CN108753643B - 一种弧菌h11及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种弧菌H11及其应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018172。本发明筛选到一株高效水解浒苔多糖的菌株，且它水解获得的还原糖能够被能源菌株利用生成生物能源物质，与现有的水解浒苔多糖的单一菌株相比较，本发明中的弧菌H11的水解能力最强。本发明通过弧菌的水解与梭菌的厌氧发酵相结合，从而实现浒苔的高值化利用。

Description

一种弧菌H11及其应用
技术领域
本发明微生物生物技术和资源生物技术领域，尤其涉及一种弧菌H11及其应用。
背景技术
浒苔(Enteromorpha)是一种大型绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)石莼目(Ulvales)石莼科(Ulvaceae)的植物。近年来由于全球变暖、海水富营养化，导致浒苔迅速生长，对海洋生态环境带来了极大的影响。早期对浒苔的填埋和焚烧，对周围的水体和土壤造成了严重污染，且造成了生物质资源的浪费。如何有效利用浒苔这一爆发性资源，已成为改善海洋生态环境和海藻综合利用的研究热点。
浒苔作为一种大型绿藻是一种潜在的可再生的生物燃料源，可用于制取生物油、沼气或乙醇等。然而由于浒苔多糖成份复杂且尚不清楚，导致研究者们对于浒苔的高值化利用的研究还比较少，对浒苔及浒苔多糖在活性寡糖或生物能源方面在应用还是很少。目前，对浒苔的处理方法主要有水热法、快速热解法和发酵法。但水热法和快速热解法获得的燃油很难被直接被利用；所以，微生物酶法受到广大研究者的青睐。在当前用于微生物产醇类、酸类的主要碳源为葡萄糖、木糖、果糖等单糖类，其成本太高。但浒苔这一爆发性资源可被水解成可发酵还原糖，作为一种新型的产生物能源在原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弧菌H11及其应用，以解决目前浒苔多糖成份复杂且尚不清楚，导致研究者们对于浒苔的高值化利用的研究还比较少，所以研究浒苔利用的方案比较单一，目前主要是物理化学的方法，其方法具有很大的局限性等问题。
为解决上述问题，本发明提供了一种弧菌H11(Vibrio sp.H11)，于2018年3 月31日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2018172，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心。该发明菌株能以浒苔多糖为唯一碳源的培养基中生长，且其为革兰氏染色阴性菌；生理生化特征具有VP阳性，MR阳性，明胶液化阴性。能以“绿潮”浒苔生物质作为唯一碳源和能源生长并水解成梭菌可发酵的还原糖，用于厌氧发酵生成生物氢气和生物有机溶剂等。
上述弧菌H11的培养方法为：将所述弧菌H11菌接种到浒苔多糖为唯一碳源生长，培养基组成为(1L)(NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8g；KH2PO4， 0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.1g；FeCl3·6H2O，5mg； (NH4)6Mo7O24·4H2O，1mg；ddH2O 1L；浒苔多糖，20g；胰蛋白胨，5g/L中，在温度为30℃，pH为8.71培养12h。培养基先在121℃灭菌20min。
弧菌H11的应用，可用于水解“绿潮”生物质。主要用于将浒苔水解为成梭菌可发酵的还原糖。弧菌H11将浒苔中的浒苔多糖水解为还原糖后梭菌的厌氧发酵转化为生物能源物质。应用方法主要包括：在含有浒苔粉末或浒苔多糖的厌氧发酵培养基中加入含有所述弧菌H11的浓缩的粗酶液，并40℃、200rpm 摇床中水解48h。再接种梭菌厌氧发酵。梭菌可以为Clostridium acetobutylicum WA菌株。
浒苔多糖是一种结构复杂的杂多糖，只知道其主要组成成份，其结构目前还没有清楚的报道。对于浒苔多糖的水解，混合菌群水解能力较好，但菌群组成容易变化，且不容易保存。本发明中的Vibrio sp.H11菌株作为单一菌株，其水解浒苔多糖的能力是最强的。对于“绿潮”浒苔这一生物质的综合治理和高值化利用，目前的物理化学方法对成本要求高，且产生的废弃液容易污染环境。本发明中将浒苔最终通过微生物的方法转化为生物能源物质，成本低且环境无污染。目前，这是首次利用微生物发酵的方法将浒苔转化为生物能源物质。
与现有技术相比，本发明筛选到一株高效水解浒苔多糖的菌株，且它水解获得的还原糖能够被能源菌株利用生成生物能源物质，与现有的水解浒苔多糖的单一菌株相比较，本发明中的弧菌H11的水解能力最强。本发明通过弧菌的水解与梭菌的厌氧发酵相结合，从而实现浒苔的高值化利用。
附图说明
图1是Vibrio sp.H11的***发育树；
图2是Vibrio sp.H11的电镜图；
图3是Vibrio sp.H11的卢戈氏碘液染色图；
图4是Vibrio sp.H11的生长曲线及发酵上清中还原糖含量曲线；
图5是Vibrio sp.H11粗酶液酶活力曲线图；
图6是C.acetobutylicum WA菌株利用不同的可发酵还原糖厌氧发酵产生的生物氢气量；
图7是C.acetobutylicum WA菌株利用不同含量的浒苔多糖的可发酵还原糖产生的生物溶剂量；
图8是C.acetobutylicum WA菌株利用不同含量的浒苔粉末的可发酵还原糖产生的生物溶剂量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
(1)Vibrio sp.H11的筛选培养
前期在海南近海海域获得绿藻样品，将样品经无菌生理盐水漂洗后，用无菌研钵研磨成匀浆，静置后用移液枪轻轻吸取上清液1mL加入浒苔多糖无机盐培养基中，25℃，150rpm培养一天后；再转接1mL的发酵液至新的浒苔多糖无机盐培养基继续培养，重复操作3次。将获得的发酵液按10-3、10-4、 10-5、10-6、10-7进行梯度稀释，然后涂布于浒苔多糖平板上25℃倒置培养一天。观察形态，挑取单菌落并多次划线获得纯培养。然后通过浒苔多糖无机盐培养基发酵液中还原糖含量(DNS法)来初步确定该菌是否具有浒苔多糖水解能力。最终获得一株弧菌H11，其酶活力最高。
其中的浒苔多糖无机盐培养基的主要组成为:1L(NH4)2SO4，1.0g； Na2HPO4，0.8g；KH2PO4，0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.1g； FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1L浒苔多糖浸提液。
(2)Vibrio sp.H11的鉴定
Vibrio sp.H11为革兰氏染色阴性菌株；生理生化特性具有VP阳性，MR阳性，明胶液化阴性；可利用下列物质作为碳源：D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、 D-半乳糖、蔗糖、甘露醇、柠檬酸、淀粉；结果如表1所示。
表1Vibrio sp.H11的生理生化特性
Figure RE-GDA0001719187750000041
采用菌落PCR方法，直接取单菌落作为模板进行PCR。利用PCR扩增16S rDNA的引物为一对通用引物，27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’， 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’。PCR反应条件为：94℃3min；95℃ 30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。将PCR扩增产物纯化后，送测序结果与Genbank上的序列进行Blast分析，序列长度为1385bp，本发明与溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)具有很大的同源性；其16S rDNA序列如SEQ ID:NO.1所示。将该序列与Genbank中序列进行比对，选取相似的菌株，用 MEGA7软件构建***进化树，所构建的树状图如图1所示。同时，通过弧菌 H11的电镜图发现，其为形态为杆状，且带有鞭毛如图2所示。
弧菌H11在含2％浒苔多糖的无机盐培养基平板上培养12小时后，使用卢戈氏碘液染色具有明显的透明圈，如图3所示。
弧菌H11以浒苔多糖作为唯一碳源生长，其产生相关的糖苷水解酶，断裂浒苔多糖中的不同类型糖苷键，从而产生低分子量的寡糖为自身生长提供碳源。断裂糖苷键产生的还原末端能通过DNS法检测。该发明菌株在以浒苔多糖为唯一碳源的培养基中生长曲线及发酵上清中的还原糖含量曲线图如图4所示。发现弧菌H11生长菌浓度在14h时最高，跟培养基中还原糖含量变化一致。但发酵液中残余的还原糖含量不能直接反应粗酶液的酶活力大小。所以，再以该发明菌株的发酵上清为粗酶液与1％浒苔多糖溶液反应，测其不同发酵时间的粗酶液的酶活力(U/mL)，结果如图5所示。在12h前，随着发酵时间的逐渐增加，发酵液中粗酶液的酶活力逐渐增加，其在12h时酶活力最高，其后略有下降。
(3)Vibrio sp.H11的优化培养
为了提高发酵液中粗酶液的酶活力，对弧菌H11的培养基配方和培养条件进行了条件优化。浒苔多糖为唯一碳源生长，其优化后的培养基的组成为(1L)： (NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8g；KH2PO4，0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g； CaCl2·2H2O，0.1g；FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1mg；ddH2O 1L， pH为8.71；培养温度为30℃。
经过条件优化后，在优化的条件下培养该菌株并测定酶活力，其酶活力可达8.43U/mL，明显高于优化前的酶活力。表2为现已报道的浒苔多糖水解相关的菌株的水解能力和本发明的弧菌H11对浒苔多糖的水解能力对比。其中Vibrio sp. H11的粗酶液比单一菌株Alteromonas sp.A321，Alteromonas macleodii B7相应酶的酶活力高；同时比混合菌群Micro-community D2-1的酶活力高。虽然比 Micro-community H1的酶活力低，但是Vibrio sp.H11是单一菌株，比它更稳定，更容易保存；Micro-community H1在培养过程中菌群结构容易发生变化。
表2不同菌株(群)水解浒苔多糖能力的比较
Figure RE-GDA0001719187750000061
(4)Vibrio sp.H11的应用
经过优化培养基配方及培养条件后获得在粗酶液，作用于20g/L(2％)、50 g/L(5％)的浒苔粉末、浒苔多糖的厌氧发酵培养基(不含还原剂)。在优化培养条件下培养该发明菌株H11，在发酵26h时取出样品。为了获得更多的粗酶液酶量，使浒苔多糖或浒苔粉末充分地被水解，在此将粗酶液在4℃下超滤浓缩收集粗酶液，并测定粗酶液的酶活力。在含有浒苔粉末或浒苔多糖的厌氧发酵培养基中加入浓缩的粗酶液(50ml的浒苔粉末或浒苔多糖的厌氧发酵培养基(不含还原剂)溶液中加入2ml的粗酶液)，并40℃、200rpm摇床中水解48h。再接种Clostridium acetobutylicum WA菌株厌氧发酵。
当浒苔粉末含量为2％时，产生的生物氢气量为1553.4mL/L，生物溶剂浓度为3.46g/L。浒苔粉末含量为5％时，产生的生物气体量为1682mL/L，生物溶剂量为4.53g/L。说明在一定范围内，浒苔粉末的浓度越高，其氢气和生物溶剂的产量越高。当浒苔多糖的含量为2％时，产生在生物氢气量为1473.4mL/L，生物溶剂量为4.77g/L；浒苔多糖的含量为5％时，产生的生物氢气量为3217 mL/L，生物溶剂量为6.74g/L。说明在一定范围内，浒苔多糖的浓度越高，其氢气和生物溶剂的产量越高。同时，对比浒苔粉末和浒苔多糖，发现在同一浓度下，浒苔多糖产生更多的氢气和生物溶剂。结果如图6，图7，图8所示。综合对比分析，浒苔多糖更具有产生物燃料的价值。
对于浒苔多糖的水解，混合菌群水解能力较好，但菌群组成容易变化，且不容易保存。本发明中的Vibrio sp.H11菌株作为单一菌株，其水解浒苔多糖的能力是最强的。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一种弧菌H11及其应用
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcttttgcag cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 60
caccgtggca ttctgatcca cgattactag cgattccgac ttcatggagt cgagttgcag 120
actccaatcc ggactacgac gcactttttg ggattcgctc actttcgcaa gttggccgcc 180
ctctgtatgc gccattgtag cacgtgtgta gccctactcg taagggccat gatgacttga 240
cgtcgtcccc accttcctcc ggtttatcac cggcagtctc cctggagttc ccgactttac 300
tcgctggcaa acaaggataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catttcacaa 360
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tccagtctct tctgaggatg tcaagagtag gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaaa 480
ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcat ttgagtttta atcttgcgac 540
cgtactcccc aggcggtcta cttaacgcgt tagctccgaa agccacggct caaggccaca 600
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ccttcagatc tctacgcatt tcaccgctac acctgaaatt ctacccccct ctacagtact 780
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tcttcataca cgcggcatgg ctgcatcagg cttgcgccca ttgtgcaata ttccccactg 1080
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tattagccat cgtttccaat ggttatcccc cacatcaggg caatttccca ggcattactc 1320
acccgtccgc cgctcgccgc ccttaacgtt ccccgaaggt tcagttaagt cgctgccgct 1380
cgact 1385
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttaccttg ttacgact 18

Claims (3)

1.一种弧菌H11（Vibrio sp. H11）的应用，其特征在于，用于水解“绿潮”生物质，将浒苔水解成梭菌可发酵的还原糖；所述弧菌H11将浒苔水解为还原糖后，结合梭菌的厌氧发酵转化为生物能源物质；所述弧菌H11保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 2018172。
2.根据权利要求1所述弧菌H11的应用，其特征在于，所述弧菌H11的培养方法为将所述弧菌H11菌接种到浒苔多糖为唯一碳源的培养基中生长，所述培养基组成为(NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8 g；KH2PO4，0.2 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；CaCl2·2H2O，0.1 g；FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1 mg；ddH2O 1 L；浒苔多糖，20 g；胰蛋白胨，5 g；pH为8.71；在温度为30℃下培养12h。
3.根据权利要求1所述弧菌H11的应用，其特征在于，应用方法包括：在含有浒苔粉末或浒苔多糖的厌氧发酵培养基中加入含有所述弧菌H11的浓缩的粗酶液，并在40℃、200 rpm摇床中水解48 h，再接种梭菌厌氧发酵。
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