CN108779124A - 金卟啉-peg缀合物及使用方法 - Google Patents
金卟啉-peg缀合物及使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了包括或使用一种或多种金(III)卟啉络合物的缀合物、组合物和方法。优选的缀合物是金(III)卟啉‑聚(乙二醇)(PEG)缀合物。优选的组合物和方法包括或使用这样的金(III)卟啉‑PEG缀合物。本发明公开了治疗癌症的方法,其包括施用于需要这样治疗的人包含治疗有效量的金(III)卟啉‑聚(乙二醇)(PEG)缀合物的组合物。金(III)卟啉‑PEG缀合物可以为由金(III)卟啉‑PEG缀合物的自组装形成的纳米结构的形式;或由金(III)卟啉‑PEG缀合物的纳米结构封装其它治疗剂形成的纳米复合材料的形式。
Description
相关申请的交叉参照
本申请要求2015年12月8日提交的美国申请号62/264,525的优先权,其公开内容全部通过引用并入本文。
发明领域
本文主题一般涉及可在水性介质中经历自组装成为纳米结构的金(III)卟啉-PEG缀合物,封装治疗剂的方法,和使用金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构和纳米复合材料治疗癌症的方法。
发明背景
顺铂及其衍生物被用作针对各种形式的癌症,包括睾丸、膀胱、头和颈、卵巢、乳腺、肺、***和难治性非霍奇金淋巴瘤的化疗剂。然而,在这些基于铂的化合物的临床应用中发现的毒副作用和耐药性的出现已促使科学界开发新一代的化疗剂[Sadler, et al. Curr. Opin. Chem. Biol.2008, 12, 197]。与主要靶向DNA的顺铂和许多其它基于铂的药物不同,金(I)和/或金(III)络合物已表现出多种作用,包括抑制硫氧还蛋白还原酶、直接DNA损害、改变细胞周期、蛋白酶体抑制和调节特定激酶[Che, et al. Chem. Soc. Rev.2015,印刷中]。这些多模式的作用对于金络合物显示针对癌细胞,特别是针对顺铂-和多药-抗性细胞系的有效细胞毒性是重要的。例如,金(III)四苯基卟啉络合物被发现导致线粒体电位的损耗和由胱天蛋白酶-依赖性和胱天蛋白酶-非依赖性线粒体死亡路径二者诱导的细胞凋亡。与它们在生理条件下的卓越稳定性(其明显不同于其它金络合物在生物介质中的迅速分解)一起,金(III)四苯基卟啉络合物表现出针对不同类型的癌,包括显示出顺铂抗性的那些癌的有前景的体内抗-癌活性[Che, et al. Chem. Commun.2011, 47, 9554]。然而,金(III)四苯基卟啉络合物表现出差的生物利用度和对正常细胞和组织的高毒性,这也常常发现于其它金属药物的研究中,从而阻碍转化该络合物用于临床研究。
纳米技术的进步可有助于克服抗-癌金属络合物的体内实验中发现的挑战[Farokhzad, O. C.; Lippard, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2008, 105,17356]。由于实体瘤中存在渗漏的肿瘤血管和受损的淋巴***,发现约100 nm的纳米结构显示因增强的渗透性和滞留(EPR)作用而积累在肿瘤附近[Davis, et al. Nat. Rev. Drug Discov. 2008, 7, 771]。因此,纳米-制剂将允许生物分布的显著改善,并且更重要的是,减少通常在传统治疗剂中观察到的毒副作用。对于纳米-制剂的常规策略包括通过纳米级载体封装药物分子和共价连接药物分子至预形成的纳米结构(如金纳米粒子和磁性氧化铁纳米粒子)。
虽然通过纳米级载体封装药物分子和共价连接药物分子至预形成的纳米结构已表明具有体外和/或体内抗-癌功效,但纳米载体以及预形成的纳米结构中的成分的毒性提出了重要的问题。一个实例是Doxil,其是临床上批准的使用聚(乙二醇) (PEG)-纳米脂质体的多柔比星的制剂。Doxil施用引起皮肤毒性(与PEG-脂质体载体相关),所述毒性在单独施用多柔比星时不发生。因此,开发具有最少含量的纳米-装配组分的纳米结构将有利于化学疗法。
本发明的目的是提供用于癌症疗法的金(III)-卟啉缀合物。
本发明的目的还是提供一种不借助于纳米载体或预形成的纳米结构制备药物载荷的纳米结构或微结构的方法。
本发明的又一个目的是提供具有最少纳米载体或预形成的纳米结构的纳米结构或微结构化疗载体。
本发明的目的还是提供一种在有需要的受试者中选择性地靶向癌症的方法。
本发明的还一个目的是提供一种选择性地递送化疗剂至受试者的肿瘤细胞的方法。
本发明的进一步的目的是提供一种治疗耐化学疗法的癌症的方法。
发明概述
本文描述的组合物和方法基于这样的发现,即两亲性金属络合物通过非-共价相互作用的超分子的自组装可导致不借助于纳米载体或预形成的纳米结构而形成纳米结构或微结构。这提供了一个在性质上是相当疏水性的金(III)卟啉络合物纳米-制剂的吸引人的策略。亲水性组分引入到疏水性金(III)卟啉络合物上可在某些情况下赋予络合物两亲性特性,因而促进它们通过EPR作用在体内靶向肿瘤附近的纳米结构的形成。
本文提供用于癌症疗法的自组装的两亲性金(III)卟啉(GP)缀合物及其盐。在一个优选的实施方案中,金(III)卟啉缀合物是具有式I的结构式的金(III)卟啉-聚(乙二醇)(PEG)缀合物:
或其药学上可接受的盐,其中:X独立地为药学上可接受的抗衡离子;A1、A2、A3和A4独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基(azidyl)、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基、膦酰基(phosphonyl);和其中任选地和独立地,至少一个An与Bn (如果Bn不是C0)或Pn(如果Bn是C0)形成共价键;B1、B2、B3和B4独立地为C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;P1、P2、P3和P4独立地为氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG);且其中任选地和独立地至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
从GP缀合物或其中的盐形成的纳米/微结构可以诱导癌细胞死亡的治疗有效量包括在药物制剂中。GP缀合物可单独用于癌症疗法,或与一种或多种化疗剂组合用于供癌症疗法的制剂中。在这个实施方案中,从GP缀合物或其盐形成的纳米/微结构被优选用来封装一种或多种治疗剂/用作一种或多种治疗剂的载体,以实现共同递送。
本文还公开治疗癌症的方法,其包括施用于需要这样的治疗的受试者一种组合物,其包含有效量的单独或与一种或多种化疗剂组合的GP缀合物或其盐,以诱导癌细胞死亡。
本文还公开在需要这样的治疗的受试者中减少流出泵-介导的耐药性的方法,包括施用于所述受试者一种组合物,其包含有效量的单独或与一种或多种化疗剂组合的GP缀合物或其盐,以诱导癌细胞死亡。
本文还公开选择性地递送化疗剂至有需要的部位的方法,其包括封装化疗剂在包含GP-PEG (GPP)缀合物的纳米-微结构中并施用封装的化疗剂至需要这样的治疗的部位。
本公开的方法和组合物的额外优点将在下面的描述中部分阐明,而部分将从描述中理解,或可通过所公开的方法和组合物的实践得知。通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合将认识到并实现本公开的方法和组合物的优点。要理解前文的概述和以下的详述都仅仅是示例性和说明性的,且不限制所要求保护的发明。
附图简述
附图,其被结合到本说明书中并构成本说明书的一部分,说明了本公开的方法和组合物的几个实施方案并与该描述一起,用来解释本公开的方法和组合物的原理。
图1显示络合物1的多功能特性,它们对于其独特的自组装特性和有效的抗-癌特性是重要的。
图2是显示在酯键水解时,从缀合物释放化学治疗性金(III)卟啉部分的示意图。
图3A显示于37℃孵育指定的时间间隔后,1 (正方形)、A1 (圆形)和Au1a (三角形) (2 µM)分别进入HCT116和NCM460细胞的细胞吸收。图3B显示于37℃孵育指定的时间间隔后,络合物1 (正方形)、A1 (圆形)和Au1a (三角形)和NC1 (倒三角形) (2 µM)分别进入A2780和A2780adr细胞的细胞吸收。图3C显示于37℃孵育2 h后,所述络合物(2 µM)进入癌细胞和非-肿瘤发生细胞的细胞吸收的比率的条形图。在每一组条中,条按相同的自左至右顺序为:A2780对比MIHA,A2780对比NCM460,A2780adr对比MIHA,A2780adr对比NCM640,HCT116对比MIHA,HCT116对比NCM460。图3D显示分别于37℃在含10 vol%胎牛血清的细胞培养基中(两个系列中的第一条),于37℃在含10 vol%胎牛血清和0.45 M蔗糖的细胞培养基中(两个系列中的第二条),于37℃在水性缓冲溶液(140 mM NaCl、20 mM HEPES、1 mMCaCl2、1 mM MgCl2和1 g/L ᴅ-葡萄糖,pH 7.4)中(两个系列中的第三条),和于4℃在含10vol%胎牛血清的细胞培养基中(两个系列中的第四条)中孵育2 h后,1进入HCT116和NCM460细胞的细胞吸收。所有的数据作为来自3次独立实验的平均数± SEM显示。
图4显示于37℃孵育指定的时间间隔后,所述络合物被MIHA细胞的细胞吸收。
图5显示于4℃孵育指定的时间间隔后,1 (正方形)和A1 (圆形) (2 µM)分别进入HCT116和NCM460细胞的细胞吸收。
图6A和6B显示用不同浓度的(6A) 1的纳米结构和(6B) NC1处理72 h的细胞存活率。
图7显示用1或溶剂对照通过静脉内注射治疗后16天,具有A2780异种移植物的裸鼠的肿瘤重量。*与溶剂对照比较,p < 0.05。**与溶剂对照比较,p < 0.01。所有的数据作为来自10次独立实验的平均数± SEM显示。
图8A显示用不同剂量的1或A1治疗的具有HCT116异种移植物的裸鼠(n = 8),在治疗后24天测量的肿瘤重量。图8B和8C分别显示用不同剂量的1或A1治疗后小鼠(n = 8)中肿瘤体积和体重的变化。对照组仅接受相同体积的PBS。**表示与对照比较p < 0.01。
图9A-9H分别显示在治疗后24天,小鼠(n = 8)中ALT、AST、GLB、BUN、CREA、UA、LDH和CK的血生物化学分析。具有不同字符的条是有统计学意义的(p < 0.05水平)。
图10显示通过静脉内注射1 (4 mg/kg)、Au1a和A1 (2 mg/kg)分别治疗14天后,携带HCT116异种移植物的裸鼠中金络合物的生物分布。在各组条中,条按相同的自左至右顺序为:1、Au1a、A1。匀化组织中的金含量通过ICP-MS定量。n = 5 (对于Au1a和A1)和6 (对于1)。数据显示为平均数± SD。
图11显示在用1 (13 mg/kg; n = 5)、Au1a (2 mg/kg; n = 4)和A1 (2 mg/kg, n = 4)单剂量静脉内注射后,在治疗后24 h,金化合物在携带HCT-116异种移植物的裸鼠的不同器官中的生物分布。匀化组织中的金含量通过ICP-MS定量。溶剂对照被用作计算背景。插图显示肿瘤中的金含量与其它器官中的金含量的比率。
图12A显示用1 (4 mg/kg)或溶剂对照治疗的具有A2780cis异种移植物的裸鼠(n= 5)随时间推移的肿瘤体积。图12B显示用1 (4 mg/kg)或溶剂对照治疗的具有A2780cis异种移植物的裸鼠(n = 5)随时间推移的体重变化。对照组仅接受相同体积的PBS。*表示与对照比较p < 0.05。
图13A和13B显示(13A) HeLa和(13B) A2780adr细胞在用不同浓度的NC1和DOX处理72 h后的细胞存活率曲线图。NC1包含1和DOX ([1] : [DOX] = 7:1),它们二者都是抗-癌活性的。
图14A显示MIHA细胞在用不同浓度的NC1 ([1]:[DOX] = 7:1)和DOX处理72 h后的细胞存活率的曲线图。图14B显示于37℃孵育指定的时间间隔后,NC1 ([1] = 3.5 µM和[DOX] = 0.5 µM)和DOX (0.5 µM)分别进入A2780adr细胞的细胞吸收。在各组条中,条按相同的自左至右顺序为:14 h、24 h。
图15显示1 (3.65 µM)在PBS溶液中和Pt-1a (13 µM)在PBS-DMSO溶液混合物(99:1, v/v)中的UV-vis吸收光谱。1显示在400 nm的峰,而Pt-1a没有。
发明详述
通过参考特定实施方案的以下详细描述和其中包括的实施例,和附图及其先前和以下的描述,可更容易地理解本公开的方法和组合物。
本文描述了金(III)卟啉-PEG (GPP)缀合物以及单独或与其它治疗剂组合的金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米复合材料作为抗-癌剂的用途。当与非-癌细胞比较时,GPP缀合物或其盐可通过它们被癌细胞选择性吸收而被用来选择性地靶向癌细胞。GPP缀合物或其盐可通过共同施用药物与本文公开的GPP缀合物,被用来治疗流出泵-介导的耐药性。
包括或使用一种或多种金(III)卟啉络合物的缀合物、组合物和方法被公开。优选的缀合物是金(III)卟啉-聚(乙二醇) (PEG)缀合物。优选的组合物和方法包括或使用这样的金(III)卟啉-PEG缀合物。
在某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物可具有以下结构:
,
包括其药学上可接受的盐。在这种金(III)卟啉-PEG缀合物的某些形式中:
X可独立地是药学上可接受的抗衡离子;
A1、A2、A3和A4可独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基,其中,任选和独立地,至少一个An可与Bn (如果Bn不是C0)或Pn(如果Bn是C0)形成共价键;
B1、B2、B3和B4可独立地是C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;和
P1、P2、P3和P4可独立地是氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG),其中,任选和独立地,至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
在金(III)卟啉-PEG缀合物的某些形式中,A1是-C6H4C(=O)-或-C6H4O-;B1是C0或-C(=O)(CH2)8C(=O)-;和P1是-O-PEG-OCH3或-NH-PEG-OCH3。在金(III)卟啉-PEG缀合物的某些形式中,P1是-O-PEG~5000-OCH3或-NH-PEG~5000-OCH3。在金(III)卟啉-PEG缀合物的某些形式中,A2、A3和A4各自为芳基;B2、B3和B4各自为C0;P2、P3和P4各自是氢;和任选地,X是氯离子。
在某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构。在某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物可在水性介质中经历自组装成为纳米结构,从而形成纳米复合材料。如果治疗剂或关注的其它化合物或组合物存在,则金(III)卟啉-PEG缀合物可在水性介质中经历自组装成为纳米结构,以形成包含治疗剂和金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米复合材料。在某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物可封装一种或多种抗-癌化疗剂,从而形成用于共同递送的纳米复合材料。
在某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构或微结构当施用于具有癌细胞的受试者时,可诱导癌细胞的凋亡。这样的受试者可以说是需要诱导癌细胞死亡。
抗-癌化疗剂也被公开。在某些形式中,抗-癌化疗剂是多柔比星或是具有N-杂环碳烯(NHC)配体的d8金属络合物,其具有以下结构式:
。
在这种NHC配体的一些形式中:M可以是Au、Pt或Pd;R1可以是氢或苯基;R2和R3可各自是氢或一起可以是-CH-CH-CH-CH-;R4、R5、R7和R8可各自是氢;R6和R9可各自独立地选自-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C5H11、-C6H13、苄基、(2-羟基)乙基、苯基、萘-2-基甲基和(2-苯基)乙基;n可以是+1或+2;y可以是+1或+2;A可以是抗衡离子或药学上可接受的阴离子;b可以是-1或-2;和X、Y和Z可各自独立地为碳或氮。在这种NHC配体的某些形式中:M可以是Pt;R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8可各自是氢;R6和R9可以是-C4H9;n可以是+1;yAb可以是CF3SO4 -;X可以是碳;和Y和Z可各自是氮。
在有需要的受试者中诱导癌细胞死亡的方法被公开。在该方法的某些形式中,包含有效量的一种或多种公开的金(III)卟啉-PEG缀合物的组合物被施用于所述受试者。在该方法的某些形式中,所述组合物诱导受试者的癌细胞的凋亡。
靶向递送治疗剂至受试者中的癌细胞的方法也被公开。在该方法的某些形式中,治疗剂被封装在包含一种或多种公开的金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构或微结构中。在该方法的某些形式中,金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构,从而形成包含治疗剂和金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米复合材料。
在某些形式中,受试者可患有选自直肠结肠癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤、耐顺铂癌症和耐阿霉素癌症的癌症。
A. 定义
如本文所用的,本文所用的短语“药学上可接受的盐”包括从原子、化合物、缀合物或络合物(如,荷电金(III)络合物)和抗衡离子形成的盐。一般来说,药学上可接受的盐是联邦或州政府的管理机构批准或接受的盐,或美国药典或其它一般公认的药典所列的盐,其用于动物、哺乳动物且更特别是人。
如本文所用的,术语“卟啉”指具有结构I的分子:
R1-R20独立地选自氢和卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烯基、炔基、磷酰基、膦酰基,和取代的C1-C8烷氧基、取代的氨基或取代的羰基,其中,任选和独立地,R1-R20中的至少一个是羟基、未取代的或取代的氨基、羧基、羰基、甲酰基、叠氮基、烯基、炔基、硫羟基或异氰酸酯基,用于与间隔基或PEG形成共价键。
如本文所用的术语“取代基”和“取代”指本文描述的化合物或官能团的所有可允许的取代基。术语“取代的”指具有一个用取代基取代的基团(通常氢或碳)的化合物。与化合物、结构、R基团等等相关联的术语“被……取代”,指提及的化合物、结构、R基团等等的取代基。在最广义上说,可允许的取代基包括有机化合物的无环的和环状、分支和未分支的、碳环和杂环的、芳族和非芳族取代基。示例性取代基包括,但不限于,卤素,羟基,或包含任何数目的碳原子、优选1-14个碳原子的任何其它有机基团,且任选地在线性、分支或环状结构形式中包括一个或多个杂原子,例如氧、硫或氮基团。代表性取代基包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤代、羟基、芳烷基、取代的芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、多芳基、取代的多芳基、C3-C20环基、取代的C3-C20环基、杂环基、取代的杂环基、氨基酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、肽和多肽基团。这样的烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤代、羟基、芳烷基、取代的芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、多芳基、取代的多芳基、C3-C20环基、取代的C3-C20环基、杂环基、取代的杂环基、氨基酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、肽和多肽基团可被进一步取代。
如本文所用的术语“烷基”是1-24个碳原子的分支或未分支的饱和烃基,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。如本文所用的术语“乙基”是具有2个碳的烷基。
如本文所用的术语“烯基”是2-24个碳原子的烃基且结构式包含至少一个碳-碳双键。不对称结构例如(AB)C=C(CD)意欲包括E和Z两种异构体。这可在本文的存在不对称烯烃的结构式中推测,或它可用键符号C明确表示。
如本文所用的术语“炔基”是2-24个碳原子的烃基且结构式包含至少一个碳-碳三键。
如本文所用的术语“氨基”和“胺”是本领域公认的并指取代的和未取代的胺二者,如,可由以下通式表示的部分:
其中,R、R’和R’’各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、-(CH2)m-R’’’,或R和R’与它们连接的N原子结合在一起完成在环结构中具有3-14个原子的杂环;R’’’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环;和m是0或范围从1至8的整数。在优选的实施方案中,R和R’的只有一个可以是羰基,例如,R和R’与氮一起不形成酰亚胺。在优选的实施方案中,R和R’ (且任选地R’’)各自独立地代表氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基,或-(CH2)m-R’’’。因此,如本文所用的术语“烷基胺”指具有连接于其上的取代或未取代的烷基的如上定义的胺基(即R、R’或R’’的至少一个是烷基)。
如本文所用的术语“芳基”是任何碳-基芳族基团,包括但不限于,苯、萘等等。术语“芳族”也包括“杂芳基”,其被定义为具有至少一个加入芳族基团环内的杂原子的芳族基团。杂原子的实例包括但不限于,氮、氧、硫和磷。
如本文所用的术语“苯基”是本领域公认的,并指芳族部分-C6H5,即没有一个氢原子的苯环。
如本文所用的术语“取代的苯基”指如上定义的,具有替代苯基环的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的苯基。这样的取代基包括但不限于,卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季化氨基)、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、烷基芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。如本文所用的术语“苄基”是一种特殊形式的取代的苯基,其具有替代苯基环的一个碳上的氢原子之一的-CH2-基团。
如本文所用的术语“烷氧基”是通过单个末端醚键连接的烷基;即是说,“烷氧基”基团可被定义为-OR,其中R是如上定义的烷基。
如本文所用的术语“取代的烷氧基”由式-O-R-X表示,其中R是如上定义的烷基和X可独立地是卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基。
如本文所用的术语“环烷基”是包含至少3个碳原子的非芳族碳-基环。环烷基的实例包括但不限于,环丙基、环丁基、环戊基、环己基等等。术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基,其中环中至少一个碳原子被杂原子,例如但不限于,氮、氧、硫或磷置换。
如本文所用的术语“羰基”是本领域公认的并包括可由以下通式代表的这样的部分:
其中X是键,或代表氧或硫,和R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷基芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基,或者取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R’’,或药学上可接受的盐,R’代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷基芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基,或者取代或未取代的杂芳基或-(CH2)m-R’’;R’’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环;和m是0或范围从1至8的整数。在X是氧和R是如上定义的时,所述部分也称为羧基。当X是氧和R是氢时,该式代表“羧酸”。在X是氧和R’是氢时,该式代表“甲酸酯”。在X是氧和R或R’不是氢时,该式代表"酯"。一般来说,在上式的氧原子被硫原子替代时,该式代表“硫代羰基”基团。在X是硫和R或R’不是氢时,该式代表“硫酯”。在X是硫和R是氢时,该式代表“硫代羧酸”。在X是硫和R’是氢时,该式代表“硫代甲酸酯”。在X是键和R不是氢时,上式代表“酮”。在X是键和R是氢时,上式代表“醛”。
术语“取代的羰基”指如上定义的羰基,其中R、R’或以下部分
连接的基团中的一个或多个氢原子独立地被取代。这样的取代基包括但不限于,卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季化氨基)、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、烷基芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“羧基”是如上对下式的定义
,
且由式-R’COOH更明确地定义,其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、烷基芳基、芳烷基、芳基或杂芳基。在优选的实施方案中,直链或支链烷基、烯基和炔基在其骨架中具有30个或更少的碳原子(如,C1-C30对于直链烷基,C3-C30对于支链烷基,C2-C30对于直链烯基和炔基,C3-C30对于支链烯基和炔基),优选20个或更少,更优选15个或更少,最优选10个或更少的碳原子。同样,优选的环烷基、杂环基、芳基和杂芳基在它们的环结构中具有3-10个碳原子,且更优选在环结构中具有5、6或7个碳。如本文所用的术语“羧酸”是由式-C(O)OH代表的特殊形式的羧基。
术语“取代的羧基”指如上定义的羧基,其中R’中的一个或多个氢原子被取代。这样的取代基包括但不限于,卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季化氨基)、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、烷基芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用的术语“醛”由式-C(O)H代表。
如本文所用的术语“酮基”由式-C(O)R代表,其中R是上述的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基。
如本文所用的术语“羰基”由式C=O代表。
如本文所用的术语“醚”由式AOA1代表,其中A和A1可独立地为上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
如本文所用的术语“酯”由式-C(O)OA代表,其中A可以是上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
如本文所用的术语“酰胺基”由式-C(O)NR-代表,其中R是上述烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基。
如本文所用的术语“异氰酸酯基”由式-N=C=O代表。
“卤素”,如本文所用的,指氟、氯、溴或碘。
如本文所用的术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”可互换使用并由-OH代表。
如本文所用的术语“硝基”指-NO2。
如本文所用的术语“膦酰基”由式-P(O)RR’代表,其中R和R’可独立地是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
如本文所用的术语“磷酰基”由式-PO3 -代表。
如本文所用的术语“磺酰基”由式-SO2R代表,其中R是上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
如本文所用的术语“磺酸”由式-SO3H代表。
如本文所用的术语“磺酰基”由下式代表
其中E不存在,或E是烷基、烯基、炔基、芳烷基、烷基芳基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基,其中E、R独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷基芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基,或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R’’’,或E和R与它们连接的S原子结合在一起完成在环结构中具有3-14个原子的杂环;R’’’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环;和m是0或1-8的整数。在优选的实施方案中,E和R的只有一个可以是取代或未取代的胺,形成“磺酰胺”或“磺酰胺基”。取代或未取代的胺如上定义。
术语“取代的磺酰基”代表其中E、R,或二者,均被独立地取代的磺酰基。这样的取代基包括但不限于,卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季化氨基)、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、烷基芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用的术语“叠氮基(azidyl)”由式-N3代表。
如本文所用的术语“甲酰基”由式-C(O)H代表。
如本文所用的术语“硫羟基”由式-SH代表。
如本文所用的术语“烷硫基”由式-SR代表,其中R是上述烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基。
如本文所用的,短语“PEG”指具有分子量范围从500至10,000的聚(乙二醇)。PRG的分子量或平均分子量可由以道尔顿计的重量的下标指定(如,PEG2000和PEG~5000分别表示分子量2000道尔顿的PEG和大约500道尔顿的分子量的PEG)。除非另有明确相反规定,提及特定分子量的PEG指PEG组合物的平均分子量。PEG的两个端基独立地是羟基、甲氧基、氨基、酰胺基、羧基、硫羟基、羰基、炔基、叠氮基、生物素基、磷酰基、膦酰基、膦酰基、磺酰基、磺酸、甲硅烷基、N-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺。
如本文所用的,术语“缀合物”指在金(III)卟啉络合物和PEG之间具有共价键合(直接或通过间隔基)的化合物。
如本文所用的术语“间隔基”由式X-Y-Z代表,其中X和Z可以是与金(III)卟啉部分和PEG形成共价键的酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、苯甲酰-亚胺(benzoic-imine)、腙、1,2,3-***或硫醚。Y是1-8个碳原子的烃基。
如本文所用的术语“碳酸酯”由式-OC(O)O-代表。
如本文所用的术语“氨基甲酸酯”由式-OC(O)NR-代表,其中R可以是氢,或烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基,通常如在本文别处所述的。
如本文所用的术语“苯甲酰-亚胺”由式-PhCH=N-代表,其中Ph可以是芳基、芳烷基或杂芳基。
如本文所用的术语“腙”由式-RC=NNH2代表,其中R可以是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基,如在本文别处所述的。
如本文所用的术语“1,2,3-***”由下式表示:
。
如本文所用的术语“硫醚”由式-S-代表。
在提及化合物、取代基、部分等等时的术语未取代的“Cx”,指具有x个碳原子的化合物、取代基、部分等等。
在提及化合物、取代基、部分等等时的术语未取代的“Cy-Cx”,指具有从y至x个碳原子(包括y和x)的化合物、取代基、部分等等。例如,C1-C8烷基是具有1-8个碳原子(包括1和8)的烷基。
在提及化合物、取代基、部分等等时的术语未取代的“C0”,指具有0个碳原子的化合物、取代基、部分等等。C0化合物、取代基、部分等等的实例,包括磺酰基、磺酸、氨磺酰基、磷酰基和膦酰基。
如本文所用的,短语“抗衡离子”指与相对缀合物或络合物缔合的离子。抗衡离子的实例包括抗衡-阴离子和抗衡-阳离子。
如本文所用的,短语“抗衡-阴离子”指与荷正电缀合物或络合物(如,荷电金(III)络合物)缔合的阴离子。抗衡-阴离子的非-限制性实例包括卤素例如氟离子、氯离子、溴离子和碘离子,硫酸根、磷酸根、三氟甲磺酸根、乙酸根、硝酸根、高氯酸根、乙酰丙酮酸根、六氟乙酰丙酮酸根和六氟磷酸根。
如本文所用的,术语“自组装”指通过非-共价超分子的相互作用,从缀合物或络合物(如,金(III)络合物)形成有序结构。非-共价超分子的相互作用的非-限制性实例包括疏水性相互作用、π-π相互作用、氢键、金属···金属相互作用、C-H···O相互作用和C-H···X (其中X是F或Cl)相互作用。
如本文所用的,短语“纳米结构”指具有在10-1000 nm范围内的至少一个维度的任何可能的几何形状的有序结构。有序结构的几何形状的非-限制性实例包括球形、圆柱形、圆盘状、轮状和纤维结构。
如本文所用的,短语“微结构”指具有在1-1000 μm范围内的至少一个维度的任何可能的几何形状的有序结构。有序结构的几何形状的非-限制性实例包括球形、圆柱形、圆盘状、轮状和纤维结构。
如本文所用的,短语“纳米/微结构”、“纳米结构和微结构”、“纳米-和微结构”等等指具有在10 nm-1000 μm范围内的至少一个维度的任何可能的几何形状的有序结构。有序结构的几何形状的非-限制性实例包括球形、圆柱形、圆盘状、轮状和纤维结构。
如本文所用的,短语“纳米复合材料”指由金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构封装一种或一种以上的治疗剂形成的多-组分结构。
如本文所用的,术语“封装”指用有序结构通过非-共价相互作用容纳一种或一种以上的化合物。非-共价超分子的相互作用的非限制性实例包括疏水性相互作用、π-π相互作用、氢键、金属···金属相互作用、C-H···O相互作用和C-H···X (其中X是F或Cl)相互作用。所述化合物可位于有序结构的任何部分,例如中央腔、壳或表面。
如本文所用的,短语“药学上可接受的离子”、“药学上可接受的阴离子”、“药学上可接受的阳离子”、“药学上可接受的抗衡离子”、“药学上可接受的抗衡-阴离子”、“药学上可接受的抗衡-阳离子”分别意指联邦或州政府的管理机构批准或接受的或美国药典或其它一般公认的药典所列的离子、阴离子、阳离子、抗衡离子、抗衡-阴离子或抗衡-阳离子,其用于动物、哺乳动物,且更特别是人。
如本文所用的术语"受试者"包括,但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其它生物或实体。所述受试者可以是脊椎动物,更特别是哺乳动物(如,人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非-人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。所述受试者可以是无脊椎动物,更特别是节肢动物(如,昆虫和甲壳类动物)。该术语不表示特定年龄或性别。因此,成年和新生受试者,以及胎儿,不管是雄性或是雌性,都打算包括在内。患者指罹患疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人和兽医的受试者。
如本文所用的术语“施用”、“给药”等等指使物质或产品接触受试者的身体。例如,施用物质或产品包括接触受试者的皮肤和将物质或产品注射或植入受试者。
本文所用的术语“治疗(treatment或treating)”是指受试者的医学管理,目的是治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症。该术语包括积极的治疗,即是说,特别针对疾病、病理状态或病症的改善的治疗,并且还包括病因治疗,即是说,针对消除相关疾病、病理状态或病症的病因的治疗。此外,该术语包括姑息治疗,即是说,设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状态或病症的治疗;预防性治疗,即是说,针对尽可能减少或部分地或完全地抑制相关疾病、病理状态或病症的发展的治疗;和支持性治疗,即是说,用来补充针对相关疾病、病理状态或病症的改善的另一种特定疗法的治疗。要理解,治疗,虽然意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症,但不必在实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可如本文所述和如本领域已知的,如适合于所涉及的疾病、病理状态或病症的,进行测量和评价。这样的测量和评价可根据定性和/或定量条件作出。因此,例如,疾病、病理状态或病症和/或疾病、病理状态或病症的症状的特征或特点可被减少到任何效果或任何量。治疗包括施用化合物、缀合物、络合物、组合物等等作为如上定义的治疗。
如本文所用的术语“有效量”一般指化合物、络合物、缀合物、组合物等等的量,以提供所需效果,例如一种或多种临床上可测量的终点。所需的精确量可在受试者之间变化,取决于受试者的种族、年龄和一般状况;要治疗的疾病的严重性;所用的特定细胞、胶囊、产品、装置、材料、组合物或化合物;其施用模式;和其它常规变量。适宜的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验测定。
如本文所用的术语“抗-癌剂”指对癌症或其任何症状或作用具有负面影响的任何化合物、缀合物、络合物、组合物、物质等等。抗-癌剂可结合特定或特殊效果或效果类别进行定义和提及。例如,抗-癌剂可以是诱导癌细胞死亡(即,细胞凋亡)的药剂。抗-癌剂的实例包括抗-癌化疗剂、抗-癌治疗剂、抗-癌化合物、抗-癌络合物、抗-癌金属络合物、抗-癌缀合物、抗-癌纳米结构、抗-癌微结构和抗-癌纳米复合材料。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或其它一般公认的药典所列的载体成分的载体组合,用于动物、哺乳动物,且更特别是人。
要理解本公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术,或不限于特定的试剂,除非另外指明,因此,可能有变化。还应理解,在此所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的,并不意欲进行限制。
公开了材料、组合物和组分,其可用于本公开的方法和组合物,可联合本公开的方法和组合物使用,可用于制备本公开的方法和组合物的产物,或为本公开的方法和组合物的产物。这些和其它材料在本文公开,且要理解当这些材料的组合、子集、相互作用、基团等等被公开时,虽然这些化合物各自的多种单独的和集体的组合和排列的具体提及可能没有被明确地公开,但各自在本文被特别考虑和描述。例如,如果缀合物被公开和讨论,和可对许多分子包括缀合物进行的许多修饰被讨论,则缀合物和可能的修饰的各个和每一个组合和排列被特别地考虑,除非有明确相反指示。因此,如果分子A、B和C的类型以及分子D、E和F的类型被公开,和组合分子的实例A-D被公开,则即使每个未被单独叙述,每个也被单独和集体地考虑。因此,在这个实例中,组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的每一个被特别地考虑且应被认为从A、B和C;D、E和F;和实例组合A-D的公开内容公开。同样地,这些的任何子集或组合也被特别地考虑和公开。因此,例如,A-E、B-F和C-E的亚组被特别地考虑且应被认为从A、B和C;D、E和F;和实例组合A-D的公开内容公开。此外,如上考虑和公开的材料、组合物、组分等等各自也可特定和独立地包括在这样的材料的任何组、亚组、列表、集合等等内或从其中排除。这些概念适用于本申请的所有方面,包括,但不限于,制备和使用公开的组合物的方法中的步骤。因此,如果有各种可执行的额外步骤,则要理解这些额外步骤的每一个可用本公开方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合执行,且每个这样的组合被特别地考虑且应被认为已被公开。
B. 组合物
药物组合物含有有效诱导癌细胞死亡的量的不同合成的金(III)卟啉-PEG缀合物。金(III)卟啉-PEG缀合物也提供一种在罹患癌症的受试者,优选人中抑制肿瘤细胞生长的方法,其包括施用于这样的人有效的肿瘤细胞生长抑制量的金(III)卟啉-PEG缀合物。本文报告的证据表明金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中形成纳米结构,而纳米结构揭示有效抗-癌特性,伴有对非-肿瘤发生细胞的显著减少的毒性,这显著不同于无PEG缀合的金(III)卟啉络合物。特别地,本文报告的数据表明金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构显示控制释放特性和比进入非-肿瘤发生细胞更快进入癌细胞的细胞吸收,因此导致有效杀死癌细胞超过非-肿瘤发生细胞。此外,本文报告的数据表明其它治疗剂由金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构封装,而纳米复合材料表现出对杀死癌细胞的协同作用,伴有对非-肿瘤发生细胞的毒性减少,以及克服卵巢癌细胞的流出泵-介导的耐药性的能力。
1. 金(III)卟啉络合物、缀合物、纳米结构和纳米复合材料
i. 金(III)卟啉络合物
已知一系列显示出针对一组人癌细胞,包括源自鼻咽和肝细胞癌的那些的抗-增殖活性的金(III)卟啉络合物。然而,这些络合物对非-肿瘤发生细胞是有毒性的。例如,对抗肿瘤生长的[Au(TPP)]Cl (Au1a; TPP = 5,10,15,20-四苯基卟啉)的有效剂量接近所述络合物的致死剂量,如通过急性毒理学研究所揭示的[Che, C. M. et al. Chem. Commun.2011, 47, 9554]。此外,金(III)卟啉络合物,其实例在下面提供,通常在水性介质中显示出差的溶解性。
然而,本文公开的金卟啉络合物可用作合成具有改进的治疗(例如抗-癌)和化学特性的GPC的前体材料。
ii. 金卟啉(GP)缀合物及其盐
GP缀合物优选地是金(III)卟啉-PEG (GPP)缀合物。如本文所用的,术语“金(III)卟啉-PEG缀合物”指结合于具有如上所示结构I的任何卟啉分子的金(III)金属的络合物,并且所述络合物与PEG直接或者通过间隔基形成共价键。一般说来,所公开的络合物是涉及或不涉及PEG或其它缀合基团的金(III)卟啉结构。一般说来,所公开的缀合物是金(III)卟啉结构缀合至PEG或其它基团的缀合物。共价键独立地是酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、苯甲酰-亚胺、腙、1,2,3-***或硫醚。
所公开的GPP缀合物用提供给它们抗-癌特性的多个官能团装饰(图1)。GPP缀合物显示改进的化学特性,例如,与无PEG缀合的金(III)卟啉络合物比较在水性介质中的溶解性改进,防污特性,和更重要是两亲性特性。这些特性对于改进抗-癌治疗功效及减少毒副作用(其是作为抗-癌剂的金属络合物的主要问题)是重要的。此外,PEG缀合的接头允许对抗-癌金(III)卟啉部分从缀合物的释放进行微调,从而对金属络合物的细胞毒性进行微调。金(III)卟啉-PEG缀合物的细胞毒性可通过改变键的化学结构进行微调。例如,包含酯键的GPP缀合物显示有效杀死癌细胞,而不形成任何毒副产物。这是因为PEG侧臂(pendant)可提供空间体积[Harris, J. M. et al. Nature Rev. Drug Discov.2003, 2, 214]以抑制金(III)卟啉部分与其分子靶的相互作用。因此,为实现对癌细胞的高细胞毒性,酯键(其可通过细胞内酯酶和/或肿瘤附近的酸性条件容易地水解)可被用于PEG和金(III)卟啉部分的缀合。例如,可制备仅包括抗-癌金(III)卟啉部分、FDA批准的PEG侧臂和间隔基例如癸二酸的金(III)卟啉-PEG缀合物。金(III)卟啉-PEG缀合物的水解不应形成任何毒副产物,即与金(III)卟啉络合物的毒性比较,未发现缀合物的额外毒性,这是成功的纳米-制剂的关键。示例性金(III)卟啉-PEG缀合物(缀合物1-6)的化学结构在下面显示,其从前体金(III)卟啉络合物(上文显示的A1-A11)合成。
在一个实施方案中,金(III)卟啉-PEG缀合物在荷电上不是中性的。例如,金(III)中心上的净正电荷可大于卟啉-PEG缀合物的绝对净负电荷。在这些实施方案中,可以有与金(III)络合物配位用于电荷中和的抗衡-阴离子。在其它实施方案中,GP缀合物在荷电上是中性的。
2. 药学上可接受的盐
GP缀合物的药学上可接受的盐也被公开。药学上可接受的盐的实例包括,但不限于碱性残基例如胺的无机或有机酸盐;和酸性残基例如羧酸的碱性或有机盐。药学上可接受的盐包括例如,从非-毒性无机或有机酸形成的母体化合物的常规非-毒性盐或季铵盐。这样的常规的非-毒性盐包括源自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的那些盐;和从有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、萘磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸和羟乙基磺酸制备的盐。
GPP缀合物的药学上可接受的盐可通过常规的化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般来说,这样的盐可通过使这些GPP缀合物的游离酸或碱形式与化学计量的适宜的碱或酸在水或在有机溶剂中,或在二者的混合物中反应来制备;一般来说,非-水性介质像***、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表见于Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第20版, Lippincott Williams & Wilkins,Baltimore, MD, 2000, p. 704;和“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties,Selection, and Use” P. Heinrich Stahl和Camille G. Wermuth, Eds., Wiley-VCH,Weinheim, 2002中。
3. 金卟啉(GP)缀合物的纳米/微结构
PEG侧臂可赋予金(III)卟啉络合物两亲性特性,以使金(III)卟啉-PEG缀合物可在水性介质中经历自组装成为纳米结构或微结构。通过卟啉配体的化学结构的明智选择,GPP缀合物可不借助于其它组分而在水性介质中形成感兴趣的纳米结构,并且这最大限度地降低和/或减少抗-癌治疗的不良副作用。
当与从中制备它们的金(III)卟啉络合物,即未与PEG缀合的前体金(III)卟啉络合物(“未聚乙二醇化金(III)卟啉络合物)比较时,GPP缀合物的纳米结构显示对一组癌细胞的优越的体外细胞毒性,包括显示出顺铂-和阿霉素-抗性的那些。有利地,与先前使用金(III)卟啉络合物的研究对比,它们对非-肿瘤发生细胞的毒性相对更低。选择性杀死癌细胞超过非-肿瘤发生细胞已被证明至少基于控制释放特性,和络合物比进入非-肿瘤发生细胞更快细胞吸收进入癌细胞,如电感耦合等离子质谱分析(ICP-MS)和超高效液相色谱耦合四极飞行时间质谱分析(UPLC-QTOF-MS)显示的。
4. 金卟啉(GP)缀合物的纳米复合材料
GPP缀合物的公开的纳米/微结构可被用作其它化疗的纳米级药物载体,以通过共同递送实现强烈的杀死癌细胞的作用,同时将毒副作用减至最小。GPP缀合物的纳米/微结构也可被用来减少单独施用化疗剂时通常发现的化疗剂的耐药性。治疗剂的封装在本文用多柔比星和细胞毒性铂(II)络合物与N-杂环碳烯(NHC)配体形成纳米复合材料举例说明。1和多柔比星的纳米复合材料证实杀死癌细胞的协同作用并可克服在单用多柔比星孵育时发现的A2780adr细胞的流出泵-介导的耐药性。此外,纳米复合材料显示非-肿瘤发生细胞的更慢吸收,导致纳米复合材料对非-肿瘤发生细胞的较低毒性。本领域普通技术人员将容易地预期,在本文用多柔比星和细胞毒性铂(II)络合物与N-杂环碳烯(NHC)举例的结果可外推到其它化疗剂。
示例性常规的癌症治疗剂包括化疗剂、细胞因子和趋化因子。大多数化疗药物可分为:烷化剂、抗代谢物、蒽环类抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其它抗肿瘤剂。所有这些药物以一定的方式影响细胞***或DNA合成和功能。另外的治疗剂包括单克隆抗体和新的酪氨酸激酶抑制剂如甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC®或GLIVEC®),其直接靶向某些类型的癌症(慢性骨髓性白血病、胃肠道基质瘤)的分子异常。
代表性化疗剂包括,但不限于多柔比星、顺铂、阿霉素、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、泰素及其衍生物、伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、表鬼臼毒素、曲妥珠单抗(HERCEPTIN®)、西妥昔单抗和利妥昔单抗(RITUXAN®或MABTHERA®)、贝伐单抗(AVASTIN®),及其组合。其它有用的药剂包括doxil、紫杉醇、喜树碱、伊立替康、盐酸黄连素、奥沙利铂、卡铂、金诺芬(auranofin)、具有N-杂环碳烯(NHC)配体的铂(II)络合物、金(I)膦络合物、金(I) NHC络合物、具有NHC配体的环金属化金(III)络合物和具有膦配体的环金属化金(III)络合物。
C. 制剂
本文描述的GPP缀合物的纳米/微结构可被配制用于肠道、胃肠外、局部或肺部施用。GPP缀合物,单独或与一种或多种治疗剂组合,可与被认为是安全有效且可施用于个体而不引起不需要的生物副作用或不想要的相互作用的一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合。在一个优选的实施方案中,GPP缀合物纳米/微结构是除了活性成分或成分和赋形剂和/或递送媒介外,存在于药物制剂中的唯一纳米/微米载体,即由于如本文公开的GPP缀合物的自装配,制剂不包括纳米载体或预形成的纳米结构。纳米载体是具有携带和递送治疗剂至疾病部位的能力的纳米结构[Wang, A. Z. et al. Annu. Rev. Med.2012, 63,185]。借助于两亲性特性,GPP缀合物可经历自组装成为纳米结构且这不需要存在其它表面活性剂或组分以供纳米-装配,不像最常规的药物纳米-制剂。
可用作递送媒介的药学上可接受的载体的非-限制性实例包括液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些。当本发明的化合物经静脉内施用时,水是常用的媒介。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作液体媒介,特别是用于可注射溶液。
1. 胃肠外制剂
本文描述的GPP缀合物及其盐可被配制用于胃肠外施用,任选地,包括一种或多种治疗剂。例如,胃肠外施用可包括经静脉内、皮内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、***内、胸膜内、气管内、玻璃体内、肿瘤内、肌内、皮下、结膜下、水泡内(intravesicularly)、心包内、脐带内、通过注射和通过输注,施用于患者。
胃肠外制剂可使用本领域已知的技术制备为水性组合物。通常地,这样的组合物可制备为可注射制剂,例如,溶液剂或混悬剂;适合用来在注射前加入重构介质制备溶液剂或混悬剂的固体形式;乳剂,例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体。
载体可以是溶剂或分散介质,包含例如,水、乙醇、一种或多种多元醇(如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油例如植物油(如,花生油、玉米油、芝麻油等),及其组合。适当的流动性可例如,通过使用包衣,例如卵磷脂,在分散液的情况下通过维持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下,优选包括等渗剂,例如,糖或氯化钠。
GPP缀合物或其药学上可接受的盐的溶液和分散液可在水或其它溶剂或适合与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合的分散介质中制备,所述赋形剂包括但不限于,表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。
合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于,包含羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸和烷基芳基磺酸的钠、钾、铵盐,例如十二烷基苯磺酸钠;二烷基磺基琥珀酸钠,例如十二烷基苯磺酸钠;二烷基磺基琥珀酸钠,例如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠;和烷基硫酸盐,例如十二烷基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于,季铵化合物例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、聚甘油-4-油酸酯、脱水山梨醇酰化产物、蔗糖酰化产物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000鲸蜡醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、泊洛沙姆® 401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。
所述制剂可含有预防微生物生长的防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可含有抗氧化剂以防止活性剂的降解。
所述制剂通常被缓冲至pH 3-8以供在重构时胃肠外施用。合适的缓冲液包括但不限于,磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
水溶性聚合物常常用于供胃肠外施用的制剂。合适的水溶性聚合物包括但不限于,聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
无菌可注射溶液可通过在具有一种或多种以上列出的赋形剂(如需要时)的适宜溶剂或分散介质中掺入所需量的GPP缀合物或其盐(任选地,包括一种或多种治疗剂),接着经过滤灭菌制备。一般来说,分散液通过将各种无菌的活性成分掺入含有基础分散介质和来自以上列出那些的所需其它成分的无菌媒介中制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末剂的情况下,优选的制备方法是真空-干燥和冷冻-干燥技术,其从其先前的无菌-过滤的溶液得到活性成分加任何另外的所需成分的粉末。粉末剂可以颗粒在性质上是多孔的方式制备,其可增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域熟知的。
i. 控制释放制剂
本文描述的胃肠外制剂可配制为控制释放,包括即刻释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。对于胃肠外施用,GPP缀合物的纳米/微结构或封装一种或多种另外的治疗活性剂的纳米/微结构可被用来提供GPP缀合物和/或一种或多种另外的活性剂的控制释放,如在实施例中描述的。在其中制剂含有两种或更多种药物的实施方案中,药物可配制为相同类型的控制释放(如,延迟、延长、即刻或脉冲)或药物可独立地配制为不同类型的释放(如,即刻和延迟、即刻和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。
例如,一种或多种另外的活性剂可掺入GP缀合物的纳米结构/纳米复合材料,其提供药物的控制释放。药物的释放通过药物到纳米结构外的扩散和/或聚合物颗粒经水解的降解和/或酶促降解进行控制。
ii.可注射/可植入制剂
本文描述的GPP缀合物、其盐和任选一种或多种治疗剂(统称为化合物)及其盐可掺入可注射/可植入固体或半-固体植入物,例如聚合物植入物中。在一个实施方案中,所述化合物被掺入于室温下是液体或糊状物,但在与水性介质,例如生理流体接触时,显示出粘度增加而形成半-固体或固体材料的聚合物中。示例性聚合物包括但不限于,源自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚化的羟基链烷酸聚酯。聚合物可被熔化,与活性物质混合,和铸造或注射成型为一个装置。这样的熔化制作需要具有低于要递送物质和聚合物降解或成为活性的温度的熔点的聚合物。所述装置也可通过溶剂铸造来制备,其中聚合物被溶于溶剂中,药物溶于或分散于聚合物溶液中,然后蒸发溶剂。溶剂加工需要使聚合物溶于有机溶剂。另一个方法是聚合物和药物的混合粉末或用活性剂载荷的聚合物颗粒的压塑成型。
或者,化合物可掺入聚合物基质中并模塑、压制或挤压成一个在室温下是固体的装置。例如,化合物可掺入可生物降解的聚合物,例如聚酐、聚羟基链烷酸(polyhydroalkanoic acids) (PHAs)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白和多糖例如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶,及其组合中并压制成固体装置,例如圆盘状物,或挤压成装置,例如棒状物。
从植入物释放一种或多种化合物可通过选择聚合物、聚合物的分子量和/或增加降解的聚合物修饰,例如形成孔和/或掺入可水解的键而变化。修饰可生物降解的聚合物的特性以改变化合物从植入物的释放特征的方法是本领域熟知的。
2.肠道制剂
合适的口服剂型包括片剂、胶囊、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和糖锭剂。片剂可使用本领域熟知的压制或模塑技术制备。明胶或非-明胶胶囊可使用本领域熟知的技术,作为硬或软胶囊壳制备,其可封装液体、固体和半-固体填充材料。
制剂可使用药学上可接受的载体制备。如本文通常使用的“载体”包括,但不限于,稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、膨胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。
载体也包括包衣组合物的所有组分,其可包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助流剂。
合适的包衣材料的实例包括但不限于,纤维素聚合物例如邻苯二甲酸醋酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和琥珀酸醋酸羟丙基甲基纤维素;聚乙烯醋酸邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物,和可以商品名EUDRAGIT®(Roth Pharma, Westerstadt, Germany)市售获得的甲基丙烯酸树脂、玉米蛋白、虫胶和多糖。
另外地,包衣材料可含有常规的载体例如增塑剂、颜料、着色剂、助流剂、稳定剂、造孔剂和表面活性剂。
“稀释剂”,也称为"填充剂",通常为增加固体剂型的体积,以便提供用于压制片剂或形成珠粒和颗粒的实际尺寸所必要。合适的稀释剂包括但不限于,磷酸氢二钙二水合物、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干燥淀粉、水解淀粉、预凝胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸镁铝和粉末化糖。
“粘合剂”被用来赋予固体剂量制剂的粘附品质,因而确保片剂或珠粒或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于,淀粉、预凝胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶例如***树胶、黄蓍胶、藻酸钠、纤维素,包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素,和硅酸镁铝(veegum),和合成聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。
“润滑剂”被用来促进片剂制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于,硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、甘油山嵛酸酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。
“崩解剂”被用来在施用后促进剂型崩解或"分解",并且通常包括但不限于,淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟基丙基纤维素、预凝胶化淀粉、粘土、纤维素、海藻素(alginine)、树脂或交联聚合物,例如交联PVP (Polyplasdone® XL,购自GAF Chemical Corp)。
“稳定剂”被用来抑制或阻止药物分解反应,其包括例如氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于,抗氧化剂、丁羟甲苯(BHT);抗坏血酸,其盐和酯;维生素E、生育酚及其盐;亚硫酸盐例如偏亚硫酸氢钠;半胱氨酸及其衍生物;柠檬酸;没食子酸丙酯,和丁羟茴醚(BHA)。
i. 控制释放肠道制剂
口服剂型,例如胶囊、片剂、溶液和混悬剂,可配制为控制释放。例如,一种或多种化合物可被配制成纳米粒子、微粒及其组合,并封装在软或硬明胶或非-明胶胶囊中或分散于分散介质中以形成口服悬浮液或糖浆剂。
在一些实施方案中,一种或多种化合物分散于基质材料中,其在接触水性介质,例如生理流体时发生胶凝或乳化。在凝胶剂的情况下,基质溶胀而捕获活性剂,其通过扩散和/或降解基质材料随时间推移而缓慢释放。这样的基质可配制为片剂或用于硬和软胶囊的填充材料。
在又一个实施方案中,GPP缀合物,和任选一种或多种另外的活性剂被配制成固体口服剂型,例如片剂或胶囊,且固体剂型用一种或多种控制释放包衣,例如延迟释放包衣或延长释放包衣涂布。所述一种或多种包衣也可含有化合物和/或另外的活性剂。
a. 延长释放剂型
延长释放制剂通常被制备为扩散或渗透***,其是本领域已知的。扩散***通常由两种类型的装置,贮库和基质组成,且是本领域熟知的和有所描述。基质装置一般通过压制药物与缓慢溶解的聚合物载体成为片剂形式来制备。用于制备基质装置的3种主要类型的材料是不溶性塑胶、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑胶基质包括但不限于,丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于,纤维素聚合物例如甲基和乙基纤维素、羟基烷基纤维素例如羟丙基-纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和Carbopol® 934、聚氧化乙烯及其混合物。脂肪化合物包括但不限于,各种蜡例如巴西棕榈蜡和甘油三硬脂酸酯和蜡-型物质,包括氢化蓖麻油或氢化植物油,或其混合物。
在某些优选的实施方案中,塑胶材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物,包括但不限于,丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙氧基乙基甲基丙烯酸酯、氰基乙基甲基丙烯酸酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和缩水甘油基甲基丙烯酸酯共聚物。
在某些优选的实施方案中,丙烯酸聚合物包含一种或多种铵基甲基丙烯酸酯共聚物。铵基甲基丙烯酸酯共聚物是本领域熟知的,并在NF XVII中被描述为丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯与低含量的季铵基团的完全聚合的共聚物。
在一个优选的实施方案中,丙烯酸聚合物是例如可以商品名EUDRAGIT t®从RohmPharma经市售获得的丙烯酸树脂漆。在进一步的优选的实施方案中,丙烯酸聚合物包含分别以商品名EUDRAGIT® RL30D和EUDRAGIT ® RS30D,从Rohm Pharma经市售获得的两种丙烯酸树脂漆的混合物。EUDRAGIT® RL30D和EUDRAGIT ® RS30D是丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯与低含量的季铵基团的共聚物,铵基团与剩余的中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比在EUDRAGIT ® RL30D中是1:20,而在EUDRAGIT® RS30D中是1:40。平均分子量是约150,000。EUDRAGIT ® S-100和EUDRAGIT ® L-100也是优选的。代码名称RL (高渗透性)和RS (低渗透性)指这些试剂的渗透性特性。EUDRAGIT ® RL/RS混合物在水中和在消化液中是不溶性的。然而,形成的包括它们的多颗粒***在水性溶液和消化液中是可溶胀的和可渗透的。
上述聚合物例如EUDRAGIT ® RL/RS可以任何所需比例混合在一起,以最终获得具有所需溶解特征的持续-释放制剂。所需的持续-释放多颗粒***可例如从100%EUDRAGIT® RL、50% EUDRAGIT® RL和50% EUDRAGIT t® RS,和10% EUDRAGIT® RL和90%EUDRAGIT® RS获得。本领域技术人员将认识到也可使用其它丙烯酸聚合物,例如,EUDRAGIT® L。
或者,延长释放制剂可使用渗透***或通过应用半-渗透包衣至所述剂型上制备。在后一种情况下,所需药物释放特征可通过以合适的比例合并低渗透和高渗透包衣材料实现。
具有上述不同的药物释放机理的装置可合并在包含单个或多个单位的最终剂型中。多个单位的实例包括但不限于,多层片剂和包含片剂、珠粒或颗粒的胶囊。即刻释放部分可以通过使用包衣或压制工艺在延长释放核心上涂覆即刻释放层,或者在多个单位***例如包含延长和即刻释放珠粒的胶囊中,而加入到延长释放***中。
包含亲水性聚合物的延长释放片剂通过本领域通常已知的技术例如直接压制、湿法制粒或干燥制粒制备。它们的制剂通常掺有聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药用成分。常用的稀释剂包括惰性粉末状物质例如淀粉、粉末状纤维素,特别是结晶和微晶纤维素、糖例如果糖、甘露醇和蔗糖,谷物面粉和类似的可食用粉末。典型的稀释剂包括,例如,各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐例如氯化钠和糖粉。粉末状纤维素衍生物也是有用的。典型的片剂粘合剂包括物质例如淀粉、明胶和糖例如乳糖、果糖和葡萄糖。也可使用天然和合成树胶,包括***树胶、藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水性聚合物、乙基纤维素和蜡也可用作粘合剂。为防止片剂和冲头粘附在冲模中,润滑剂在片剂制剂中是必需的。润滑剂选自光滑固体,如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。
包含蜡质材料的延长释放片剂通常使用本领域已知的方法,例如直接共混方法、凝结方法和水性分散方法制备。在凝结方法中,药物与蜡质材料混合,并且喷雾-凝结或凝结,以及过筛和加工。
b. 延迟释放剂型
延迟释放制剂可通过用聚合物薄膜包衣固体剂型建立,所述聚合物薄膜在胃的酸性环境中是不溶的,但在小肠的中性环境中是可溶的。
延迟释放剂量单位可例如,通过用选择的包衣材料包衣药物或包含药物的组合物制备。包含药物的组合物可以是例如,掺入胶囊中的片剂、在"包衣片芯"剂型中用作内核的片剂,或用于掺入片剂或者胶囊的多个包含药物的珠粒、微粒或颗粒。优选的包衣材料包括生物蚀解的、可逐渐水解的、逐渐溶于水的和/或酶促可降解的聚合物,和可以是常规的"肠道"聚合物。肠道聚合物,如将由本领域技术人员所意识到的,在下胃肠道的较高pH环境中成为可溶性的或当剂型通过胃肠道时慢慢侵蚀,同时酶促可降解的聚合物由存在于下胃肠道,特别是结肠中的细菌酶降解。用于实现延迟释放的合适的包衣材料包括但不限于,纤维素聚合物例如羟基丙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、乙基纤维素、纤维素乙酸酯、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、纤维素乙酸酯偏苯三酸酯和羧基甲基纤维素钠;丙烯酸聚合物和共聚物,优选地从丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成,和可以商品名Eudragit®经市售获得的其它甲基丙烯酸树脂(Rohm Pharma; Westerstadt, Germany),包括EUDRAGIT® L30D-55和L100-55 (在pH 5.5和以上可溶的)、EUDRAGIT® L-100 (在pH 6.0和以上可溶的)、EUDRAGIT® S (因为更高的酯化程度,在pH 7.0和以上可溶的),和EUDRAGITS® NE、RL和RS (具有不同程度的渗透性和膨胀性的水不溶性聚合物);乙烯基聚合物和共聚物例如聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基乙酸酯、乙烯基乙酸酯邻苯二甲酸酯、乙烯基乙酸酯巴豆酸共聚物,和乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物;酶促可降解的聚合物例如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶;玉米蛋白和虫胶。不同的包衣材料的组合也可采用。使用不同的聚合物的多-层包衣也可应用。
特定包衣材料的优选的包衣重量可由本领域技术人员通过评价用不同量的各种包衣材料制备的片剂、珠粒和颗粒的各释放特征,容易地确定。它是产生所需释放特性的材料、方法和应用形式的组合,人们可仅从临床研究确定。
包衣组合物可包括常规的添加剂,例如增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、助流剂等等。通常存在增塑剂以减少包衣脆弱性,并且一般占相对于聚合物的干重的约10 wt. %-50wt. %。典型的增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三醋精、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰基柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化单甘油酯。稳定剂被优选用来稳定在分散液中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂例如脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。建议使用助流剂以在薄膜形成和干燥期间减少粘滞作用,并一般占包衣溶液中的聚合物重量的大约25 wt.%-100 wt. %。一种有效的助流剂是滑石。其它助流剂例如硬脂酸镁和甘油单硬脂酸酯也可使用。颜料例如二氧化钛也可使用。少量的消泡剂,例如硅酮(如,二甲基硅油),也可加入到包衣组合物中。
D. 制备和使用方法
1. 制备方法
一般来说,金(III)卟啉-PEG缀合物从前体金(III)卟啉络合物合成,该前体可通过使卟啉分子与金化合物在升高的温度下,例如100℃,在酸性条件下反应来制备[Che, C. M.et al. Chem. Commun.2011, 47, 9554]。金化合物的实例包括氯金酸钾、氯金酸钠等等。卟啉分子的实例包括5-(p-甲基羧基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉、5-羧基苯基-10,15,20-三苯基卟啉、5-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉、5-乙酰氧基苯基-10,15,20-三苯基卟啉、5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉、5,10,15,20-四(p-甲基羧基苯基)-卟啉和5,10,15,20-四乙酰氧基苯基卟啉。
在一个实施方案中,前体络合物与H3CO-PEG~5000-OH在N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并***(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)的存在下,在二氯甲烷中反应形成金(III)卟啉缀合物1。
在另一个实施方案中,前体络合物与H3CO-PEG~5000-NH2•HCl在DCC、HOBt和二异丙基乙基胺(DIPEA)的存在下,在二氯甲烷中反应形成金(III)卟啉缀合物2。
在另一个实施方案中,前体络合物A4与癸二酸(其是间隔基分子)在N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC•HCl)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和三甲胺的存在下,在二氯甲烷中反应形成中间体络合物A10。
然后中间体络合物A10与H3CO-PEG~5000-NH2•HCl在DCC、HOBt和二异丙基乙基胺(DIPEA)的存在下,在二氯甲烷中反应形成金(III)卟啉缀合物5。
2. 使用方法
本文公开的GP缀合物可被用来诱导癌细胞死亡,因而在癌症疗法中有应用。可从本文公开的制剂受益的受试者的非限制性实例包括罹患黑素瘤、白血病、直肠结肠、卵巢癌、鼻咽、肝细胞和肺癌症的患者。缀合物可单独或与如本文描述的其它抗癌治疗剂组合使用。本文公开的制剂可用于具有流出泵-介导的耐药性,例如顺铂和阿霉素抗性癌症的患者。实例显示与无PEG缀合的金(III)络合物,即非-聚乙二醇化金(III)卟啉络合物相比,示例性耐药性细胞系(A2780adr)更好地吸收试验GPP缀合物。另外地,掺有多柔比星的GPP纳米复合材料显示出具有显著减少杀死A2780adr细胞的有效剂量的协同作用。
GPP缀合物,单独或与第二癌症治疗剂组合可通过选择性吸收GPP缀合物的纳米结构进入癌细胞(当与非-癌细胞比较时),用于选择性靶向癌细胞。实例显示,如在本文由结肠和肝细胞示例说明的,当与非聚乙二醇化金(III)卟啉络合物比较时,GPP缀合物更低地被吸收进入非-肿瘤发生组织,导致与进入非-肿瘤发生细胞相比显著更高吸收进入癌细胞。
当与一种以上的化疗剂组合使用时,GPP缀合物的共同递送可以如本文描述的纳米复合材料的形式实现。或者,共同递送可通过联合/混合要共同-递送的一种或多种药剂与GPP缀合物的纳米/微结构实现。
诱导癌细胞的癌细胞死亡(包括但不限于细胞凋亡)的方法包括施用于罹患响应形式的癌症的患者包含有效量的一种或多种金(III)卟啉-PEG缀合物的组合物。金(III)卟啉-PEG缀合物可由以下结构式或其药学上可接受的盐表示:
其中R1-R20如上所述。
在这个实施方案中,优选的缀合物包括其中R1是C(O)O-PEG~5000-OCH3和R2-R20是氢的缀合物(缀合物1);
其中R1是C(O)NH-PEG~5000-OCH3和R2-R20是氢的缀合物(缀合物2);或
其中R1是OC(O)(CH2)8C(O)NH-PEG~5000-OCH3和R2-R20是氢的缀合物(缀合物5)。
在诱导癌细胞的癌细胞死亡(包括但不限于细胞凋亡)的方法中使用本文公开的GP缀合物和一种或多种治疗剂的组合疗法包括施用于罹患响应形式的癌症的患者包含有效量的通过使用本文描述的金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构封装一种或多种治疗剂形成的纳米复合材料的组合物。
在另一个优选的实施方案中,诱导癌细胞死亡的方法包括施用于有需要的患者一种组合物,其包含有效量的多柔比星和金(III)卟啉-PEG缀合物(NC1)或其药学上可接受的盐的纳米复合材料,其中R1是C(O)O-PEG~5000-OCH3和R2-R20是氢。
在另一个实施方案中,提供诱导癌细胞死亡的方法,包括施用于有需要的患者一种组合物,其包含有效量的金(III)卟啉-PEG缀合物(NC4)或其药学上可接受的盐,和具有以下结构式的NHC配体(Pt-1a)的化疗性铂(II)络合物的纳米复合材料,其中R1是C(O)O-PEG~5000-OCH3和R2-R20是氢:
。
以下实施例说明本发明。除非在以下实施例和在说明书和权利要求书中其它地方另外指明,所有等分和百分比均以重量计,所有的温度为摄氏度,和压力在大气压或接近大气压。
实施例
实施例1:金(III)卟啉-PEG缀合物的制备和表征
一般说来,金(III)卟啉前体络合物和金(III)卟啉-PEG缀合物的合成使用标准Schlenk技术,在惰性氮气氛下进行。在环境温度下,用四甲基硅烷(Me4Si)作为内部参考,用Bruker AVANCE 400 (400 MHz)或DPX-300 (300 MHz)傅里叶变换NMR光谱仪记录1H NMR谱。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸与三氟乙酸钠作为基质,在ABI4800 MALDI TOF/TOF™分析仪上记录MALDI-TOF MS。
金(III)卟啉-PEG缀合物1的合成和表征
使络合物A2 (22 mg, 0.026 mmol)、HOBt (2.4 mg, 0.018 mmol)和PEG5000-OCH3 (124mg, 0.025 mmol)溶于无水二氯甲烷中。于0℃搅拌下,将在二氯甲烷中的DCC (5.1 mg,0.025 mmol)加入到溶液混合物中,接着加入三乙胺(7.2 µL, 0.052 mmol)。然后于0℃搅拌溶液混合物2 h,并使之温热至室温和反应5天。在减压下蒸发挥发性溶剂后,使粗产物溶于去离子水,并过滤未溶解的固体。水性溶液用二氯甲烷萃取两次,合并的有机层用稀HCl(aq)溶液洗涤两次,接着用饱和NaCl(aq)溶液洗涤。然后有机层经无水硫酸钠干燥、过滤,并在减压下蒸发。使粗产物溶于最少量的二氯甲烷中,并通过滴加二氯甲烷溶液至***中沉淀为红色的固体。在总共沉淀3次后获得的红色固体通过在中性氧化铝上柱色谱,使用二氯甲烷和甲醇(50:1, v/v)作为洗脱液进一步纯化。获得为红色固体的产物。得量 = 115mg (78%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 298 K,: δ = 3.36 (s, 3H, -CH2CH2℃H 3), 3.44-3.89 (br, -CH 2CH 2O-), 3.98 (t, J = 4.8 Hz, 2H, -CO℃H2CH 2O-), 4.67 (t, J = 4.8Hz, 2H, -CO℃H 2CH2O-), 7.83-7.92 (m, 9H, 苯基H), 8.22-8.24 (m, 6H, 苯基H),8.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H, -C6 H 4COO-), 8.54 (d, J = 8.0 Hz, 2H, -C6 H 4COO-),9.20, (d, J = 5.2 Hz, 2H, 吡咯H), 9.27-9.29 (m, 6H, 吡咯H). MALDI-TOF MS: M n= 5897 g mol-1, M w = 5971 g mol-1, PDI = 1.01。
金(III)卟啉-PEG缀合物2的合成和表征
该步骤类似于缀合物1的步骤,除了使用H3CO-PEG~5000-NH2•HCl (124 mg, 0.025mmol)代替HO-PEG~5000-OCH3。在经柱色谱在中性氧化铝上进一步纯化沉淀后获得的红色固体,使用二氯甲烷和甲醇(50:1, v/v)作为洗脱液。获得为红色固体的产物。得量 = 88 mg(60 %)。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 298 K): δ = 3.38 (s, 3H, -CH2CH2℃H 3), 3.50-3.82(br, -CH 2CH 2O-), 3.88 (br, 4H, -CONHCH 2CH 2O-), 7.83-8.00 (m, 9H, 苯基H), 8.19-8.28 (m, 6H, 苯基H), 8.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H, -C6 H 4CONH-), 8.39 (s, 1H, -CONHCH2CH2O-), 8.53, (d, J = 8.2 Hz, 2H, -C6 H 4CONH-), 9.24-9.38 (m, 8H, 吡咯H). MALDI-TOF MS: M n = 6020 g mol-1。
金(III)卟啉-PEG缀合物5的合成和表征
使金(III)卟啉前体络合物A4 (50 mg, 0.058 mmol)、DMAP (0.89 mg, 7.26 µmol)和癸二酸(58.6 mg, 0.290 mmol)溶于无水二甲基甲酰胺-二氯甲烷溶液混合物(10:1, v/v;20 mL)中。于0℃搅拌下,将在二甲基甲酰胺-二氯甲烷溶液混合物中的EDC•HCl (55.7 mg,0.290 mmol)加入到溶液混合物中,接着加入三乙胺(40.2 µL, 0.290 mmol)。然后于0℃搅拌溶液混合物2 h,使之温热至室温并反应过夜。真空下蒸发挥发性溶剂后,使粗产物溶于二氯甲烷并用稀HCl(aq)溶液洗涤两次,接着用饱和NaCl(aq)溶液洗涤。然后有机层经无水硫酸钠干燥,过滤,并在减压下蒸发。粗产物经硅胶柱色谱纯化,使用二氯甲烷和甲醇(50:3,v/v)作为洗脱液。获得深紫色固体的产物A10,得率70 %。1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298K): δ = 1.30-1.65 (br, 10H, -CH 2-), 1.90 (m, 2H, -C6H4℃(=O)CH2CH 2-), 2.33 (t,J = 7.3 Hz, 2H, -CH2CH 2COOH), 2.77 (t, J = 7.0 Hz, 2H, -C6H4℃(=O)CH 2CH2-),7.62 (d, J = 8.3 Hz, 2H, 苯基H), 7.75-7.95 (m, 9H, 苯基H), 8.18-8.26 (m, 6H,苯基H), 8.29 (d, J = 8.3 Hz, 2H, 苯基H), 9.26-9.33 (m, 6H, 吡咯H), 9.36 (d, J= 6.2 Hz, 2H, 吡咯H)。
金(III)卟啉-PEG缀合物5用前体络合物A10和H3CO-PEG~5000-NH2•HCl之间的反应来合成。步骤类似于缀合物2的步骤,除了使用A10 (27.2 mg, 0.026 mmol)代替A2。获得为红色固体的产物,得率74 %。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 298 K): δ = 1.20-2.21 (br,12H, -CH 2-), 2.40 (br, 2H, -CH2CH 2CONH-), 2.77 (br, 2H, -C6H4℃(=O)CH 2CH2-),3.38 (s, 3H, -CH2CH2℃H 3), 3.40-4.00 (br, -CH 2CH 2O-), 7.43-7.46 (br, 2H, 苯基H), 7.87-7.90 (br, 9H, 苯基H), 8.20-8.32 (br, 8H, 苯基H), 9.29-9.32 (br, 8H,吡咯H)。
实施例2:金(III)卟啉-PEG缀合物的自组装
PEG侧臂赋予金(III)卟啉-PEG缀合物两亲性特性(图3)。因此,它们可在水性介质中,通过非-共价相互作用经历自组装,形成感兴趣的纳米结构。代表性实例是缀合物1和2。通过加入它们的各自的乙腈溶液至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,接着蒸发挥发性溶剂,发现它们形成直径分别约120和200 nm的核心-壳胶束,如通过透射电子显微镜图像所示的。来自1和2的动态光散射(DLS)实验的强度平均信号被发现分别是120.8±7.2 nm和177.1±81.2nm,而1和2的纳米结构的ζ电位是-0.1±1.6 mV和-0.7±4.2 mV。来自DLS实验的强度平均信号与TEM图像中观察到的纳米结构直径的良好一致性提示与1和2的纳米结构的流体动力学直径相对应的信号。另一方面,1和2的纳米结构的几乎中性的ζ电位证实了纳米结构的壳中PEG侧臂的存在。纳米结构核心中的金物质的鉴定得到TEM图像中核心的良好对比和1的纳米结构的能量散射型X-射线(EDX)谱的支持。
实施例3:金(III)卟啉-PEG缀合物显示出控制释放特性
为实现有前景的抗-癌活性,所述缀合物应经历在癌细胞中的水解以释放化疗性金(III)卟啉部分,如此PEG侧臂将不阻止金(III)卟啉部分与它们的治疗靶的结合。因此,研究了在不同的pH值的水性缓冲溶液中,从缀合物释放金(III)卟啉部分的速率。使1和2溶于PBS溶液(pH 7.4)或乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)并于37℃、黑暗中,使用1,000 Da截止膜,对大体积的PBS或乙酸钠缓冲溶液进行透析。在不同时间点释放的金(III)卟啉部分的量通过感应耦合等离子质谱分析(ICP-MS)确定。在PBS溶液中,在6和24 h分别水解1的31 %和60%,而2仅有2 %和3 %的水解产物在相应的时间间隔被发现,且超过89 %的2在96 h时仍未水解。另一方面,发现从1释放金(III)卟啉部分在更酸性的乙酸钠缓冲溶液(pH 4)中更快,分别在6和24 h发现60 %和96 %的水解产物。因为1与2的唯一差别是缀合的键的化学结构,从1的PBS溶液比从2更快释放金(III)卟啉部分应该归因于1中的酯键经历水解裂解的倾向比2中的酰胺键更高。对于从1在更酸性的乙酸钠缓冲溶液中比在PBS溶液中的更快释放,这应该归因于1中酯键的酸-催化的水解,导致在24 h后从缀合物的PEG侧臂的几乎完全裂解。
金(III)络合物在活细胞中的水解通过超高效液相色谱耦合四极飞行时间质谱分析(UPLC-QTOF-MS)研究。结肠癌细胞,HCT116,用1和A1 (2 µM)处理24 h,在UPLC-QTOF-MS分析之前收获并用乙腈-水溶液混合物(3:1, v/v)溶解。用1处理的HCT116的细胞溶胞产物的全离子色谱显示除了在未处理的细胞的色谱中发现的峰外,还具有6.44 min的保留时间的峰。值得注意的是,这个峰在1的乙腈溶液中的全离子色谱中没有发现,而A2的乙腈溶液在其全离子色谱中显示具有几乎相同的保留时间(R f = 6.39 min)的峰。用1处理的HCT116的细胞溶胞产物的选择离子色谱在m/z = 853显示出具有与全离子色谱相同的保留时间(R f = 6.44 min)的峰,而所述峰的质谱显示与[Au(TPP-COOH)]+的质谱相同的同位素模式。对于用A1处理的HCT116的细胞溶胞产物,具有6.42和9.94 min的保留时间的峰被发现于其全离子色谱中,具有分别为853和867的m/z,如通过选择离子色谱揭示的。在6.42和9.94min的峰的MS被发现具有分别与[Au(TPP-COOH)]+和[Au(TPP-COOH3)]+的那些相同的同位素模式。鉴于在用1处理的HCT116的细胞溶胞产物的全离子色谱中,具有保留时间6.44 min的峰在1的乙腈溶液的全离子色谱中缺乏的事实,该峰应该归因于1在HCT116细胞中形成的代谢产物。因为这个峰显示与A2的乙腈溶液的峰几乎相同的保留时间且其质谱揭示与[Au(TPP-COOH)]+的质谱相同的同位素模式,该峰应源自[Au(TPP-COOH)]+的化学物质,提示1的酯键在HCT116细胞中水解,形成[Au(TPP-COOH)]+ (图2)。金(III)卟啉络合物的酯衍生物在HCT116细胞中的酯键的水解被A1的研究进一步证实,其显示具有保留时间6.42 min的峰出现于全离子色谱中,以及峰的质谱与[Au(TPP-COOH)]+的同位素模式的良好一致性。
实施例4:金(III)卟啉-PEG缀合物显示细胞吸收进入人癌细胞比非-肿瘤发生细胞更快
缀合物1、前体络合物A1和Au1a被癌细胞和非-肿瘤发生细胞的吸收通过使用ICP-MS分析经处理的细胞的细胞溶胞产物研究。发现1显示比无PEG缀合的金(III)络合物(即A1和Au1a)更快细胞吸收进入多种癌细胞,例如直肠结肠癌(HCT116)、人卵巢癌(A2780)和耐药性衍生物(A2780adr) (图3A-C)。有趣的是,1吸收进入非-肿瘤发生的结肠和肝细胞(分别为NCM460和MIHA)被发现低于A1和Au1a (图3A和4),导致与进入非-肿瘤发生细胞相比显著更高吸收进入癌细胞(图3C)。另一方面,与吸收A1比较,1吸收进入癌细胞显示对温度的大的依赖性(图3D和5)。基于先前对细胞吸收纳米结构的研究的结果[Davis, M. E. et al.Nat. Rev. Drug Discov. 2008, 7, 771]和1的吸收机制对温度、K+浓度和高渗条件的强烈依赖性(图3D),1的纳米结构可能通过网格蛋白-介导的内吞作用进入活细胞。由于通常癌细胞比正常细胞更高的代谢率,1在癌细胞中显示比非-肿瘤发生细胞更快的积聚(图3A-C)。值得注意的是1在A2780adr细胞中显示随时间推移的增加的浓度,而A1和Au1a揭示在分别孵育0.75和0.5 h后其量减少(图3B)。A1和Au1a在A2780adr细胞中的含量减少可能是由于P-糖蛋白-介导的A2780adr细胞的耐药性,而1在A2780adr细胞中的积聚提示1的纳米结构可能有助于克服A2780adr细胞的流出泵-介导的耐药性。
实施例5:金(III)卟啉-PEG缀合物发挥针对人癌细胞的有效的体外细胞毒性,伴有对非-肿瘤发生细胞的较低毒性
1、2和5对人癌细胞系(HeLa、NCI-H460、HCT116、A2780)和顺铂-和阿霉素-抗性癌细胞系(A2780cis和A2780adr),以及正常人结肠粘膜上皮细胞系(NCM460)、非-肿瘤发生永生化肝细胞(MIHA)和正常肺成纤维细胞(CCD-19Lu)的体外细胞毒性,通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定来评价(表1;图6A)。金(III)卟啉络合物Au1a和前体络合物A1、A4和A10以及临床上批准的化疗剂(顺铂和多柔比星(DOX))的体外细胞毒性也进行了比较研究(表1)。具有酯键的缀合物1和5,Au1a,和前体络合物A1、A4和A10均显示出对癌细胞的优越的体外细胞毒性(与顺铂比较) (1为顺铂的5.1-76.9倍的细胞毒性)。值得注意的是,1和A1保留其杀死耐药性癌细胞,A2780cis和A2780adr的大部分活性,而Au1a、DOX和顺铂被发现显示对A2780adr的更低的细胞毒性(与非-耐药性A2780细胞比较) (表2)。对于非-肿瘤发生细胞,A1、A4、A10和Au1a显示在亚微摩尔范围内的IC50,与报道的金(III)卟啉络合物对正常细胞的高毒性一致。有趣的是,1和5被发现对非-肿瘤发生MIHA和NCM460细胞是相对非-毒性的(表1),如由对非-肿瘤发生细胞的IC50与对癌细胞的IC50的显著更大比值所揭示的(表3和4)。另一方面,具有酰胺键的缀合物2,被发现在体外对癌细胞和非-肿瘤发生细胞二者均为较小的细胞毒性。
1的控制释放特性及其被癌细胞的较高细胞吸收(图3-5)将很可能解释观察到的1对癌细胞比对非-肿瘤发生细胞更高的体外细胞毒性(表3和4)。基于癌细胞的通常较高的代谢速率,1的纳米结构显示在癌细胞中比非-肿瘤发生细胞的更快的积聚。较高的代谢速率,与癌细胞的酸性特性一起,将有利于1的水解,导致抗-癌金(III)卟啉部分在癌细胞中的较高的释放速率。另一方面,在非-肿瘤发生细胞中的1将不太容易水解,而不水解的金(III)卟啉-PEG缀合物将显示低毒性,如由具有较少能裂解的酰胺键的2的MTT测定所支持的。这将归因于抑制金(III)卟啉部分与其分子靶的相互作用的PEG侧臂的立体体积,导致缀合物比水解产物低得多的体外细胞毒性。结果,PEG侧臂的较高吸收进入癌细胞和可能更快的水解裂解将解释1比非-肿瘤发生细胞更有效地杀死癌细胞(图6A和6B;表1、3和4)。
对于无PEG缀合的金(III)卟啉络合物,即A1和Au1a,它们表现出对癌细胞和非-肿瘤发生细胞二者的高体外细胞毒性(表1、3和4)。这可通过它们类似细胞吸收进入癌细胞和非-肿瘤发生细胞(图3A-C和4),导致非-选择性地杀死癌细胞和非-肿瘤发生细胞来解释。
表1.1、2、5、A1、A4、A10、Au1a、DOX、1和DOX (NC1)的纳米复合材料,和顺铂的体外细胞毒性
a 体外细胞毒性在活细胞与化合物一起孵育72 h时,通过MTT测定法测定。 b 未测定。
表2 对A2780细胞和耐药性A2780cis和A2780adr细胞的体外细胞毒性的差异
a 通过A2780cis细胞的IC50 / A2780细胞的IC50测定。 b 通过A2780adr细胞的IC50 /A2780细胞的IC50测定。
表3 1、2、A1和Au1a对癌细胞和NCM460细胞的相对毒性
a 通过非-肿瘤发生NCM460细胞的IC50 /癌细胞的IC50测定。
表4 1、2、A1和Au1a对癌细胞和MIHA细胞的相对毒性
a 通过非-肿瘤发生MIHA细胞的IC50 /癌细胞的IC50测定。
为了获得关于1对癌细胞的较高细胞毒性的更多了解,对由1和Au1a诱导的HCT116和NCM460细胞(它们分别是结肠癌细胞和结肠正常细胞)的细胞凋亡的时间-依赖性测定,使用CellEvent胱天蛋白酶-3/7 Green ReadyProbes试剂进行。CellEvent胱天蛋白酶-3/7Green ReadyProbes试剂在活细胞中是不发光的,但在胱天蛋白酶-3/7 (其是细胞凋亡的早期指示物)的细胞激活时,显示强烈的绿色荧光。与CellEvent胱天蛋白酶-3/7 GreenReadyProbes试剂和1的纳米结构(2 µM)一起孵育的HCT116细胞的荧光显微镜图像揭示在15 h后诱导细胞凋亡和在48 h后的显著凋亡事件,而Au1a (2 µM)在12 h后诱导HCT116细胞的细胞凋亡并在与Au1a一起孵育32 h后发现大群凋亡的HCT116细胞。另一方面,与Au1a(2 µM)一起分别孵育20和32 h后发现NCM460细胞的细胞凋亡的诱导和大量的凋亡事件。有趣的是,1 (2 µM)不导致NCM460细胞的细胞凋亡的显著诱导,如由一些显示绿色荧光的细胞和明视野图像中观察到的细胞形态学所支持的。用1处理24和36 h的HCT116细胞的流式细胞术分析揭示细胞总群体的35.83和43.83% (通过扣除阴性对照中发现的凋亡细胞的百分比校正)是凋亡的,而总群体的1.96和10.6%显示出晚期凋亡事件。相反,1对NCM460细胞的毒性较少,在分别孵育24和36 h后发现100.9和90.14%成活力。Au1a (2 µM)在HCT116和NCM460细胞中均诱导大量的凋亡事件。与用1处理相同时间间隔的那些相比,较少群体的活NCM460细胞(在分别孵育24和36 h后为61.14和56.64% [校正])被发现。
因为1被发现显示比Au1a更快细胞吸收进入HCT116细胞(图3A和3C),与Au1a相比,由1在更长的孵育时间后诱导细胞凋亡指示1诱导HCT116细胞的胱天蛋白酶-3/7激活的时滞。这可通过在显示其抗-癌特性之前,1经历酯键的水解裂解所需的时间合理解释。尽管如此,1和Au1a (2 µM)二者可在48 h后诱导大群体的HCT116细胞的凋亡,提示1易于在HCT116细胞中水解并由1有效杀死这些结肠癌细胞。对于正常结肠NCM460细胞,Au1a (2 µM)在孵育20 h后诱导它们的凋亡,其稍长于在HCT116细胞中发现的孵育时间,部分是由于其被NCM460细胞缓慢吸收(图3A和C)。在1孵育甚至72 h后,NCM460细胞中的胱天蛋白酶-3/7显著激活的缺乏除了由于NCM460细胞的低代谢速率减慢了1的PEG侧臂的水解裂解外,还可用低的细胞吸收合理解释(图3A和C)。结果,1被发现对结肠癌HCT116细胞显示有效的体外细胞毒性,而对结肠正常NCM460细胞具有低毒性。
1的选择性诱导HCT116细胞超过NCM460细胞的凋亡使用FITC-Annexin V染色来进一步研究。磷脂酰丝氨酸残基,其位于正常活细胞的细胞膜的胞质表面上,将易位到凋亡细胞中的外质膜。然后这些外化磷脂酰丝氨酸残基可与FITC-Annexin V结合,产生来自FITC-Annexin V染色的绿色荧光,因而允许通过荧光显微术和流式细胞术检测凋亡事件。HCT116细胞与1和Au1a (2 µM)一起孵育24 h被发现显示来自FITC-Annexin V的绿色荧光,以及来自碘化丙啶(其是坏死性细胞的指示剂)的红色荧光。用Au1a处理的NCM460细胞也被发现显示分别来自FITC-Annexin V和碘化丙啶的绿色和红色荧光,虽然只有小群体的NCM460细胞在1孵育相同的时间间隔后显示绿色荧光。在用1和Au1a处理后,用FITC-Annexin V染色的凋亡细胞的量通过流式细胞术研究。使用来自HCT116和NCM460细胞的绿色荧光作为阴性对照,在1和Au1a孵育24 h后的凋亡HCT116细胞的百分率被发现分别是22.5和39.6 %,而NCM460细胞在用1和Au1a分别处理后,发现其2.4和39.3 %经历细胞凋亡。基于荧光显微术和流式细胞术的结果,Au1a被发现有效诱导HCT116和NCM460细胞二者的凋亡。另一方面,1被发现在孵育24 h后,对结肠正常NCM460细胞几乎是非-毒性的,但保留在结肠癌HCT116细胞中诱导凋亡事件的活性。这进一步提示了金(III)卟啉络合物通过PEG缀合和形成纳米结构对正常细胞的显著减少的毒副作用,证实1作为具有最小副作用的抗-癌治疗剂的潜力。
实施例6:金(III)卟啉-PEG缀合物在共同培养细胞模型中显示选择性诱导人结肠癌细胞超过人结肠非-肿瘤发生细胞的凋亡
金(III)卟啉-PEG缀合物选择性地诱导HCT116细胞超过非-肿瘤发生NCM460细胞的细胞凋亡的能力通过HCT116和NCM460的共同培养细胞模型进一步研究。为区分两个不同的细胞系,NCM460细胞在其与HCT116细胞共同培养之前用发蓝色光的CMF2HC染料预处理。共同培养模型用缀合物1处理24 h,流式细胞术分析揭示基于来自DAPI通道的检测的两个群体(58.5和41.5 %),指示甚至在细胞与1一起孵育后也能成功区分两个不同的细胞系。另一方面,用1处理24 h的共同培养模型用FITC-Annexin V和碘化丙啶染色,并通过荧光显微术成像。绿色和红色荧光主要在未显示出蓝色发光的细胞,即HCT16细胞中观察到。共同培养模型的凋亡细胞的量也用流式细胞术测定;HCT116和NCM460细胞在与1 (2 µM)一起孵育24 h后被发现分别有29.6和6.3 %经历细胞凋亡。荧光显微术和流式细胞术二者的结果支持1在癌细胞和正常细胞的共同培养模型中对杀死结肠癌细胞的高选择性。
用胱天蛋白酶-3/7 Green试剂染色分别用1和Au1a (2 µM)处理的HCT116和NCM460细胞的共同培养物,显示出与用FITC-Annexin V染色的实验的那些类似的结果。用1处理并用胱天蛋白酶-3/7 Green试剂染色的共同培养模型的荧光显微术图像显示来自HCT116细胞的强烈绿色荧光,而只有小群体的具有蓝色发光的细胞,即NCM460细胞,显示绿色荧光。另一方面,在共同培养模型中大群体的NCM460细胞在与Au1a (2 µM)一起孵育24和36 h后显示绿色荧光。在用1和Au1a处理24 h后,共同培养模型中的凋亡HCT116和NCM460细胞群体百分比经流式细胞术分析(基于阴性对照实验校正)被发现分别是25.3和4.1%,和54.6和29.3%。合起来,数据指示Au1a对HCT116和NCM460细胞二者的高细胞毒性,而1在共同培养中对HCT116细胞发挥超过NCM460细胞的选择性诱导细胞凋亡作用。
为确保结果不是由于CMF2HC染料对共同培养的影响,准备两个细胞系的另一个共同培养,其中用CMF2HC染料预处理HCT116细胞,因而它们在365 nm激发时将显示蓝色荧光。用1处理24 h的这种共同培养模型的HCT116和NCM460细胞分别有25.04和5.01%经历细胞凋亡,如通过胱天蛋白酶-3/7 Green试剂染色和流式细胞术分析所测定的。这证实在共同培养模型中,1优先诱导HCT116细胞超过NCM460细胞的凋亡,而不管蓝色发射的CMF2HC染料的作用(如果有任何作用的话)。
实施例7:金(III)卟啉-PEG缀合物对卵巢肿瘤异种移植物的体内生长抑制
用1处理携带A2780异种移植物的裸鼠16天导致肿瘤重量的显著减少,具有对于静脉内分别注射2和4 mg/kg的1的p < 0.05和< 0.01 (图7)。更重要地,用1 (4 mg/kg)治疗的小鼠在1周内未观察到生理疾病。这提示1的有前景的体内抗-癌特性及最小毒性。
实施例8:具有最小全身毒性的金(III)卟啉-PEG缀合物对结肠肿瘤异种移植物的体内生长抑制
通过静脉内注射,用1 (2或4 mg/kg)治疗携带HCT116异种移植物的裸鼠24天,导致肿瘤重量(分别为35和53%;p < 0.01, n = 8;图8A)和肿瘤体积(分别为41和58%;p < 0.01,n = 8;图8B)的显著减少,且没有小鼠死亡或体重的显著损失(图8C)。经治疗小鼠的组织的组织病理学分析揭示,用1治疗后,在肺、肝、肾、心和脾中未观察到显著的异常。1的低全身毒性得到用1 (4 mg/kg;图9A-H)治疗后裸鼠的血液生物化学进一步的支持;经治疗小鼠的几种器官损害指示物,包括丙氨酸转氨酶(ALT)、球蛋白(GLB)、血脲氮(BUN)和肌酸激酶(CK)的血浆水平低于未治疗的携带HCT116异种移植物的小鼠的那些(p < 0.05;图9A、C、D、F),并落入无异种移植物小鼠的那些的统计相关的范围内。此外,[Au(TPP-COOH)]+被发现于用1治疗的小鼠肿瘤组织的UPLC-QTOF-MS中,支持1体内水解的倾向。
另一方面,静脉内注射A1 (4 mg/kg)至携带HCT116异种移植物的裸鼠导致肿瘤重量和肿瘤体积的显著减少(分别为49和56%;p < 0.01, n = 8;图8A、B)。然而,需要较高浓度的A1以实现与用1治疗发现的类似的肿瘤生长抑制(4.43 mmol/kg对比0.68 mmol/kg),提示1的更有效的抗-肿瘤作用。肿瘤切片的免疫组织化学分析进一步支持1超越A1的优越抗-肿瘤活性。核异型和有丝***的有效消除在用1 (4 mg/kg)治疗小鼠后观察到,但用A1(4 mg/kg)治疗时未观察到。这与更显著地抑制Ki67和VEGFR2的表达一起,通过1增加p53的表达和提高DNA片段化(从TUNEL染色),证实1可有效地减少癌细胞增殖和在体内诱导癌细胞的凋亡。更重要的是,与1的低全身毒性形成对比,用A1 (4 mg/kg)治疗后,组织病理学分析显示正常肺、肝和肾组织中的损害。显著肺部的肺泡出血和肺泡壁增厚被发现。此外,凋亡的肝细胞和肿胀的肾上皮细胞被发现,导致随后的肾小管的萎缩。用A1治疗的小鼠的血液生物化学指示小鼠的肺、肝和肾的显著损害(图9A-H)。1的较低全身毒性可通过与A1和Au1a相比,1在以其有效剂量治疗的小鼠器官中的较低积聚解释(图10)。
经历单剂量静脉内注射相同摩尔量的金化合物的HCT116异种移植裸鼠的体内生物分布研究在治疗后24 h显示,与用Au1a (达3.3-倍)或A1 (达2.0-倍)治疗的小鼠比较,1在肿瘤中的积聚更高(经ICP-MS分析测定) (图11)。因为在1-治疗的小鼠的肝、脾、肺、肾和心中发现较低金含量,1显示比Au1a或3显著更高的肿瘤与器官比率(图11B)。这可归因于1的纳米结构,其可通过EPR作用导致体内肿瘤积聚。
实施例9:金(III)卟啉-PEG缀合物在体内抑制耐顺铂卵巢肿瘤异种移植物的生长
为进一步研究1治疗在临床应用中应具有很大的重要性的耐药性肿瘤的能力,用1对携带耐顺铂A2780cis异种移植物的裸鼠进行体内抗肿瘤实验。在用1 (4 mg/kg,每2-3天静脉内注射,持续13天;n = 5;图12A)治疗小鼠后,发现肿瘤体积减少超过52% (p < 0.05),没有小鼠死亡或体重的显著损失(图12B)。这提示1可用于开发治疗耐药性肿瘤的抗癌剂。
实施例10:通过金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构封装多柔比星以形成纳米复合材料
由于实现强烈的杀死癌细胞的协同作用和防止或最大限度地减少耐药性的产生,因而改进治疗功效及减少不希望的副作用的可能性,治疗剂的共同递送对于抗-癌治疗将是有利的。鉴于由1形成的感兴趣的纳米结构,如由细胞吸收实验(图3B)提示的其克服A2780adr细胞的流出泵-介导的耐药性的能力和纳米结构对正常细胞比对癌细胞的相对低的毒性,这些促使发明人将1的纳米结构用于封装其它治疗剂以供共同递送。多柔比星(DOX),其已被临床上批准用于治疗卵巢癌和多发性骨髓瘤,当它被单独施用时,显示出严重的心脏毒性。此外,由于P-糖蛋白(其是流出泵的实例),多柔比星抗性在一些癌细胞系,例如A2780adr中产生。因此,多柔比星被封装在1的纳米结构中并测试针对癌细胞的活性。
用1的纳米结构封装DOX通过将1 (2.5 mg)和DOX (0.18 mg)的乙腈溶液纳米沉淀至PBS溶液中进行。在1和DOX (NC1)的纳米复合材料的TEM图像中观察到约120 nm的纳米结构。DLS实验和ζ电位测量的曲线图表明NC1的纳米结构分别具有122.1±13.4 nm的流体动力学半径和-2.5±1.6 mV的ζ电位,类似于1的纳米结构的那些。NC1中的金含量用EDX确认。由于1和DOX的UV-vis吸收光谱的显著重叠(这阻碍了通过它们的UV-vis吸收特性在纳米复合材料中的1和DOX的量化),NC1中的1的浓度经ICP-MS实验测定。另一方面,NC1中的DOX浓度通过与检测用光电二极管阵列偶联的UPLC测量,使用柔红霉素盐酸盐作为内部标准。从两个实验的结果,在NC1中的1与DOX的摩尔比以及DOX由1封装的效率被发现分别是7:1和16.5 % (表5)。
表5 1和DOX的纳米复合材料的理化特性
a 1在纳米复合材料中的浓度经ICP-MS测定。 b DOX在纳米复合材料中的浓度通过与光电二极管阵列检测器偶联的UPLC测量,使用柔红霉素盐酸盐(3.6 µM)作为内部标准。
具有不同的进料比的1和DOX的纳米复合材料也通过使用相同量的1但不同浓度的DOX制备。DOX与1的进料比的增加被发现增加进入纳米复合材料的DOX的载荷(表5),如由UPLC实验所支持的。然而,伴随着DOX与1的进料比的增加,封装效率的减少也被发现(表5)。对于具有不同的DOX载荷的纳米复合材料,它们被发现显示彼此类似的大小和表面电荷,如通过DLS和ζ电位测量反映的(表5)。
实施例11:金(III)卟啉-PEG缀合物和多柔比星的纳米复合材料对杀死人癌细胞的协同作用
基于体外MTT测定,DOX被发现在杀死癌细胞和非-肿瘤发生细胞中是非常有效的(表1)。因此,期望不是太高载荷的DOX进入1的纳米结构可用于抗-癌目的,以维持对非-肿瘤发生细胞的低毒性。与DOX的较高封装效率一起,选择NC1以供体外细胞毒性研究。NC1被发现比单独1的纳米结构或单独DOX更有效地杀死癌细胞(表1;图13A和13B)。例如,如通过从CellEvent胱天蛋白酶-3/7 Green ReadyProbes试剂的绿色发光所揭示的,NC1 ([1] =3.5 µM和[DOX] = 0.5 µM)可能在孵育18 h后诱导HCT116细胞的细胞凋亡,而30 h孵育对于由DOX单独显著诱导HCT116细胞的凋亡是需要的(图14A和14B)。有趣的是,NC1显示比单独施用DOX对非-肿瘤发生MIHA和NCM460细胞更低的毒性(表1;图13A)。NC1的体外细胞毒性也与1的纳米结构和DOX的混合物的体外细胞毒性作了比较。发现1的纳米结构和DOX的混合物对HeLa细胞显示出比任何单一组分更高的细胞毒性,但发现与NC1比较相对更少的有效性(表6)。观察到的细胞毒性通过组合指数(CI)进一步评价,CI可描述药物组合的作用。通过对于不同的反应顺序和机理和不同类型的抑制的数学归纳法和演绎,在平衡-稳态从质量作用定律原理推导的中效方程已表明是Michaelis-Menten方程、Hill方程、Henderson-Hasselbalch方程和Scatchard方程的统一理论。显示剂量和效应通过定义参数是可以互换的。这种单一药物效应的通用方程扩展至n种药物的多重药物效应方程。这些方程提供使药物相互作用定量测定的组合指数(CI)-等效线图解方程的理论基础,其中CI < 1、= 1和> 1分别表示协同作用、加合作用和拮抗作用。[Chou, et al. Pharmacol. Rev. 2006, 58,621]基于通过CompuSyn计算的在药物组合的IC50的CI值,NC1以及1的纳米结构和DOX的混合物均显示杀死HeLa细胞的协同作用,前者是更有效的。协同作用可源自DOX与金(III)卟啉络合物不同的分子靶和/或作用机制。DNA应该是DOX的主要的靶,而金(III)卟啉络合物被发现通过胱天蛋白酶-依赖性和胱天蛋白酶-非依赖性线粒体死亡途径二者导致线粒体电位的消耗和细胞凋亡的诱导。这些不同的作用模式将允许通过共同递送杀死HeLa细胞的超-加合作用。对于在NC1中观察的比1和DOX的混合物更强的协同作用,这可归因于两种化疗剂从NC1同步递送至HeLa细胞。
表6 1和DOX的药物组合在HeLa、A2780adr和MIHA细胞分别孵育72 h后的体外细胞毒性
实施例12: 用金(III)卟啉-PEG缀合物和多柔比星的纳米复合材料克服A2780adr细胞的流出泵-介导的耐药性
由于A2780adr细胞中的流出泵,DOX显示对A2780adr细胞的细胞毒性为非-耐药性A2780细胞的1/15 (表1)。鉴于1的纳米结构在A2780adr细胞中随时间推移的积聚(其提示克服流出泵-介导的耐药性的可能性) (图3B),已经进行从施用NC1和单独DOX由A2780adr细胞的DOX的细胞吸收实验。在分别孵育14和24 h后,根据使用UPLC-QTOF-MS的细胞溶胞产物的分析,DOX以NC1的形式被A2780adr细胞的吸收被发现是60.2和82.7 µg/g蛋白(图14B)。另一方面,在用DOX分别孵育14和24 h后,33.9和27.8 µg DOX/g蛋白被发现于A2780adr细胞的细胞溶胞产物中,和这些值为在孵育NC1相同的时间间隔后发现的那些值的1/1.8和1/3 (图14B)。这表示A2780adr细胞中的DOX含量的显著增加可通过施用NC1实现,证实NC1作为DOX的纳米载体起作用以克服耐药性的能力。
NC1以及1的纳米结构和DOX的混合物的体外细胞毒性也通过MTT测定来研究(表6;图13A和13B)。从药物组合的IC50计算的CI值,A2780adr细胞与1和DOX的共同孵育(CI =0.75)导致适度的协同作用,而NC1显示具有杀死A2780adr细胞的有效剂量显著减少的协同作用(CI = 0.47)。在NC1中发现的比1和DOX的混合物高得多的功效不应仅仅归因于如在HeLa细胞的研究中观察到的同时递送两种化疗剂(表6)。鉴于用NC1的纳米结构克服流出泵-介导的耐药性(图3B),DOX在从与NC1一起孵育的A2780adr细胞中的较高积聚(图14A)将有利于杀死A2780adr细胞。与药物组合带来的协同作用一起,对耐药性癌细胞的优越抗-癌特性可通过使用1的纳米结构封装DOX来实现。
实施例13:金(III)卟啉-PEG缀合物和多柔比星的纳米复合材料显示对非-肿瘤发生MIHA细胞的毒性显著减少
值得注意的是,NC1中的DOX对非-肿瘤发生MIHA细胞的IC50显著高于从单独施用DOX发现的IC50 (图14A;表1和6),甚至在1的纳米结构存在下(1对MIHA细胞是相当非-毒性的,其IC50为14.5 µM)。这提示通过使用1的纳米结构封装,DOX对非-肿瘤发生细胞的毒性减低。与如上所述的针对癌细胞的功效改进一起(表1和6;图13A和13B),NC1显示与单独施用DOX比较,对杀死癌细胞超过非-肿瘤发生细胞的卓越选择性(表7)。杀死一些癌细胞超过非-肿瘤发生NCM460细胞的选择性的类似改进也在NC1与单独DOX比较的研究中观察到(表8)。另一方面,与NC1比较,1和DOX的混合物显示出对MIHA细胞高得多的毒性(表6)。在1和DOX的混合物中发现对杀死MIHA细胞的轻微协同作用(0.86),而NC1显示杀死MIHA细胞的“强烈拮抗作用” (CI = 4.9),其完全不同于使用HeLa和A2780adr细胞的NC1的研究。
表7 通过单独施用DOX和施用NC1,DOX对癌细胞和MIHA细胞的相对毒性
a 通过非-肿瘤发生MIHA细胞的IC50 /癌细胞的IC50测定。NC1中的络合物1的细胞毒性未被考虑在内。
表8 通过单独施用DOX和施用NC1,DOX对癌细胞和NCM460细胞的相对毒性
a 通过非-肿瘤发生NCM460细胞的IC50 /癌细胞的IC50测定。NC1中的络合物1的细胞毒性未被考虑在内。
为合理解释NC1对MIHA细胞的较低毒性,NC1通过MIHA和癌细胞的细胞吸收已通过ICP-MS进行研究(图3B和4)。在与NC1一起孵育2 h后,A2780和A2780adr细胞中的金含量分别是MIHA细胞的金含量的2.6-和2.0-倍。这提示NC1进入MIHA细胞的较低细胞吸收,因此预期在MIHA细胞中的DOX浓度比在A2780和A2780adr细胞中的浓度更低。另一方面,MIHA细胞与1和DOX的共同孵育不应导致DOX的细胞吸收率的显著改变。结果,由于DOX与1不同的分子靶和/或作用机制,1和DOX的混合物显示杀死MIHA细胞的轻微的协同作用,类似于HeLa和A2780adr细胞的研究(表6)。对于NC1,其对MIHA细胞的毒性较低,如通过明显的“强烈拮抗作用”所反映的(表3),其应该是由于通过从1的纳米结构的封装,而不是来自DOX和1的真正的拮抗作用来减少DOX细胞吸收。
实施例14:由金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构封装铂(II) NHC络合物以形成纳米复合材料
进行由金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米结构对抗-癌金属络合物的封装。Pt-1a和1的纳米结构被发现显示杀死HeLa细胞的协同作用,如由在共同孵育实验中发现的CI值所支持的(表9)。因此,制备1和Pt-1a的纳米复合材料。因为Pt-1a显示在270 nm的强烈的UV-vis吸收,同时在这个区域的可忽略的吸收在1的PBS溶液中观察到(图15),被1封装Pt-1a的效率和Pt-1a与1在纳米复合材料中的摩尔比通过UV-vis吸收实验测定,并被发现分别是11.7 %和1:9。
表9 在HeLa细胞孵育72 h后,1和Pt-1a的药物组合的体外细胞毒性和组合指数(CI)
关于给定特征的任何数字或数值范围,来自一个范围的数字或数值可与来自相同特性的不同范围的另一个数字或参数组合,以生成一个数值范围。
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除非另外限定,用于本文的全部技术和科学术语具有所公开的方法和组合物所属领域技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的方法和组合物,描述了特别有用的方法、装置和材料。本文引用的出版物和它们引用的材料通过参考而特别并入本文。本文不应视为承认由于先前的发明,本发明无权先于这样的公开内容。不承认有任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述说明了它们的作者的断言,和申请人保留挑战所引用文件的准确性和相关性的权利。应该清楚地理解,虽然许多出版物在本文被提及,这样的参考文献不构成承认任何这些文件形成本领域的公知常识的一部分。
虽然材料、组合物、组分、步骤、技术等等的描述可包括许多选项和替代,这不应视为,且不认可这样的选项和替代彼此是等同的或者,特别是明显的替代。因此,例如,不同的取代基的列表并不表明所列的取代基彼此是明显的,也不承认等同或显而易见。
本文公开的每一种化合物、缀合物、络合物和组合物打算为并应被视为在此具体公开。此外,在本公开内容中可被鉴定的每一个亚组(包括各个化合物、缀合物、络合物和组合物)打算为并应被视为在此具体公开。结果,特别考虑到任何化合物、缀合物、络合物和组合物,或化合物、缀合物、络合物和组合物的亚组可被特别包括在使用内或者从使用中排除,或者包括在化合物、缀合物、络合物和组合物的列表内或者从化合物、缀合物、络合物和组合物的列表排除。例如,作为一个选项,络合物的基团被考虑,其中每个络合物如本文描述,但不是络合物A3、A6或A7。作为另一个实例,缀合物的基团被考虑,其中每个络合物如本文描述,但不是缀合物3、6或7。作为另一个实例,络合物和组合物的基团被考虑,其中每个络合物和组合物如本文描述且能够在受试者中诱导癌细胞的细胞凋亡。作为另一个实例,缀合物的基团被考虑,其中每个缀合物如本文描述且能够封装一种或多种抗-癌化疗剂(因而形成用于共同递送的纳米复合材料)。络合物Au1a、络合物A1、络合物A2、络合物A3、络合物A4、络合物A5、络合物A6、络合物A7、络合物A8、络合物A9、络合物A10、络合物A11、缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物5和缀合物6可独立和具体包括在本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中或从本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中排除。例如,络合物Au1a、络合物A1和络合物A2可具体包括在本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中或从本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中排除。作为另一个实例,缀合物1和缀合物2可具体包括在本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中或从本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中排除。作为另一个实例,络合物Au1a、络合物A1、络合物A2、缀合物1和缀合物2可具体包括在本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中或从本文公开的化合物、缀合物和组合物和方法中排除。
本领域的技术人员将认识到,或能够使用不超过常规的实验确定,本文所述的方法和组合物的特定实施方案的许多等同物。这样的等同物意欲由以下的权利要求书涵盖。
Claims (24)
1.一种在有需要的受试者中诱导癌细胞死亡的方法,其包括
将一种组合物施用于所述受试者,所述组合物包含有效量的具有以下结构式的一种或多种金(III)卟啉-PEG缀合物:
或其药学上可接受的盐,从而所述组合物在所述受试者中诱导癌细胞的凋亡,
其中:
X独立地为药学上可接受的抗衡离子;
A1、A2、A3和A4独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基,其中,任选和独立地,至少一个An与Bn(如果Bn不是C0)或Pn (如果Bn是C0)形成共价键;
B1、B2、B3和B4独立地为C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;和
P1、P2、P3和P4独立地为氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG),其中,任选和独立地,至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
2.权利要求1的方法,其中金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构。
3.权利要求1的方法,其中金(III)卟啉-PEG缀合物封装一种或多种抗-癌化疗剂,从而形成用于共同递送的纳米复合材料。
4.权利要求3的方法,其中抗-癌化疗剂之一是多柔比星,或是含N-杂环碳烯(NHC)配体的d8金属络合物,其具有以下结构式:
其中:
M是Au、Pt或Pd;
R1是氢或苯基;
R2和R3各自是氢或一起为-CH-CH-CH-CH-;
R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9各自独立地选自-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C5H11、-C6H13、苄基、(2-羟基)乙基、苯基、萘-2-基甲基和(2-苯基)乙基;
n是+1或+2;
y是+1或+2;
A是抗衡离子或药学上可接受的阴离子;
b是-1或-2;和
X、Y和Z各自独立地为碳或氮。
5.权利要求4的方法,其中:
M是Pt;
R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9是-C4H9;
n是+1;
yAb是CF3SO4 –;
X是碳;和
Y和Z各自是氮。
6.权利要求1的方法,其中:
A1是-C6H4C(=O)-或-C6H4O-;
B1是C0或-C(=O)(CH2)8C(=O)-;和
P1是-O-PEG-OCH3或-NH-PEG-OCH3。
7.权利要求6的方法,其中:
P1是-O-PEG~5000-OCH3或-NH-PEG~5000-OCH3。
8.权利要求6的方法,其中:
A2、A3和A4各自为芳基;
B2、B3和B4各自为C0;
P2、P3和P4各自是氢;和
任选地,X是氯离子。
9.权利要求8的方法,其中金(III)卟啉-PEG缀合物封装一种或多种抗-癌化疗剂,从而形成用于共同递送的纳米复合材料,
其中抗-癌化疗剂是多柔比星,或含NHC配体的d8金属络合物,其具有以下结构式:
其中:
M是Au、Pt或Pd;
R1是氢或苯基;
R2和R3各自是氢或一起为-CH-CH-CH-CH-;
R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9各自独立地选自-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C5H11、-C6H13、苄基、(2-羟基)乙基、苯基、萘-2-基甲基和(2-苯基)乙基;
n是+1或+2;
y是+1或+2;
A是抗衡离子或药学上可接受的阴离子;
b是-1或-2;和
X、Y和Z各自独立地为碳或氮;
或
其中:
M是Pt;
R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9是-C4H9;
n是+1;
yAb是CF3SO4 –;
X是碳;和
Y和Z各自是氮。
10.权利要求1的方法,其中所述受试者患有选自直肠结肠癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤、耐顺铂癌症和耐阿霉素癌症的癌症。
11.一种靶向递送治疗剂至受试者中的癌细胞的方法,其包括
将治疗剂封装在纳米结构或微结构中,所述结构包含一种或多种具有以下结构式的金(III)卟啉-PEG缀合物:
或其药学上可接受的盐,其中金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构,从而形成包含治疗剂和金(III)卟啉-PEG缀合物的纳米复合材料,
其中:
X独立地为药学上可接受的抗衡离子;
A1、A2、A3和A4独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基,其中,任选和独立地,至少一个An与Bn(如果Bn不是C0)或Pn (如果Bn是C0)形成共价键;
B1、B2、B3和B4独立地为C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;和
P1、P2、P3和P4独立地为氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG),其中,任选和独立地,至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
12.权利要求11的方法,其中治疗剂之一是多柔比星,或含NHC配体的d8金属络合物,其具有以下结构式:
其中:
M是Au、Pt或Pd;
R1是氢或苯基;
R2和R3各自是氢或一起为-CH-CH-CH-CH-;
R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9各自独立地选自-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C5H11、-C6H13、苄基、(2-羟基)乙基、苯基、萘-2-基甲基和(2-苯基)乙基;
n是+1或+2;
y是+1或+2;
A是抗衡离子或药学上可接受的阴离子;
b是-1或-2;和
X、Y、Z各自独立地为碳或氮。
13.权利要求12的方法,其中:
M是Pt;
R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9是-C4H9;
n是+1;
yAb是CF3SO4 –;
X是碳;和
Y和Z各自是氮。
14.权利要求11的方法,其中:
A1是-C6H4C(=O)-或-C6H4O-;
B1是C0或-C(=O)(CH2)8C(=O)-;和
P1是-O-PEG-OCH3或-NH-PEG-OCH3。
15.权利要求14的方法,其中:
P1是-O-PEG~5000-OCH3或-NH-PEG~5000-OCH3。
16.权利要求14的方法,其中:
A2、A3和A4各自为芳基;
B2、B3和B4各自为C0;
P2、P3和P4各自是氢;和
任选地,X是氯离子。
17.一种在有需要的受试者中诱导癌细胞死亡的组合物,其包含有效量的一种或多种具有以下结构式的金(III)卟啉-PEG缀合物:
或其药学上可接受的盐,其中金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构,且其中,当施用于需要诱导癌细胞死亡的受试者时,组合物可诱导癌细胞的凋亡,
其中:
X独立地为药学上可接受的抗衡离子;
A1、A2、A3和A4独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基,其中,任选和独立地,至少一个An与Bn(如果Bn不是C0)或Pn (如果Bn是C0)形成共价键;
B1、B2、B3和B4独立地为C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;和
P1、P2、P3和P4独立地为氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG),其中,任选和独立地,至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
18.权利要求17的组合物,其还包含一种或多种抗-癌化疗剂,其中金(III)卟啉-PEG缀合物封装所述一种或多种抗-癌化疗剂,从而形成用于共同递送的纳米复合材料。
19.权利要求18的组合物,其中抗-癌化疗剂之一是多柔比星,或含NHC配体的d8金属络合物,其具有以下结构式:
其中:
M是Au、Pt或Pd;
R1是氢或苯基;
R2和R3各自是氢或一起为-CH-CH-CH-CH-;
R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9各自独立地选自-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C5H11、-C6H13、苄基、(2-羟基)乙基、苯基、萘-2-基甲基和(2-苯基)乙基;
n是+1或+2;
y是+1或+2;
A是抗衡离子或药学上可接受的阴离子;
b是-1或-2;和
X、Y、Z各自独立地为碳或氮。
20.权利要求19的组合物,其中:
M是Pt;
R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自是氢;
R6和R9是-C4H9;
n是+1;
yAb是CF3SO4 –;
X是碳;和
Y和Z各自是氮。
21.权利要求18的组合物,其中:
A1是-C6H4C(=O)-或-C6H4O-;
B1是C0或-C(=O)(CH2)8C(=O)-;和
P1是-O-PEG-OCH3或-NH-PEG-OCH3。
22.权利要求21的方法,其中:
P1是-O-PEG~5000-OCH3或-NH-PEG~5000-OCH3。
23.权利要求18的组合物,其中:
A2、A3和A4各自为芳基;
B2、B3和B4各自为C0;
P2、P3和P4各自是氢;和
任选地,X是氯离子。
24.一种具有以下结构式的金(III)卟啉-PEG缀合物:
或其药学上可接受的盐,其中金(III)卟啉-PEG缀合物在水性介质中经历自组装成为纳米结构,且其中,当施用于需要诱导癌细胞死亡的受试者时,组合物可诱导癌细胞的凋亡,
其中:
X独立地为药学上可接受的抗衡离子;
A1、A2、A3和A4独立地为芳基或用以下取代基取代的芳基:卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酯、羰基、甲酰基、硫羟基、烷硫基、磺酰基、磺酸、叠氮基、硝基、异氰酸酯基、烯基、炔基、磷酰基或膦酰基,其中,任选和独立地,至少一个An与Bn(如果Bn不是C0)或Pn (如果Bn是C0)形成共价键;
B1、B2、B3和B4独立地为C0或具有与An和Pn形成共价键的两个端基的C1-C8烷基的间隔基分子;和
P1、P2、P3和P4独立地为氢或与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的聚(乙二醇) (PEG),其中,任选和独立地,至少一个Pn是与An (如果Bn是C0)或Bn (如果Bn不是C0)形成共价键的PEG。
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GR01 | Patent grant | ||
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