｚ９０２．４から得られるプロダクトイオンｍ／ｚ１２２３．７を測定した。
「ＳＡ０９６２結合タンパク質の同定」から得た細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅ形成に関与するＳＡ０９６２、ＳＡ１０２７、ＳＡ１１１９について、スタロバシンあり／なしの条件で定量比較を行った。解析方法は、「ＳＡ０９６２結合タンパク質の同定」の内容を一部変更して実施した。まず、ＳＡ０９６２を定量するには、ＳＡ０９６２として同定されたペプチド（配列番号４５）の、プリカーサーイオンｍ／ｚ９１６．０をＭＳＭＳして得られるプロダクトイオンｍ／ｚ１０１７．５について測定した。同様に、ＳＡ１０２７では、同定されたペプチド（配列番号４６）のプリカーサーイオンｍ／ｚ１０７５．６から得られるプロダクトイオンｍ／ｚ９３３．５、ＳＡ１１１９は同定されたペプチド（配列番号４７）のプリカーサーイオンｍ／ｚ９０２．４から得られるプロダクトイオンｍ／ｚ１２２３．７を測定した。
その結果、ＳＡ０９６２量は、スタロバシンのあり／なしに相関して変化しなかった。一方で、ＳＡ１０２７，ＳＡ１１１９は、スタロバシンありの条件で検出されなかった。このことから、ＳＡ０９６２とＳＡ１０２７、またＳＡ０９６２とＳＡ１１１９の結合がスタロバシンで阻害されたと考えられた。（図１２）
ＳＡ１０２７のクローニングと無細胞合成用ベクター構築
配列情報（ＧＴＯＰ ＢＡＢ４２２７９．１）に従い、ＳＡ１０２７蛋白質翻訳領域の５´末端配列とＳｗａＩ認識配列を含むプライマーＮｄｅＩ−ＳＡ１０２７−Ｆｗｄ（配列番号１８）及び３´末端の配列とＮｏｔＩ認識配列を含むプライマーＸｈｏＩ−ＳＡ１０２７−Ｒｅｖ（配列番号１９）を設計した。次に、これらのプライマーＤＮＡを用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０ ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。このＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで３７℃、１２０分間処理し、その後アガロース電気泳動による分離と精製を行って、１，３２３ ｂｐとのＤＮＡ断片を含む領域を切り出し、あらかじめＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて調製しておいた開環済みのｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターに導入し、アンピシリン耐性遺伝子を有する組み換えプラスミドＳＡ１０２７−ｐＥＴ２１ａ（＋）を得た
配列情報（ＧＴＯＰ ＢＡＢ４２２７９．１）に従い、ＳＡ１０２７蛋白質翻訳領域の５´末端配列とＳｗａＩ認識配列を含むプライマーＮｄｅＩ−ＳＡ１０２７−Ｆｗｄ（配列番号１８）及び３´末端の配列とＮｏｔＩ認識配列を含むプライマーＸｈｏＩ−ＳＡ１０２７−Ｒｅｖ（配列番号１９）を設計した。次に、これらのプライマーＤＮＡを用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０ ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとする計３０サイクルで行った。このＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで３７℃、１２０分間処理し、その後アガロース電気泳動による分離と精製を行って、１，３２３ ｂｐとのＤＮＡ断片を含む領域を切り出し、あらかじめＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて調製しておいた開環済みのｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターに導入し、アンピシリン耐性遺伝子を有する組み換えプラスミドＳＡ１０２７−ｐＥＴ２１ａ（＋）を得た
ＳＡ１０２７−Ｈｉｓタグの無細胞合成
ＳＡ１０２７−ＴＣＳ−Ｈｉｓタンパク質の無細胞合成は、上記「ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグの無細胞合成」に記した方法を一部改変して行った。まず、キット附属の大腸菌濃縮細胞抽出液、反応ミックス、２０アミノ酸、プラスミドＳＡ１０２７−ｐＥＴ２１ａ（＋）、プロテアーゼ阻害剤カクテル、０．６７％ Ｂｒｉｊ５８（登録商標）（ポリエチレングリコールモノセチルエーテル）を混合し、３０℃、４時間、２００ｒｐｍで振とうして反応させた。以下のアッセイには４℃で１５０００ｘｇ、１５分遠心した翻訳反応上清を用いた。
ＳＡ１０２７−ＴＣＳ−Ｈｉｓタンパク質の無細胞合成は、上記「ＳＡ０９６２−Ｈｉｓタグの無細胞合成」に記した方法を一部改変して行った。まず、キット附属の大腸菌濃縮細胞抽出液、反応ミックス、２０アミノ酸、プラスミドＳＡ１０２７−ｐＥＴ２１ａ（＋）、プロテアーゼ阻害剤カクテル、０．６７％ Ｂｒｉｊ５８（登録商標）（ポリエチレングリコールモノセチルエーテル）を混合し、３０℃、４時間、２００ｒｐｍで振とうして反応させた。以下のアッセイには４℃で１５０００ｘｇ、１５分遠心した翻訳反応上清を用いた。
ＳＡ０９６２−Ｃ２タグとＳＡ１０２７−Ｈｉｓタグの結合実験
ＳＡ０９６２とＳＡ１０２７の相互作用は、無細胞合成された両分子によるプルダウンアッセイにより確認した。プルダウンアッセイは、まずマウス抗ペンタＨｉｓモノクローナル抗体（キアゲン）１μｇとＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ， インビトロジェン）１０μｇを混合して抗体を固定した。続いて、抗体固定化ビーズ、ＳＡ０９６２−Ｃ２タグおよびＳＡ１０２７−Ｈｉｓタグの無細胞翻訳反応液上清・各４μＬ、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳ緩衝液を混合し最終スケール２５０μＬで４℃、１６時間転倒混和した。ビーズを回収し、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳ緩衝液で洗浄した後、ＤＴＴを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動サンプルバッファー中３７℃、３０分の加熱処理により、ビーズに結合したＳＡ０９６２−Ｃ２を溶出した。スタロバシンとの競合実験は、ＳＡ０９６２−Ｃ２とＳＡ１０２７−Ｈｉｓを混合する際に２５ｎｇのスタロバシンを共存させた。溶出画分に含まれるＳＡ０９６２−Ｃ２量は、一次抗体をマウス抗Ｃ２タグモノクローナル抗体とするウエスタンブロッティングで行った。その結果を図１３に示す。
ＳＡ０９６２とＳＡ１０２７の相互作用は、無細胞合成された両分子によるプルダウンアッセイにより確認した。プルダウンアッセイは、まずマウス抗ペンタＨｉｓモノクローナル抗体（キアゲン）１μｇとＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ， インビトロジェン）１０μｇを混合して抗体を固定した。続いて、抗体固定化ビーズ、ＳＡ０９６２−Ｃ２タグおよびＳＡ１０２７−Ｈｉｓタグの無細胞翻訳反応液上清・各４μＬ、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳ緩衝液を混合し最終スケール２５０μＬで４℃、１６時間転倒混和した。ビーズを回収し、０．２％ ＤＤＭを含むＴＢＳ緩衝液で洗浄した後、ＤＴＴを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動サンプルバッファー中３７℃、３０分の加熱処理により、ビーズに結合したＳＡ０９６２−Ｃ２を溶出した。スタロバシンとの競合実験は、ＳＡ０９６２−Ｃ２とＳＡ１０２７−Ｈｉｓを混合する際に２５ｎｇのスタロバシンを共存させた。溶出画分に含まれるＳＡ０９６２−Ｃ２量は、一次抗体をマウス抗Ｃ２タグモノクローナル抗体とするウエスタンブロッティングで行った。その結果を図１３に示す。
ＳＡ１０２７を固定化したプルダウンアッセイ条件でのみ、ＳＡ０９６２はＳＡ１０２７と相互作用し、共沈したことが確認された。また、スタロバシン存在下で両者の結合が弱まることから、スタロバシンはＳＡ０９６２とＳＡ１０２７の相互作用を阻害することで細胞***装置ｄｉｖｉｓｏｍｅの形成を阻害し、強力な抗菌活性を発揮すると考えられた。
実施例５ ＳＡ０９６２の生存必須性の確認
温度感受性突然変異株による相補性試験
ＳＡ０９６２の生存必須性を確認するために、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株の温度感受性突然変異株ＴＳ３０２１を用いて以下のような実験を行った。温度感受性突然変異株とは、具体的には、３０℃では増殖できるが４４℃で増殖できないような突然変異株のことである。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ０９６２ ＯＲＦの完全長のＰＣＲ増幅を行った。増幅断片を、制限酵素ＳｍｉＩおよびＮｏｔＩで処理し、シャトルベクターｐＳＲ１０００上に挿入することでＳＡ０９６２発現誘導プラスミドを構築した。このプラスミドは、ｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つため、キシロースにより、ＳＡ０９６２の発現を誘導することが可能である。
上記プラスミドをＴＳ３０２１にエレクトロポレーション法で導入した。得られた菌液をＢ２ ｂｒｏｔｈ〔組成：１重量％カザミノ酸、２．５重量％ 酵母エキス、０．１重量％ リン酸水素二カリウム、０．５重量％ グルコース、２．５重量％ 塩化ナトリウム（ｐＨ ７．５）〕で３０℃にて１時間培養後、クロラムフェニコール含有ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ）〔組成：１．５重量％ カゼインの膵液消化物、０．５重量％ 大豆のパパイン消化物、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天 （ｐＨ７．３±０．２）〕培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。上記平板培地上、形成されたコロニーを単離し、ＳＡ０９６２発現誘導プラスミドの導入されたＴＳ３０２１の組換え株を獲得した。
また、対照のためにｐＳＲ１０００をＴＳ３０２１へ導入した株を上記と同様の方法で作製した。
作製した２種類の組換え株の懸濁液を、クロラムフェニコールおよびキシロース含有ＴＳＡ培地にそれぞれ２枚ずつ播種し、一方を３０℃で、他方を４４℃で１日間培養した。
温度感受性突然変異株による相補性試験
ＳＡ０９６２の生存必須性を確認するために、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株の温度感受性突然変異株ＴＳ３０２１を用いて以下のような実験を行った。温度感受性突然変異株とは、具体的には、３０℃では増殖できるが４４℃で増殖できないような突然変異株のことである。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＳＡ０９６２ ＯＲＦの完全長のＰＣＲ増幅を行った。増幅断片を、制限酵素ＳｍｉＩおよびＮｏｔＩで処理し、シャトルベクターｐＳＲ１０００上に挿入することでＳＡ０９６２発現誘導プラスミドを構築した。このプラスミドは、ｘｙｌＲとｘｙｌＯを持つため、キシロースにより、ＳＡ０９６２の発現を誘導することが可能である。
上記プラスミドをＴＳ３０２１にエレクトロポレーション法で導入した。得られた菌液をＢ２ ｂｒｏｔｈ〔組成：１重量％カザミノ酸、２．５重量％ 酵母エキス、０．１重量％ リン酸水素二カリウム、０．５重量％ グルコース、２．５重量％ 塩化ナトリウム（ｐＨ ７．５）〕で３０℃にて１時間培養後、クロラムフェニコール含有ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ）〔組成：１．５重量％ カゼインの膵液消化物、０．５重量％ 大豆のパパイン消化物、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天 （ｐＨ７．３±０．２）〕培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。上記平板培地上、形成されたコロニーを単離し、ＳＡ０９６２発現誘導プラスミドの導入されたＴＳ３０２１の組換え株を獲得した。
また、対照のためにｐＳＲ１０００をＴＳ３０２１へ導入した株を上記と同様の方法で作製した。
作製した２種類の組換え株の懸濁液を、クロラムフェニコールおよびキシロース含有ＴＳＡ培地にそれぞれ２枚ずつ播種し、一方を３０℃で、他方を４４℃で１日間培養した。
その結果、ｐＳＲ１０００を導入した株、つまりＳＡ０９６２の発現誘導を行っていない株は、３０℃では生育したものの、４４℃では生育しなかった。一方、ＳＡ０９６２の発現誘導を行った組換え株は、３０℃、４４℃いずれの条件下でも生育できた。これにより、ＳＡ０９６２を相補することでＴＳ３０２１の温度感受性が消失することが確認された（表３）。
以上のことから、ＴＳ３０２１の温度感受性はＳＡ０９６２遺伝子上に生じた突然変異によりもたらされたものであることが分かり、ＳＡ０９６２は黄色ブドウ球菌の増殖において必要不可欠な遺伝子であることが明らかになった。
実施例６ ＳＡ１０２７の生存必須性の確認
ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドの構築
黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株から、慣用の方法で染色体ＤＮＡを単離した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型にＳＡ１０２６及びＳＡ１０２８の一部をＰＣＲ法により増幅し、得られた各断片を温度感受性ベクタープラスミドｐＣＬ５２．１に組み込み、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０染色体上ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドとした。
ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドの構築
黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株から、慣用の方法で染色体ＤＮＡを単離した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型にＳＡ１０２６及びＳＡ１０２８の一部をＰＣＲ法により増幅し、得られた各断片を温度感受性ベクタープラスミドｐＣＬ５２．１に組み込み、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０染色体上ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドとした。
ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドの染色体への挿入株の構築
得られたＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドをＳｔｅｖｅ Ｓｃｈｅｎｋらの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．， ９４， ｐａｇｅ １３３−１３８）に従って、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株に導入した。得られた形質転換体のコロニーを拾い、生理食塩水に懸濁し、テトラサイクリン含有ＮＹＥ寒天培地〔組成：１重量％ カザミノ酸、０．５重量％ 酵母エキス、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天〕に塗布し、４２℃にて培養した。得られたコロニーについてＰＣＲ法にてＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドがＳＡ１０２６側で染色体上に挿入されたことを確認した。
得られたＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドをＳｔｅｖｅ Ｓｃｈｅｎｋらの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．， ９４， ｐａｇｅ １３３−１３８）に従って、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株に導入した。得られた形質転換体のコロニーを拾い、生理食塩水に懸濁し、テトラサイクリン含有ＮＹＥ寒天培地〔組成：１重量％ カザミノ酸、０．５重量％ 酵母エキス、０．５重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天〕に塗布し、４２℃にて培養した。得られたコロニーについてＰＣＲ法にてＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドがＳＡ１０２６側で染色体上に挿入されたことを確認した。
黄色ブドウ球菌ＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドの構築
染色体ＤＮＡを鋳型にＳＡ１０２７遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られた断片を発現調節プラスミドベクターｐＳＲ１０００に組み込み、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０のＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドとした。
染色体ＤＮＡを鋳型にＳＡ１０２７遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られた断片を発現調節プラスミドベクターｐＳＲ１０００に組み込み、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０のＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドとした。
黄色ブドウ球菌ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株の構築
得られたＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドは、上記「ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドの染色体への挿入株の構築」と同様の方法で、ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミド挿入株に導入した。得られた形質転換体のコロニーを拾い、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＬＢ液体培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、１重量％ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）〕中で４２℃にて培養して、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地に塗布、培養した。ついで、生じたコロニーを、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地及びテトラサイクリン及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地にレプリカ法で播種した。続いて、レプリカプレートを４２℃で培養し、テトラサイクリン感受性の株を選抜し、純化を実施した。その結果、得られた菌株についてＰＣＲ法にて、染色体ＤＮＡ上のＳＡ１０２７遺伝子の欠失を確認した株を黄色ブドウ球菌ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株として得た。また、同時に染色体上のＳＡ１０２７遺伝子が欠失されず、ＲＮ４２２０株と同様の遺伝子型になった株を復帰株として得た。
得られたＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドは、上記「ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミドの染色体への挿入株の構築」と同様の方法で、ＳＡ１０２７遺伝子欠失プラスミド挿入株に導入した。得られた形質転換体のコロニーを拾い、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＬＢ液体培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、１重量％ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）〕中で４２℃にて培養して、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地に塗布、培養した。ついで、生じたコロニーを、クロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地及びテトラサイクリン及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地にレプリカ法で播種した。続いて、レプリカプレートを４２℃で培養し、テトラサイクリン感受性の株を選抜し、純化を実施した。その結果、得られた菌株についてＰＣＲ法にて、染色体ＤＮＡ上のＳＡ１０２７遺伝子の欠失を確認した株を黄色ブドウ球菌ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株として得た。また、同時に染色体上のＳＡ１０２７遺伝子が欠失されず、ＲＮ４２２０株と同様の遺伝子型になった株を復帰株として得た。
黄色ブドウ球菌ＳＡ１０２７タンパク質の必須性の確認
得られたＳＡ１０２７遺伝子発現調節株及び復帰株をクロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地上で３７℃にて一晩線形培養し、ついでミューラーヒントン液体培地〔組成：０．２重量％ 牛肉エキス、１．７５重量％ カゼインー酸加水分解ペプトン、０．１５重量％ 可溶性澱粉〕中に懸濁した。一方で、親株であるＲＮ４２２０株も同様にキシロース含有ＮＹＥ寒天培地上で培養し、ついでミューラーヒントン液体培地に希釈した。得られた各懸濁液を希釈し、ミューラーヒントン液体培地及びキシロース含有ミューラーヒントン液体培地を分注した９６穴プレートにそれぞれ接種し、３５℃で培養した。菌の生育は、波長５９５ｎｍの濁度で確認した。キシロース非添加条件の結果を図１４に、キシロース添加条件の結果を図１５に示す。
得られたＳＡ１０２７遺伝子発現調節株及び復帰株をクロラムフェニコール及びキシロース含有ＮＹＥ寒天培地上で３７℃にて一晩線形培養し、ついでミューラーヒントン液体培地〔組成：０．２重量％ 牛肉エキス、１．７５重量％ カゼインー酸加水分解ペプトン、０．１５重量％ 可溶性澱粉〕中に懸濁した。一方で、親株であるＲＮ４２２０株も同様にキシロース含有ＮＹＥ寒天培地上で培養し、ついでミューラーヒントン液体培地に希釈した。得られた各懸濁液を希釈し、ミューラーヒントン液体培地及びキシロース含有ミューラーヒントン液体培地を分注した９６穴プレートにそれぞれ接種し、３５℃で培養した。菌の生育は、波長５９５ｎｍの濁度で確認した。キシロース非添加条件の結果を図１４に、キシロース添加条件の結果を図１５に示す。
キシロース非添加条件では、ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株は明らかにＲＮ４２２０株及び復帰株よりも生育が抑制されていることが確認された。一方で、キシロース添加条件では、ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株はＲＮ４２２０株及び復帰株と同様の生育を示した。ＳＡ１０２７遺伝子発現調節株の僅かな生育については、キシロース非存在下でも、わずかにＳＡ１０２７遺伝子発現調節プラスミドからＳＡ１０２７遺伝子が発現し、遺伝子欠失を相補するためと考えられた。以上の結果より、黄色ブドウ球菌においてＳＡ１０２７タンパク質は増殖に必須のタンパク質であることが確認された。
本発明のスクリーニング方法により、新規作用メカニズムを持つ抗菌剤をスクリーニングすることができる。該方法により、スペクトルが広く、強力な抗菌活性を持つ新規な抗菌剤を得ることができる。
Claims (5)
- ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと、被検物質とを接触させる工程、および
該ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドと結合する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。 - 被検物質の存在下で、ＦｔｓＱ、ＦｔｓＫおよびそれらの部分ペプチドからなる群より選ばれる１以上のポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドを接触させる工程、および
該ポリペプチドと、ＦｔｓＷまたはその部分ペプチドとの結合を阻害する被検物質を選択する工程
を含む、抗菌剤のスクリーニング方法。 - 該ＦｔｓＷの部分ペプチドが、９／１０ループを含むペプチドである、請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法。
- 該ＦｔｓＷ、ＦｔｓＱおよびＦｔｓＫが、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドである、請求項１〜請求項３いずれかに記載のスクリーニング方法。
- ＦｔｓＷ又はその部分ペプチドを含有する、抗菌剤のスクリーニング用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012280642A JP6045025B2 (ja) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 抗菌剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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