CN108728386A - 一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物炭固定的草甘膦高效降解菌的制备方法，是利用稻壳热解生产生物炭，与一株草甘膦高效降解菌共培养制备而成。该方法包括(1)菌种的活化；(2)生物炭和半固体培养基制备、pH调解及灭菌；(3)降解菌在半固体培养基中恒温培养获得目的产物。该方法生产的草甘膦固态降解菌剂具有生产成本低、环境友好的特点，可高效降解土壤中残留的草甘膦农药，在污染土壤返耕、改善农作物产量和质量方面具有较好的潜力。

Description

一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法。
背景技术
草甘膦是一种广谱灭生型除草剂，对多种农业杂草具有良好的杀伤作用，是当今世界上使用最广泛、使用量最大的农药之一。其理化性质稳定，在环境中降解周期较为漫长，对农产品安全存在较大的威胁。2015年，经世界卫生组织确认并公布，草甘膦与癌症存在一定的关联，其使用可能会引发人类淋巴腺癌和肺癌。因此，有必要进行相关的研究来修复受草甘膦污染的土壤。
目前，常用的农药污染土壤修复方法以物理、化学方法为主，包括炉窑焚烧、热脱附和化学处理等，但是这些方法往往成本高昂且易造成二次污染。近年来，新兴的微生物修复技术取得了一定的进展，为农药污染土壤修复带来了曙光。然而，由于农药污染物在固相介质中迁移速度慢、农药降解工程菌以液体状态难以远距离运输等问题，微生物修复技术的应用仍受到一定的限制。因此，固态农药降解菌剂的开发和应用，在农药污染场地的综合治理中具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法，具体采用生物炭共培养固定草甘膦降解菌。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)菌种活化。将保存于-80℃的菌种取出解冻，取适量涂布于含400mg/L 草甘膦为唯一碳源的固体MSM(Minimal Salt Media)培养基上，28℃恒温培养 24h。挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，180rpm震荡培养24h备用。
(2)生物炭制备。将稻壳经水洗两次后，烘干、粉碎，250-650℃限氧条件下在管式炉中热解2h，冷却至室温，研磨过0.45mm筛，得生物炭。
(3)半固体培养基制备。生物炭、LB培养基、蒸馏水以质量比1:2:2-4混合均匀，以1M NaOH调节pH为7.0，高温高压灭菌。
(4)共培养制备草甘膦固态降解菌剂。取步骤(1)活化的菌液，接种于步骤(3)的半固体培养基中，混匀。28℃恒温、180rpm震荡培养24-48h，至半固体培养基中菌体数目达108-109数量级。通风风干至菌剂含水量低于30％，得草甘膦固态降解菌剂。
该菌剂可以直接撒施于受草甘膦污染土壤表面或在农作物种植前，穴施于受污染土壤中，使用量约25-50kg/667m2。
本发明所采用的菌株为Aquamicrobiumahrensii，分离自湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司厂区周围土壤中。该菌可在草甘膦最高浓度为1000mg/L的固体和液体培养基中生长，且对其中所含草甘膦的降解率在48h内即可达到100％，最终降解产物为水、二氧化碳等无机组分。
本发明生产的草甘膦固态降解菌剂，具有廉价、便携、高效、环境友好的特点。该产品可吸附固定、高效降解土壤中残留的有机农药，并为微生物提供良好的栖息环境。同时生物炭已被证明具有改良土壤理化性质、降低养分淋失、提高土壤肥力的作用，因此，本产品在污染土壤返耕、改善农作物产量和质量方面具有较好的潜力。
附图说明
图1为不同施加量下，草甘膦固态降解菌剂对草甘膦的降解能力曲线图。
具体实施方案
以下结合具体实施方案，对本发明的技术方案作进一步详细说明。所涉及实施方案仅用于本发明，不作为本发明实施范围的限定。
实施方案1:
一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化。将保存于-80℃的菌种取出解冻，取适量涂布于含400mg/L 草甘膦为唯一碳源的固体MSM(Minimal Salt Media，成分为：NH4NO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，pH＝7)培养基上，28℃恒温培养24h。挑取单菌落接种于5mL液体LB 培养基中(培养基成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物1g/L，NaCl 1g/L，琼脂20g/L，pH＝7)，180rpm震荡培养24h备用。
(2)生物炭制备。将稻壳经水洗两次后，烘干、粉碎，250-650℃限氧条件下在管式炉中热解2h，冷却至室温，研磨过0.45mm筛，得生物炭。
(3)半固体培养基制备。将生物炭、LB培养基、蒸馏水以质量比1:2:2-4 混合均匀，以1M NaOH调节pH为7.0，121℃灭菌20min。
(4)共培养制备草甘膦固态降解菌剂。取步骤(1)活化的菌液，接种于步骤(3)的半固体培养基中，混匀。28℃恒温、180rpm震荡培养24-48h，至最终每克半固体培养基中菌体数目达108-109数量级。通风风干至菌剂含水量低于30％，包装，存放于阴凉干燥处，有效期12个月。
实施方案2:
草甘膦固态降解菌剂对土壤残留草甘膦农药的降解效果：
采用试验田小区实验，设置3个条件完全相同的实验小区，每个小区面积为 10m2。在土壤表层按草甘膦包装袋上标明的最大剂量(200g/667m2)喷洒草甘膦水溶液，分别以0kg/667m2(对照)、25kg/667m2和50kg/667m2的量施加发明的草甘膦固态降解菌剂。处理后立即第一次采样，此后采用五点取样法每天定时取样，以反相高效液相色谱分析法测定草甘膦降解率。在施加本发明菌剂后，处理组草甘膦降解速率明显高于对照组，第四天时50kg/667m2处理组降解率已超过 90％。该实验结果说明该微生物菌剂对草甘膦具有高效的降解能力。

Claims (5)

1.一种草甘膦固态降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化。将保存于-80℃的菌种取出解冻，取适量涂布于以草甘膦为唯一碳源的固体MSM(Minimal Salt Media)培养基上，28℃恒温培养24h。挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，180rpm震荡培养24h备用。
(2)生物炭制备。将稻壳经水洗两次后，烘干、粉碎，250-650℃限氧条件下在管式炉中热解，冷却至室温，研磨过0.45mm筛，得生物炭。
(3)半固体培养基制备。生物炭、LB培养基、蒸馏水按比例混合均匀，调节pH为7.0，高温高压灭菌。
(4)共培养制备草甘膦固态降解菌剂。取步骤(1)活化的菌液，接种于步骤(3)的半固体培养基中，混匀。恒温震荡培养，然后通风风干至菌剂含水量低于30％，得草甘膦固态降解菌剂。
2.根据权利要求1所述的草甘膦固态降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中MSM培养基中草甘膦浓度为400mg/L。
3.根据权利要求1所述的草甘膦固态降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中管式炉中热解时间为2h。
4.根据权利要求1所述的草甘膦固态降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中生物炭、LB培养基、蒸馏水比例为1:2:2-4，调节pH所用溶液为1M NaOH。
5.根据权利要求1所述的草甘膦固态降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中恒温震荡培养是指28℃、180rpm震荡培养24-48h，至半固体培养基中菌体数目达108-109数量级。
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