CN108698010B - 纳米颗粒生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于生产纳米颗粒的方法，所述方法包括：提供第一液体，所述第一液体包含金属盐和至少一种具有能够与金属表面结合的官能团的配体；提供包含还原剂的第二液体；提供至少一个可操作以产生液滴的液滴发生器；使所述至少一个液滴发生器形成所述第一液体的液滴；使所述液滴穿过气体以接触所述第二液体以使所述金属盐和所述至少一种配体与所述还原剂接触，从而引起纳米颗粒的自组装，所述纳米颗粒具有所述金属的核和包含多个与所述核共价结合的所述配体的冠。还提供了通过本发明的方法生产的纳米颗粒和这样的纳米颗粒在医学中的用途。

Description

纳米颗粒生产
发明领域
本发明涉及用于生产纳米颗粒，特别是具有金属或半导体核的纳米颗粒的方法，所述核由多个配体共价结合。所述纳米颗粒可以具有一个或多个与其共价或非共价结合的有效负载，例如用作药物载体。
发明背景
本发明涉及用于生产纳米颗粒的方法。用于医疗和诊断应用的纳米颗粒以及它们的生产方法是已知的。WO 02/32404描述了用硫醇衍生的碳水化合物配体官能化的金纳米颗粒(糖纳米颗粒)的合成和表征。将所述配体(呈二硫化物形式)于甲醇中的溶液添加到四氯金酸于水中的溶液中。在快速搅拌下将于水中的硼氢化钠分数小批添加到含有所述配体和金盐的容器中。由于纳米颗粒自组装而形成黑色悬浮液。
WO 2016/075211 A1描述了持续释放包封的纳米颗粒和它们的生产方法。
WO 2014/122444 A1描述了用于医学的渗透增强的携带活性剂的纳米颗粒和用于生产这样的纳米颗粒的方法。
WO 2011/156711 A1描述了治疗性膜递送***，所述治疗性膜递送***包括纳米颗粒，所述纳米颗粒具有与所述纳米颗粒结合或缔合的活性剂；以及用于形成所述纳米颗粒和包含所述纳米颗粒的膜的方法。
WO 2010/052503 A1描述了使用电阻抗断层摄影术使用金属核纳米颗粒对哺乳动物中的肿瘤进行成像。还描述了用于形成所述纳米颗粒的方法。
WO 2012/170828 A1描述了具有核和与所述核共价连接的配体的冠的纳米颗粒，其中不同种类的肽与所述纳米颗粒结合并且并入各种剂型中，包括膜。还描述了用于生产所述纳米颗粒、使肽与其结合以及将所述纳米颗粒并入膜中的方法。
糖化金纳米颗粒的进一步开发，例如在医疗和诊断应用方面的进一步开发已经产生了对按比例放大的合成方法的需求，所述方法提供了以超过传统实验室合成技术的量受控生产单分散纳米颗粒。上述合成方法(例如WO 02/32404中所述)的具体问题是所得纳米颗粒特性(包括尺寸)的均匀性在很大程度上取决于实现所添加的硼氢化钠与金盐和硫醇衍生的配体的几乎瞬时的混合。此外，硼氢化钠是潜在易燃氢气的来源，因此需要仔细控制的条件，特别是对于较大规模的反应方法来说。控制由反应器内氢气产生所引起的起泡是一个问题。在较大规模上，在添加NaBH4时看到显著的起泡，并且这有时需要添加消泡剂。将期望使在纳米颗粒合成期间对添加消泡剂的需求减到最低限度或甚至避免添加消泡剂。
对以受控方式大规模生产具有均匀特性的含有金属的纳米颗粒而没有不期望的起泡的方法仍然存在未满足的需求。本发明解决了该需求和其他需求。
发明简述
概括地说，本发明涉及纳米颗粒生产方法，其中将包含纳米颗粒反应物(例如金属盐和衍生的配体)的溶液逐滴添加到含有还原剂(例如硼氢化钠)的溶液中。含有所述纳米颗粒反应物的相对小尺寸的液滴倾向于确保快速混合并且因此确保所产生的纳米颗粒的越来越均匀的特性(如更紧密的尺寸分布)。含有纳米颗粒反应物的溶液可以方便地从液滴发生器中作为液滴被喷出以穿过气体进入含有还原剂的溶液中。含有还原剂的溶液可以容器中液体的连续搅拌池的形式或以液流的形式(例如在通道中或作为穿过气体的液体射流)提供。本申请的发明人已经惊人地发现以这种方式产生的纳米颗粒表现出良好的均匀性。此外，这种生产纳米颗粒的方法更适合于按比例扩大，尤其是因为由先前已知的生产方法所施加的限制(例如还原剂的混合速率和还原剂浓度随时间推移的变化)在很大程度上由本发明的生产方法所避免。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于生产纳米颗粒的方法，所述方法包括：
提供第一液体，所述第一液体包含成核材料(通常是金属盐)和至少一种具有能够与金属表面结合的官能团的配体(例如含有硫醇的极性有机化合物)，
提供第二液体，所述第二液体包含还原剂(例如含有硼氢化钠的溶液)；
提供至少一个可操作以产生液滴的液滴发生器，
使所述至少一个液滴发生器形成所述第一液体的液滴，
使所述液滴穿过气体以接触所述第二液体以使所述成核材料(例如所述金属盐)和所述至少一种配体与所述还原剂接触，从而引起纳米颗粒的自组装，所述纳米颗粒具有核(例如从所述金属盐还原的金属的核)和包含多个与所述核共价结合的所述配体的冠。
在一些情况下，所述金属盐包括Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Eu和/或Zn的盐。具体来说，所述金属盐可以是HAuCl4。所述第一液体中金属盐(例如HAuCl4)的浓度可以例如在0.1-100mg/mL，例如1-30mg/mL的范围内。
先前已经描述了具有半导体(量子点)核，如ZnS、CdS以及CdSe的纳米颗粒(de laFuente和Penadés,Tetrahedron:Asymmetry,2005,第16卷,第387-391页)。本文考虑的是，所述第一液体可以包含例如硝酸镉和二硫化物衍生的碳水化合物，并且所述第二液体可以包含硫化钠，从而形成具有CdS核的糖化量子点。
根据本发明的第一个方面，所述至少一种配体可以包括硫化物、硫醇或可以作为由二硫桥连接的配体二聚体提供。
所述第一液体中的所述配体的浓度相对于金属盐的浓度可以是例如摩尔过量的。在一些情况下，所述配体以1.1:1至5:1之间的与金属盐的比率存在于所述第一液体中，例如1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1。在某些情况下，所述配体以金属盐的3当量存在于所述第一液体中(例如3:1摩尔比的葡萄糖-C2二硫化物:Au3+)。
在一些情况下，所述至少一种配体包含碳水化合物部分、烷基链、二醇链以及谷胱甘肽中的一种或多种。谷胱甘肽天然地具有呈半胱氨酸氨基酸形式的硫醇，这促进与金属(例如金)核的表面的共价连接。所述配体可以例如呈缀合物的形式，如硫醇-C2-12烷基-糖。
在一些情况下，所述碳水化合物部分是单糖(例如五碳单糖，如核糖；或六碳单糖，如葡萄糖)、二糖(例如乳糖或麦芽糖)、低聚糖或多糖。在特定情况下，所述碳水化合物部分包括葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和/或乳糖或其糖苷。
在一些情况下，所述至少一种配体包括低聚乙二醇或聚乙二醇。在特定情况下，所述至少一种配体可以包括六乙二醇。在某些情况下，所述至少一种配体包括1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷醇。在某些情况下，所述配体可以包含带负电荷的端基或能够在生理pH值下具有负电荷的端基。稀释配体可以具有羧酸端基。具体来说，稀释配体可以包括SH-PEG-COOH。在某些情况下，所述至少一种稀释配体包括：HS-(OCH2CH2)m-COOH，其中m在2与30之间，任选地在6与10之间。在某些情况下，m可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些情况下，所述至少一种配体包括治疗剂和/或生物作用剂。一类示例性治疗剂是抗癌剂，如细胞毒性化合物、抗增殖剂或抗血管生成剂。具体来说，所述至少一种配体可以包括选自由以下各项组成的组的化合物：多柔比星(doxorubicin)、伊立替康(irinotecan)、铂(II)、铂(IV)、替莫唑胺(temozolomide)、氯毒素(chlorotoxin)、卡莫司汀(carmustine)、喜树碱(camptothecin)、多西他赛(docetaxel)、索拉非尼(sorafenib)、美登素(maytansine)、美登木素生物碱(maytansinoid)(例如美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4)、单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)以及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如帕比司他(panobinostat))。
在某些情况下，所述至少一种配体选自：
Figure BDA0001776529240000051
Figure BDA0001776529240000061
在一些情况下，所述治疗剂或生物作用剂包括肽、多肽和/或核酸(例如DNA或RNA，如siRNA、miRNA或shRNA)。在一些情况下，所述肽或多肽可以具有一个或多个翻译后修饰，例如，它可以被糖基化。所述治疗剂或生物作用剂(例如肽或多肽)可以包含或呈现一个或多个表位。具体来说，例如肽或多肽的试剂可以是抗原。在某些情况下，所述抗原可以是涉及人类自身免疫疾病的自身抗原，例如自身抗原肽。自身抗原肽的许多实例是已知的。在某些情况下，所述自身抗原肽可以是涉及1型糖尿病的自身抗原(例如胰岛素原、谷氨酸脱羧酶(GAD)、IA2、胰岛细胞抗原、嗜铬粒蛋白A或上述物质中的任一种的片段)。或者，所述肽或多肽可以是源自于一个或多个天然存在的肽序列的合成序列或杂合序列。
在一些情况下，所述至少一种配体包含可检测的标记，如荧光标记或光声染料。
在一些情况下，所述至少一种配体包含靶向部分。所述靶向部分选择性地靶向特定的受体、细胞类型、组织、肿瘤或器官、与其结合或由其吸收。所述靶向部分可以促进所得的纳米颗粒靶向所关注的某些部位，例如肿瘤或患病组织部位、器官类型或特定的细胞类型。
在某些情况下，所述靶向部分可以选自由以下各项组成的组：叶酸、乳糖、白蛋白、谷氨酰胺、肽、多肽、结合细胞表面受体的配体(例如EGFR配体，如吉非替尼(Gefitinib))、抗体、抗体片段(例如Fab、scFv等)以及适体。在一些情况下，所述抗体或其片段选择性地与肿瘤相关抗原结合。
在一些情况下，所述至少一种配体包括至少2种、3种、4种或至少5种不同种类的配体。具体来说，所述不同种类的配体可以包括本文所论述的不同配体中的2种、3种、4种、5种或更多种。所述不同种类的配体可以特定比率(例如1:40与40:1之间)提供于所述第一液体中。据考虑，所述第一液体中配体种类的比率将在很大程度上反映在构成所得的纳米颗粒的冠的共价结合的配体的比率中。可以在合成之后使用多种公知的技术确定共价结合的配体的比率。举例来说，可以使用NMR确定配体的存在和相对比例。
在特定情况下，至少2种配体包括：
(i)2'-硫代乙基-α-D-吡喃半乳糖苷；以及
(ii)1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷醇。这两种配体(i)和(ii)可以10:90至90:10，例如40:60至60:40的范围内的比率提供于所述第一液体中。
在一些情况下，通过本发明的方法形成的纳米颗粒的核的平均直径在1nm至5nm的范围内。在一些情况下，纳米颗粒(包括其配体)的直径可以在2nm至50nm或3nm至30nm或4nm至20nm或5nm至15nm的范围内。
在一些情况下，所述第一液体还包含二甲亚砜(DMSO)。DMSO作为溶解助剂是公知的并且已经发现它帮助液滴产生，例如从压电液滴发生器中。在一些情况下，所述第一液体还包含醇，例如甲醇，和/或水。
在一些情况下，根据本发明的第一个方面，所述还原剂可以选自由以下各项组成的组：NaBH4、水合肼、NaBH3CN(氰基硼氢化物)以及DIBAL(二异丁基氢化铝)。在某些情况下，所述还原剂可以是NaBH4。所述第二液体中还原剂(例如NaBH4)的浓度可以是例如0.01至0.1M，例如0.05M
在一些情况下，根据本发明的第一个方面，所述至少一个液滴发生器包括压电部件。在所述方法的某些实施方案中，液滴喷射过程利用压电效应，由此当施加电脉冲时压电晶体经历变形。该变形产生压力脉冲，从而迫使液滴从喷嘴中喷出，并且一旦液滴已经被喷出，还产生负压以吸入更多的流体。许多现成的装置利用该原理来产生液滴，特别是在印刷行业内。
在一些情况下，一个或多个液滴发生器以按需滴落模式操作。在一些情况下，信号发生器向压电部件提供电场。
在一些情况下，所述至少一个液滴发生器包括多个液滴发生器出口，并且其中所述液滴发生器出口呈行或阵列。在一些情况下，所述至少一个液滴发生器呈喷墨印刷头的形式。
所述第二液体可以任何配置提供，所述配置容许所述第一液体的液滴在从所述一个(多个)液滴发生器分配并且穿过气体之后进入所述第二液体的表面或与所述第二液体的表面接触。在某些情况下，所述第二液体可以提供于敞顶容器、薄膜或转盘式反应器中。在某些情况下，所述容器可以是搅拌烧瓶或浴槽。搅拌促进还原剂的分布并且有助于维持所述还原剂在所述第二液体中的均匀浓度。这有助于防止在所述第一液体的液滴进入的位置处还原剂浓度降低的局部区域。
在其他情况下，所述第二液体可以作为一个或多个通道中的至少一个物流提供。
在再另外的情况下，所述第二液体可以作为穿过气体(例如空气)的射流提供。具体来说，第二液体的射流是通过提供所述第二液体的连续无脉冲流并且使所述第二液体流穿过喷嘴而产生的，所述喷嘴引起可用于流动的横截面积减小，从而增加所述第二液体的流动速度，所述喷嘴终止于孔口，所述第二液体的射流从所述孔口中射出。在一些情况下，所述第二液体的射流在它的长度的至少一部分中不与任何壁或通道接触。在具体实施方案中，所述射流的长度的不与任何壁或通道接触的部分包括接触区，所述接触区是其中所述液滴与所述射流接触的射流区域。
将第二液体作为通道中的液流或作为射流提供的特定优点在于可以容易地将还原剂的浓度维持在恒定水平。当将纳米颗粒反应物(金属盐和配体)添加到含有特定浓度的还原剂的容器中时，随着越来越多的第一液体液滴被添加，还原剂浓度将随时间推移而耗减。在将第二液体作为液流或射流提供的情况下，将不是这样，这是因为在第一液体的液滴的初始接触位置处所述第二液体中的还原剂的浓度随时间推移将是恒定的。这进而有助于确保生产批次内特性(例如尺寸)的一致性。在一些情况下，射流方法确保恒定的反应条件而不会造成所述第一液体或所述第二液体中有意义的浓度耗减。
在一些情况下，在接触所述第二液体之前，所述第一液体的液滴穿过气体(例如空气)达1至100mm，任选地2至10mm的距离。
在一些情况下，第二液体的液流或射流基本上垂直于液滴喷射的方向并且基本上平行于多个液滴发生器出口的纵轴流动。
在一些情况下，所述至少一个液滴发生器位于所述第二液体的上方，并且所述液滴以初始速度和/或在重力的帮助下朝向所述第二液体向下喷射。
在一些情况下，所述第一液体的多个液滴基本上同时从相应的液滴发生器出口分配，并且所述液滴在接触所述第二液体之前平行穿过气体(例如空气)。
在一些情况下，液滴发生器出口的数量在5个至2500个的范围内，任选地256个、512个或1024个。
在一些情况下，液滴产生的频率在0.1至100kHz，任选地1至10kHz的范围内，其中所述频率是每个液滴发生器出口(例如每个喷嘴)的频率。在所有喷嘴上总计的总频率可以显著更高，例如在MHz范围内(参见例如本文描述2.05MHz的总频率的实施例1)。
在一些情况下，所述液滴具有1至100pL，任选地20至60pL范围内的单个液滴体积。
在一些情况下，根据本发明的第一个方面，所述方法用于制备亚稳态纳米颗粒。在该上下文中，“亚稳态(meta-stable)”或“亚稳态(metastable)”纳米颗粒是如下纳米颗粒，所述纳米颗粒具有纳米颗粒核的一个或多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)表面暴露原子(例如金原子)，该一个或多个表面暴露原子没有被配体封端。在一些情况下，纳米颗粒核的没有与配体共价结合(即未封端)的表面暴露原子的百分比可以是至少10％、20％、30％、40％或50％。在某些实施方案中，可以选择配体与成核材料(例如金属盐)的比率以使所形成的纳米颗粒不被配体完全封端或钝化。
在一些情况下，根据本发明的第一个方面，所述方法还包括将进一步的配体添加到包含纳米颗粒的溶液中的步骤。已经发现，如果需要的话，纳米颗粒最初可以亚稳态形成。或者，可以在合成中或合成后添加更多过量的配体以产生完全稳定的纳米颗粒。不希望受任何具体理论所束缚，本申请的发明人认为最初以亚稳态形成的纳米颗粒具有没有被配体完全钝化(即封端)的核。随时间推移，亚稳态纳米颗粒可以经历配体置换反应和/或核聚结，这会改变纳米颗粒的特性，如尺寸。具体来说，如果金原子暴露，那么这些金原子可以被置换，即它们将可用于与其他暴露的金表面合并，并且这些将重新组织以形成更大的纳米颗粒。如实施例中所示，在将第一液体从液滴发生器中喷射到第二液体中完成之后20分钟添加过量的未反应的配体(例如3×摩尔过量的葡萄糖C2二硫化物)并且随后搅拌混合物产生了具有窄的尺寸分布并且几乎完全不存在等离激元共振带的完全稳定的纳米颗粒。
在一些情况下，进一步添加的配体与第一液体中的至少一种配体是相同的。以这种方式，随后的配体与未封端的核表面原子的结合或对现有配体的竞争性置换倾向于引起添加“更多相同的”配体或相同配体置换，从而使纳米颗粒结构稳定(从亚稳态转变为完全稳定的)。
在一些情况下，进一步添加的配体与第一液体中的至少一种配体是不同的。以这种方式，随后的配体与未封端的核表面原子的结合或对现有配体的竞争性置换倾向于引起添加不同的配体，从而产生具有混合冠的纳米颗粒。对于添加与第一液体中的至少一种配体不同的配体所设想的特定优点是能够使在与还原剂接触时将不稳定的配体与纳米颗粒结合。举例来说，所述方法可以在第一液体中使用第一配体“A”以最初形成具有配体“A”的冠的亚稳态纳米颗粒。可以向含有这些纳米颗粒的溶液中添加一定量，如过量的第二配体“B”。所述第二配体然后可以占据纳米颗粒的核表面上未封端的位点和/或可以置换一部分配体“A”。结果然后将是具有配体“A”和“B”的混合冠的纳米颗粒。在该实例中，“B”在还原剂存在下不需要是稳定的和/或不需要提供于第一液体中。这种方法因此放开了“B”的可能选择以包括不适合初始合成条件(例如暴露于还原剂)的配体。这种方法的一个具体实例是合成具有至少一种美登木素生物碱配体(例如美登木素生物碱DM1或DM4)的纳米颗粒。已经发现，美登木素生物碱对还原环境敏感。举例来说，美登木素生物碱DM1在用硼氢化钠处理时会形成几种反应产物。因此，有利的是，可以使用本发明的方法和在还原环境中稳定的第一配体种类(例如葡萄糖-C2-硫醇)形成亚稳态纳米颗粒。一旦亚稳态纳米颗粒已经形成，就将过量的还原剂敏感性配体(例如美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4)添加到包含亚稳态纳米颗粒的溶液中。还原剂敏感性配体(例如美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4)然后占据纳米颗粒的核表面上未封端的位点以形成具有混合冠(在该实例中，是葡萄糖-C2配体和美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4配体的混合物)的稳定纳米颗粒。
在一些情况下，相对于所述第一液体中所述至少一种配体的量，以过量，任选地化学计量过量添加进一步的配体。
在某些情况下，进一步的配体的至少一部分与纳米颗粒反应并且从而变成与纳米颗粒的核共价结合。
在一些情况下，根据本发明的第一个方面，所述方法还包括通过将纳米颗粒与第二液体分离来收集纳米颗粒。可以对纳米颗粒进行一个或多个选自由以下各项组成的组的生产后处理步骤：渗析、洗涤、干燥、离心(例如超速离心)以及灭菌。
在一些情况下，本发明的第一个方面的方法还包括使纳米颗粒与至少一种肽接触，由此所述至少一种肽与所述纳米颗粒的冠非共价结合以形成肽结合的纳米颗粒。这可以通过例如将包含纳米颗粒的溶液(例如水溶液)与包含至少一种肽的溶液(例如水溶液)混合来实现，并且所述混合是在一段时间内并且在一定温度下进行的，以容许所述肽分子与所述纳米颗粒的冠非共价(例如静电)结合。合适的肽包括治疗活性剂，如：胰岛素、GLP-1、艾塞那肽(exenatide)、胰淀素、奥曲肽(octreotide)、特立帕肽(teriparatide)、细胞因子以及抗体(还参见例如WO2011/154711)。
在一些情况下，本发明的第一个方面的方法还包括将所述纳米颗粒配制或包装成药物组合物或递送形式。具体来说，由本发明的方法形成的纳米颗粒可以与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合。
在某些情况下，所述药物组合物可以被配制用于经由注射途径递送。在一些情况下，所述纳米颗粒可以被并入聚合物膜中，例如用于经颊递送。
本发明包括所述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许的或被规定要明确避免的。下文进一步详细并且参考所附实施例和附图来描述本发明的这些和另外的方面和实施方案。
附图简述
图1示出了本发明的一个实施方案的示意图。将包含金盐(Au3+)和配体的溶液逐滴添加到含有过量的还原剂(BH4 -)的容器中。随着Au3+被逐滴添加，它会遇到过量的BH4 -，因此液滴中的所有金原子应当被还原至完成(而不需要混合)。如果配体可以合适的浓度获得，那么会产生纳米颗粒。
图2示出了使用压电液滴发生器的本发明的一个实施方案的示意图。插图示出了从压电液滴发生器的孔口中喷射的液滴的高速照片。将Au3+和葡萄糖-C2二聚体(作为二硫化物二聚体提供的2'-硫代乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷)于DMSO中的溶液从压电液滴发生器中作为稳定的液滴流喷射(喷射条件：44V，13μs脉冲，50℃，ν＝4000Hz)到含有NaBH4的溶液中。
图3示出了通过本发明的方法产生的具有葡萄糖-C2配体的冠的金纳米颗粒的吸收光谱。绘制光密度(y轴)与波长(nm)(x轴)的关系图。吸收光谱显示很少或没有显示表面等离激元共振带的证据。
图4示出了通过动态光散射(DLS)测定的四个尺寸分布迹线，其中绘制群体中纳米颗粒的体积百分比(y轴)与纳米颗粒直径(nm)(x轴)的关系图。发现平均直径是2.7nm。通过本发明的一个方法实施方案产生用于这四个迹线中的每一个的纳米颗粒，其中在液滴喷射完成之后(20分钟)将过量(3×摩尔当量)的葡萄糖-C2二硫化物添加到含有纳米颗粒的溶液中并且将所得混合物搅拌1小时。
图5示出了本发明的方法的一个连续还原剂流实施方案的示意图。从左到右示出了含有硼氢化钠的溶液的水平射流。从压电液滴发生器中喷出金盐(Au3+)和配体的溶液以在与含有硼氢化钠的射流接触之前形成穿过空气的向下液滴流。金盐的还原和具有配体冠的金纳米颗粒的形成快速发生，并且现在含有形成的纳米颗粒的液体射流进入管道的弯管接头区段中(示于射流的右手端)并且被向下引导到收集容器中。
图6示出了根据本发明的方法产生的纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。示出了50nm比例尺。暗点示出了大体上球形的金核纳米颗粒。这批纳米颗粒是经由压电液滴发生器产生的，所述压电液滴发生器将Au3+和葡萄糖-C2二聚体于DMSO中的溶液液滴喷射到含有NaBH4的溶液中。
发明详述
在描述本发明时，将使用以下术语，并且其意在如下文所示进行定义。
纳米颗粒
如本文所用的“纳米颗粒”指的是具有纳米尺度的颗粒，并且不意图表达任何具体的形状限制。具体来说，“纳米颗粒”涵盖了纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在某些实施方案中，本文考虑的纳米颗粒和/或纳米颗粒核具有大体上多面体或球形几何形状。
包含多个含碳水化合物的配体的纳米颗粒已经描述于例如WO 2002/032404、WO2004/108165、WO 2005/116226、WO 2006/037979、WO 2007/015105、WO 2007/122388、WO2005/091704(它们中的每一篇的全部内容明确地以引用的方式并入本文)中并且这样的纳米颗粒可以根据本发明使用。
如本文所用的“冠”指的是层或包衣，其可以部分或完全覆盖纳米颗粒核的暴露表面。所述冠包括多个配体，所述配体一般包括至少一个碳水化合物部分、一个表面活性剂部分和/或一个谷胱甘肽部分。因此，所述冠可以被认为是围绕或部分围绕金属核的有机层。在某些实施方案中，所述冠提供和/或参与钝化纳米颗粒的核。因此，在某些情况下，所述冠可以包括足够完整的包衣层以基本上使含有半导体或金属的核稳定。然而，在本文具体考虑的是，具有核，例如包括用贵金属包衣的含金属氧化物的内核的某些纳米颗粒可以包括仅部分包衣核表面的冠。在某些情况下，所述冠促进本发明的纳米颗粒的溶解性，如水溶性。
纳米颗粒是小的颗粒，例如金属或半导体原子的簇，其可以用作用于固定配体的基质。
优选的是，所述纳米颗粒具有核，所述核具有0.5nm与50nm之间，更优选地0.5nm与10nm之间，更优选地0.5nm与5nm之间，更优选地0.5nm与3nm之间，并且还更优选地0.5nm与2.5nm之间的平均直径。当除了核之外还考虑配体时，优选地，颗粒的总平均直径在2.0nm与20nm之间，更优选地在3nm与10nm之间，并且最优选地在4nm与5nm之间。平均直径可以使用本领域公知的技术，如透射电子显微镜术来测量。
核材料可以是金属或半导体(所述半导体任选地包含金属原子或是有机半导体)并且可以由多于一种类型的原子形成。优选的是，所述核材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核也可以由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd以及Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并且可以用于本发明中。优选的核材料是Au和Fe，最优选的材料是Au。纳米颗粒的核优选地包含约100个与500个之间的原子(例如金原子)以提供纳米范围内的核直径。其他特别有用的核材料掺杂有一种或多种具有NMR活性的原子，从而允许在体外和体内使用NMR检测纳米颗粒。NMR活性原子的实例包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3以及镧系元素+3或量子点。
包含半导体化合物的纳米颗粒核可以被检测，这是因为纳米级半导体晶体能够用作量子点，也就是说，它们可以吸收光，从而将材料中的电子激发到更高的能级，随后以材料的特征性频率释放光的光子。半导体核材料的实例是硒化镉、硫化镉、镉碲。还包括锌化合物，如硫化锌。
在一些实施方案中，纳米颗粒或其配体包含可检测的标记。所述标记可以是纳米颗粒的核或配体的元素。由于纳米颗粒的该元素的固有特性或通过与可检测的另外的部分连接、缀合或缔合，所述标记可以是可检测的。标记的优选实例包括作为荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素、罗丹明或四甲基罗丹明、德克萨斯红(Texas-Red)、Cy3、Cy5等，并且可以通过激发荧光标记并且使用拉曼散射光谱法(Ramanscattering spectroscopy)检测发射光来检测(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science2002,297:1536-1539)。在一些情况下，可检测的标记可以包含异硫氰酸荧光素(FITC)。在某些情况下，可检测的标记(例如FITC)可以与纳米颗粒的核共价连接，例如经由接头连接。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以包含放射性核素以用于使用由所述放射性核素发射的放射，例如通过使用PET、SPECT来检测纳米颗粒，或用于治疗，即用于杀伤靶细胞。可以容易地适用于本发明中的本领域中常用的放射性核素的实例包括99mTc，其以多种氧化态存在，尽管最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；67Cu，其常常作为Cu2+盐使用；67Ga，其通常作为Ga3+盐，例如柠檬酸镓使用；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；111In，其一般作为In3+盐使用；125I或131I，其一般作为碘化钠使用；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；201Tl，其一般作为Tl+盐，如氯化铊使用；39Y3+；71Lu3+；以及24Cr2+。放射性核素用作标记和示踪剂的一般用途是本领域公知的，并且可以容易地由本领域技术人员调整以用于本发明的方面。放射性核素可以通过掺杂纳米颗粒的核或包括它们作为固定在纳米颗粒上的配体的一部分存在的标记来最容易地使用。
活性剂
如本文所用的术语“生物作用剂”意图涵盖对生物***发挥作用，优选地是治疗作用的药物和前药。本文考虑的活性剂的类别包括小分子有机化合物、肽、多肽以及核酸。具体实例包括：化疗剂(例如替莫唑胺、伊立替康、氯毒素、卡莫司汀、铂(IV)、铂(II)、喜树碱、多柔比星、多西他赛、美登素、美登木素生物碱(例如DM1和DM4)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和/或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，如帕比司他、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)以及西达本胺(Chidamide))；肽或多肽(例如胰岛素、GLP-1、胰淀素、艾塞那肽、奥曲肽、特立帕肽、胰高血糖素、细胞因子和/或抗体)；DNA或RNA(包括例如siRNA)。
下文是以举例方式呈现的而不应当被视为对权利要求书的范围构成限制。
实施例
实施例1：金纳米颗粒的基于压电喷射的合成
使用以下喷射条件将在DMSO中含有HAuCl4(1mg/ml的[Au3+])、葡萄糖-C2-二硫化物(Au3+:葡萄糖-C2-二硫化物是1:3摩尔比)的溶液从单个压电液滴发生器中喷出：44V，13μs脉冲，50℃，n＝4000Hz。将液滴喷射到含有8mL的0.05M浓度的NaBH4水溶液的12mL小瓶中。
在液滴喷射完成之后通过Amicon超速离心分离所得的纳米颗粒。产生具有适当尺寸的亚稳态纳米颗粒(通过非常小的等离激元带所证实)。发现这些纳米颗粒“熟化”过夜，尺寸增加到>8nm的直径(观察到红色)。本申请的发明人认为，这表明在分离纳米颗粒时，金纳米颗粒核没有完全被配体封端(即纳米颗粒最初是亚稳态的)。
然后使用上述反应物浓度和液滴喷射条件产生另一批金纳米颗粒。在喷射完成之后(20分钟)，将另外的3×摩尔当量的葡萄糖C2二硫化物添加到含有纳米颗粒的溶液中。将混合物搅拌1小时。
产生具有适当尺寸的稳定的纳米颗粒(通过动态光散射(DLS)测定平均直径是2.7nm)，参见图3和图4。通过透射电子显微镜术将这些可视化，参见图6。
然后进行进一步的实验以研究所述方法的可按比例缩放性。具体来说，增加第一液体中Au3+和配体的浓度增加了每单位时间的Au(s)产量。发现5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL以及30mg/mL的Au3+浓度(并且相应增加配体浓度以维持1:3的Au:配体比)产生基本上没有可观察到的等离激元共振带的稳定的金纳米颗粒。以下计算提供了可使用512个喷嘴的印刷头阵列以4kHz液滴产生频率实现的估计产量：
4000Hz×512个喷嘴＝2.05MHz
液滴体积＝42pL
＝0.086mL/秒
＝5.16mL/分钟
＝309mL/小时
在[Au3+]＝30mg/mL(并且假定～90％产率)时，这将得到8.34g Au(s)/小时。
然而，应当指出的是，上述计算提供了代表性数字，并且不应当被认为是本发明的方法的最大产量。
本文引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的，其程度就如同每一篇单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地示为以引用的方式整体并入本文。
本文描述的具体实施方案是以举例方式，而非限制方式提供的。本文的任何副标题仅是为方便起见而被包括，并且不应当被视为以任何方式限制本公开。

Claims (60)

1.一种用于生产纳米颗粒的方法，所述方法包括：
提供第一液体，所述第一液体包含金属盐和具有能够与金属表面结合的官能团的至少一种配体，
提供包含还原剂的第二液体，其中所述第二液体是作为穿过气体的射流提供的，并且其中第二液体的所述射流在它的长度的至少一部分中不与任何壁或通道接触；
提供可操作以产生液滴的至少一个液滴发生器，
使所述至少一个液滴发生器形成所述第一液体的液滴，
使所述液滴穿过气体以接触第二液体的所述射流以使所述金属盐和所述至少一种配体与所述还原剂接触，从而引起纳米颗粒的自组装，所述纳米颗粒具有所述金属的核和包含多个与所述核共价结合的所述配体的冠，
其中所述至少一个液滴发生器包括压电部件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属盐包括Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Eu或Zn的盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属盐包括HAuCl4。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括硫化物、硫醇或作为由二硫桥连接的配体二聚体提供。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包含碳水化合物部分、烷基链和/或二醇链或谷胱甘肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述碳水化合物部分是单糖、二糖或低聚糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述碳水化合物部分包括葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和/或乳糖或其糖苷。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括聚乙二醇。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括低聚乙二醇。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种配体包括1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷醇或HS-(OCH2CH2)m-COOH，其中m在2与30之间。
11.根据权利要求10所述的方法，其中m在6与10之间。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括治疗剂或生物作用剂。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括细胞毒性化合物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种配体包括选自由以下各项组成的组的化合物：多柔比星、伊立替康、铂(II)、铂(IV)、替莫唑胺、氯毒素、卡莫司汀、喜树碱、多西他赛、索拉非尼、美登素、美登木素生物碱、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)以及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述美登木素生物碱是美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种配体选自：
Figure FDA0003118583140000031
Figure FDA0003118583140000032
以及
Figure FDA0003118583140000041
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述治疗剂或生物作用剂包括肽、多肽或核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽或多肽是抗原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗原是自身抗原。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包含可检测的标记。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述可检测的标记包括荧光标记或光声染料。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包含靶向部分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选择性地靶向特定的受体与特定的受体结合或由特定的受体吸收。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选择性地靶向特定的细胞类型与特定的细胞类型结合或由特定的细胞类型吸收。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选择性地靶向特定的组织与特定的组织结合或由特定的组织吸收。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选择性地靶向特定的肿瘤与特定的肿瘤结合或由特定的肿瘤吸收。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选择性地靶向特定的器官与特定的器官结合或由特定的器官吸收。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向部分选自由以下各项组成的组：叶酸、乳糖、白蛋白、谷氨酰胺、肽、多肽、结合细胞表面受体的配体、抗体、抗体片段以及适体。
29.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种配体包括至少2种、3种、4种或至少5种不同种类的配体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少2种配体包括：
(i)2'-硫代乙基-α-D-吡喃半乳糖苷；以及
(ii)1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷醇或HS-(OCH2CH2)m-COOH，其中m在2与30之间。
31.根据权利要求30所述的方法，其中m在6与10之间。
32.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一液体还包含二甲亚砜(DMSO)。
33.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述还原剂选自由以下各项组成的组：NaBH4、水合肼、氰基硼氢化物以及DIBAL(二异丁基氢化铝)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述氰基硼氢化物是NaBH3CN。
35.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述液滴发生器以按需滴落模式操作。
36.根据权利要求1或2所述的方法，其中信号发生器向所述压电部件提供电场。
37.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个液滴发生器包括多个液滴发生器出口，并且其中所述液滴发生器出口呈行或阵列。
38.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个液滴发生器呈喷墨印刷头的形式。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一液体的多个液滴基本上同时从相应的液滴发生器出口分配，并且其中所述液滴在接触所述第二液体的射流之前平行穿过气体。
40.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述液滴发生器出口的数量在5个至2500个的范围内。
41.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述液滴发生器出口的数量是256个、512个或1024个。
42.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个液滴发生器出口的液滴产生频率在0.1至100kHz的范围内。
43.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个液滴发生器出口的液滴产生频率在1至10kHz的范围内。
44.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述液滴具有1至100pL范围内的单个液滴体积。
45.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述液滴具有20至60pL范围内的单个液滴体积。
46.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法用于形成亚稳态纳米颗粒。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述纳米颗粒核的表面暴露原子的至少10％未被任何配体封端。
48.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括将进一步的配体添加到包含所述纳米颗粒的溶液中的步骤。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述进一步的配体与所述第一液体中的所述至少一种配体是相同的。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述进一步的配体与所述第一液体中的所述至少一种配体是不同的。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述进一步的配体包括对所述还原剂敏感和/或在所述第一液体中不稳定的化合物或化学基团。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述进一步的配体包括美登木素生物碱。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述美登木素生物碱是美登木素生物碱DM1或美登木素生物碱DM4。
54.根据权利要求48所述的方法，其中相对于所述第一液体中的所述至少一种配体的量，以过量添加所述进一步的配体。
55.根据权利要求48所述的方法，其中相对于所述第一液体中的所述至少一种配体的量，以化学计量过量添加所述进一步的配体。
56.根据权利要求48所述的方法，其中所述进一步的配体的至少一部分与所述纳米颗粒反应并且从而变成与所述纳米颗粒的核共价结合。
57.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括通过将所述纳米颗粒与所述第二液体分离来收集所述纳米颗粒。
58.根据权利要求57所述的方法，所述方法还包括对所述纳米颗粒进行一个或多个选自由以下各项组成的组的生产后处理步骤：渗析、洗涤、干燥、离心以及灭菌。
59.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括使所述纳米颗粒与至少一种肽或多肽接触，由此所述至少一种肽或多肽与所述纳米颗粒的冠非共价结合以形成肽结合的或多肽结合的纳米颗粒。
60.根据权利要求57所述的方法，所述方法还包括将所述纳米颗粒配制或包装成药物组合物或递送形式。
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