CN108676799B - 基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法 - Google Patents

基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法。所述基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法包括：以目标miRNAs作为模板与锁式探针、RNA连接酶在连接缓冲液中进行连接反应，实现锁式探针的环化；将连接成环的锁式探针与滚环扩增引物、聚合酶、核酸内切酶及进行等温级联扩增所需的其它组件混合进行等温级联扩增反应；将所述等温级联扩增反应的产物与偶联有捕获探针的悬浮编码微芯片、通用标签于杂交缓冲液中进行碱基堆积杂交反应；以及在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置对所述悬浮编码微芯片进行观测，实现对于目标miRNAs的检测。本发明能实现对受检样品的低成本、高灵敏度、高通量地检测。

Description

基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒 及方法
技术领域
本发明涉及一种微小核糖核酸(miRNAs)的检测方法，特别涉及一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测微小核糖核酸的方法、探针、试剂盒、***等。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种小的内源性非编码RNA，它能与信使RNA(messengerRNA,mRNA)的3’端非转录区(3’UTR)结合，在转录后阶段反向调节基因表达水平。目前的研究表明，miRNAs在生物体内形成了一个复杂而高度有序的调控网络，几乎参与到了正常生命活动的每个过程。因而，对miRNAs的分析不仅可以用于了解其调控网络，而且在临床应用方面也具有重要的价值和意义。但miRNAs的片段长度短(只有19-25个碱基)，在细胞中的丰度低，又具有非常高度同源的相似序列，这些特征都对miRNAs的分析带来了严重的困难。
常规的检测技术如Northern杂交和微阵列(microarrays)是miRNAs高通量分析的金标准。但这些技术步骤十分繁琐，操作费时费力，且灵活性很差。目前，基于液相芯片的悬浮阵列在大规模的多重分析中获得了越来越多的关注。在液相芯片阵列中，多种不同类型的颗粒混合并悬浮在溶液中，每种颗粒具有特定的编码用于识别和区分。在液相溶液中，混合和分离等步骤非常容易操作。同时，这些颗粒非常容易进行探针的修饰，因而对各种不同类型的分析物如蛋白或核酸具有高度的灵活性。这些特征都使液相芯片在多重分析中非常高效且易于使用。目前，人们已经刻蚀了不同类型的液相芯片，基于其编码原理可分为两类，即荧光编码和图形编码。荧光编码的编码悬浮微芯片主要基于荧光染料或纳米颗粒的光谱差异实现编码和识别，如量子点(quantum dots)等。但荧光编码中可用的荧光染料有限，且有可能的光谱重叠，同时，它需要复杂而昂贵的配有多个荧光通道的光学设备才能实现多组分分析。而图形编码则避免了这些问题，通过设计不同的图形或形状即可实现编码和多重分析，不需要复杂的荧光设备。但目前多种图形编码的芯片，如微胶，光子晶体等加工流程和制备过程非常复杂，限制了其在多组分通量分析中的应用。
同时，针对miRNAs灵敏度低的问题，人们也已发展了多种技术手段。其中，核酸扩增是一种非常有效的策略，它能够实现极高的灵敏度(～fM)和特异性。多种的扩增技术已经被报道，如实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，滚环扩增(RCA)，等温指数扩增反应(EXPAR)，环介导的等温扩增(LAMP)。而常规的核酸扩增技术往往需要复杂而精细的序列设计才能满足miRNAs多重分析的要求，这也限制了其在miRNAs通量分析中的广泛应用。因而，目前仍迫切需要发展一种能实现多组分高通量分析的miRNA的技术。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的锁式探针。
本发明实施例还提供了一种miRNAs的检测试剂盒，其包括所述的锁式探针。
进一步地，所述的检测试剂盒还包括进行等温级联扩增所需的其它组件。
本发明实施例还提供了一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法，其包括：以目标miRNAs作为模板与锁式探针、RNA连接酶在连接缓冲液中进行连接反应，实现锁式探针的环化，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；
将连接成环的锁式探针与滚环扩增引物、聚合酶、核酸内切酶及进行等温级联扩增所需的其它组件混合进行等温级联扩增反应，所述滚环扩增引物的序列如SEQ ID NO:3所示；
将所述等温级联扩增反应的产物与偶联有捕获探针的悬浮编码微芯片、通用标签于杂交缓冲液中进行碱基堆积杂交反应，所述通用标签的序列如SEQ ID NO:8所示，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，所述通用标签还具有荧光标记；以及
在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置对所述悬浮编码微芯片进行观测，实现对于目标miRNAs的检测。
本发明实施例还提供了一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的***，其包括：所述的检测试剂盒；以及，光学检测装置。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法中，级联扩增的效率高，灵敏度高，对miRNAs的检测灵敏度可达fM级；
(2)本发明提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法中，级联扩增序列设计简单方便，可以避免常规等温扩增中需要复杂序列设计的缺陷；
(3)本发明提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法中，级联扩增方法对miRNAs的特异性好，能有效区分只有1-2个碱基差异的同源序列；
(4)本发明提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法特异性强、灵敏度高，可实现对受检样品的高灵敏度、高通量检测；
(5)本发明提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法非常简单实用，无需多通道荧光检测中的复杂昂贵的光学配件，有效避免了潜在的光谱交叉干扰和有效荧光染料欠缺的问题，且只需常规的分析设备即可实现。可用于临床应用，如miRNA的特征谱的分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a-图1b是本发明一典型实施方案中一种锁式探针的设计示意图；
图2是本发明一典型实施方案中一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增原理示意图；
图3a-图3c是本发明一实施例中等温级联扩增的可行性分析图；
图4是本发明一实施例中基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的检测结果。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
如前所述，鉴于现有技术存在诸多缺陷，本案发明人经长期研究与大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是通过将基于滚环扩增(RCA)的等温级联扩增技术与编码悬浮微芯片技术结合，提供一种高灵敏，高特异性的多组分miRNAs分析的方法。
进一步地讲，本发明实施例提供的一种基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法可以包括等温级联扩增、编码悬浮微芯片的捕获探针偶联、碱基堆积杂交、光学检测等步骤。
在本发明的实施例中，所述等温级联扩增包括滚环扩增(RCA)和聚合/酶切/链取代循环两个部分的级联。目标miRNA首先作为模板对锁式探针连接环化。在RCA中，RCA引物介导环化的锁式探针的RCA扩增。在切刻酶(Nicking酶，即核酸内切酶)的作用下，启动“聚合/酶切/链取代”循环，实现级联扩增。“聚合/酶切/链取代”循环能产生大量的特异性序列，它能与随后的捕获探针进行碱基堆积杂交。
在本发明的实施例中，请参阅图1a-图1b所示，锁式探针的设计包括三个部分，即：能与miRNA杂交的核酸序列区域1，能与RCA引物杂交的核酸序列区域2和产生特异性序列的核酸序列区域3。其中，核酸序列区域3两端包含有切刻酶的识别位点41、42。
进一步地，在所述锁式探针中，核酸序列区域1由相应的miRNA决定，根据所检测的miRNA进行相应的设计。
进一步地，在所述锁式探针中，核酸序列区域2的序列为通用序列，在满足锁式探针不产生二级结构的条件下，可根据需要设计。
进一步地，在所述锁式探针中，核酸序列区域3对应着特定的一条miRNA，需要特异性设计。其Nicking酶切后的长度优选为20nt，以保证其与编码微球的捕获探针进行有效的特异性的碱基堆积杂交。长度太短不能有效杂交，长度太长则无法保证特异性。
进一步地，在所述锁式探针中，核酸序列区域3可以设计为一个，也可以设计为多个。
在本发明实施例提供的所述锁式探针中，因前述核酸序列区域1、2均无需设计，而只有核酸序列区域3需要设计，每种miRNA设计相应的杂交序列，并与捕获探针上的杂交片段相一致。因而对每种miRNA检测时，锁式探针和捕获探针中有约20nt的杂交片段需要特异性设计，这就简化了序列设计的流程，避免了常规等温扩增中需要复杂序列设计的缺陷。
进一步地，本发明实施例提供的所述锁式探针的首尾两个互补片段分别与miRNAs杂交，连接和环化，因而对miRNAs的序列有严格的要求。miRNAs中若有1-2个碱基的差异则可能严重限制其与锁式探针的杂交，进而降低灵敏度，从而能够有效区分并特异性检测miRNAs同源序列。
一般来说，切刻酶只切割双链核酸分子中的一条链，造成一个双链核酸分子缺口，该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH和5'-PO4。在切刻酶和具有链置换活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3'-OH的核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离。因链延伸而被封闭的缺口可以在切刻酶的作用下重复产生，从而使得“聚合/酶切/链取代”的过程能够重复进行，并在此过程中，以线性或指数方式不断剥离或释放出与下游旧链序列相同的单链核酸分子(参阅Walker GT,et al.Stranddisplacement amplification--an isothermal,in vitro DNAamplificationtechnique.Nucleic Acids Res.1992；20(7):1691-6.Walker GT,et al.Stranddisplacement amplification--an isothermal,in vitro DNA amplificationtechnique.Nucleic Acids Res.1992；20(7):1691-6.Van Ness J,et al.Isothermalreactions for the amplification of oligonucleotides.Proc Natl Acad SciUSA.2003；100(8):4504-9.Shi C,et al.Exponential strand-displacementamplification for detection of microRNAs.Anal Chem.2014；86(1):336-9)。
在本发明的实施例中，通过于锁式探针中引入两个切刻酶位点，能够在等温级联扩增步骤中，有效引发“聚合/酶切/链取代”循环，比常规的滚环扩增技术具有更高的扩增效率。同时，“聚合/酶切/链取代”循环主要产生单链的特异性杂交片段，能够有效与编码悬浮微芯片杂交。
在本发明的实施例中，所述锁式探针的序列优选如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。这为miRNAs的高灵敏检测提供了一种更加有效的新途径。
进一步地，在本发明的实施例中，于前述锁式探针的环化和扩增中，在连接环化反应之后，还包括提取或纯化连接成环的锁式探针的步骤，以方便后续用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增。提取或纯化连接成环的锁式探针的方法包括至少两种，例如：采用外切酶降解没有连接成环的锁式探针，以及其他DNA片段；或者，采用磁珠将连接成环的锁式探针分离提纯。可以理解，以上两种方法都可以用于本发明实施例，在此不做具体限定。
在本发明的实施例中，所述等温级联扩增步骤采用聚合酶可以包括phi29 DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶大片段或Vent exo-DNA聚合酶等，且不限于此。
在本发明的实施例中，所述等温级联扩增步骤采用的Nicking酶可以包括Nb.BbvCI或Nt.BbvCI等，且不限于此。
在本发明的实施例中，整个的所述等温级联扩增反应都可以在均相条件下完成的，只需将待测的miRNA样品，连接成环的锁式探针，RCA引物，聚合酶，nicking酶等在均相条件下混合反应即可。
在本发明的实施例中，所述等温级联扩增反应的条件也可以是业界已知的，例如温度可以为20～40℃，反应时间可以为1～3h。
在本发明的实施例中，所述编码悬浮微芯片的捕获探针偶联可以通过业界已知的方式实施，例如，可以使编码悬浮微芯片先与硅烷化试剂反应，随后进行羧基化修饰，再与捕获探针通过常用的偶联技术手段完成偶联。
在本发明的实施例中，采用的编码悬浮微芯片可以是业界已知的，例如可以是CN101543755A、CN102788779B、CN107298426A等制备的编码悬浮微球、微芯片等等，且不限于此。
例如，所述编码悬浮微芯片的材质可以包括二氧化硅，磁珠，聚丙烯酰胺等，其大小优选为50nm-200μm，编码方式包括形状，大小，点阵，荧光比例混合等，实现芯片的有效区分和识别。例如，可以采用半导体微加工工艺在编码悬浮微芯片表面编码层刻蚀含有平行排列的方形区域，每个区域中的方形模块的存在状态可以调控，通过组合调节其存在与否，可以构建一系列的编码。
进一步地，在本发明的实施例中，对于具有不同的编码的不同编码悬浮微芯片，可以在其表面分别结合不同捕获探针。
进一步地，在本发明的实施例中，所采用的编码悬浮微芯片的编码能力可达几十种，这些编码悬浮微芯片均能方便有效的区分和解码。
进一步地，在本发明的实施例中，所述捕获探针可以包括两个部分，即：分别能与前述特异性序列、通用标签(Univeral Tag，UT)杂交的核酸序列区域。
进一步地，在本发明的实施例中，所述捕获探针的5’末端优选含有一段8-15个碱基的poly A，使捕获探针有一定的空间取向和杂交灵活度，以提高杂交效率。
进一步地，在本发明的实施例中，所述捕获探针的5’末端优选带有NH2修饰。
进一步地，在本发明的实施例中，所述捕获探针的序列优选如SEQ ID NO:6或SEQID NO:7所示。
进一步地，在本发明的实施例中，所述捕获探针可以通过偶联等方式结合于悬浮编码微芯片表面，此类偶联方式可以是业界已知的。例如，可以通过EDC/NHS反应将捕获探针与悬浮编码微芯片进行偶联。
在本发明的实施例中，所述通用标签(UT)的序列优选如SEQ ID NO:8所示。它只有8个碱基，并带有荧光标记。所述荧光标记可以为FAM标记，Cy3标记等，且不限于此。相应的，与之匹配的荧光设备成像中，荧光设备的荧光通道可以为FAM荧光通道(Ex:488nm；Em:525nm)，Cy3荧光通道(Ex:543nm；Em:575nm)等。
在本发明的实施例中，所述碱基堆积杂交步骤可以包括：使前述等温级联扩增产生的大量特异性序列与结合在编码悬浮微芯片上的捕获探针杂交，并通过通用标签(UT)进行标记。
在本发明的实施例中，所述光学检测步骤可以包括荧光设备成像与数据处理。例如，通用标签(UT)标记的悬浮编码微芯片在荧光设备上观察成像。在明场通道直接观察悬浮微球上的数字编码，在相应的荧光通道对微球进行荧光成像，并以CCD相机等记录图像。所采集的荧光图片以Image J(National Institutes of Health,free software)软件处理，分析悬浮微球上的荧光强度。这些操作可以是业界已知的，此处不再予以详细解释。
相应的，本发明实施例提供了一类miRNAs的检测试剂盒，其包括所述的锁式探针。
进一步地，所述的检测试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:3所示的滚环扩增引物。
进一步地，所述的检测试剂盒还包括进行等温级联扩增所需的其它组件。
进一步地，所述的检测试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:8所示的通用标签；以及，序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的捕获探针，所述捕获探针结合于编码悬浮微芯片表面，所述通用标签还具有荧光标记。
进一步地，所述进行等温级联扩增所需的其它组件包括聚合酶、核酸内切酶等，且不限于此。
进一步地，所述聚合酶包括phi29 DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶大片段或Vent exo-DNA聚合酶等，且不限于此。
进一步地，所述核酸内切酶包括Nb.BbvCI或Nt.BbvCI等，且不限于此。
进一步地，所述的检测试剂盒还包括核酸外切酶，所述核酸外切酶包括Exo I。
相应的，本发明实施例提供了基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法，其包括：以目标miRNAs作为模板与锁式探针、RNA连接酶在连接缓冲液中进行连接反应，实现锁式探针的环化，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；
将连接成环的锁式探针与滚环扩增引物、聚合酶、核酸内切酶及进行等温级联扩增所需的其它组件混合进行等温级联扩增反应，所述滚环扩增引物的序列如SEQ ID NO:3所示；
将所述等温级联扩增反应的产物与偶联有捕获探针的悬浮编码微芯片、通用标签于杂交缓冲液中进行碱基堆积杂交反应，所述通用标签的序列如SEQ ID NO:8所示，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，所述通用标签还具有荧光标记；以及
在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置对所述悬浮编码微芯片进行观测，实现对于目标miRNAs的检测。
更为直观的，所述基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法的原理可以参阅图2所示。
进一步地，所述的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法还包括：在所述连接反应完成后，向所获反应混合物中加入核酸外切酶，将未环化的锁式探针降解。
进一步地，所述的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法具体包括：在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置的明场通道对所述悬浮编码微芯片进行观测，以及，以光学检测装置的荧光通道对所述悬浮编码微芯片进行荧光成像。
相应的，本发明实施例提供了基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的***，其包括：所述的检测试剂盒；以及，光学检测装置。
本发明实施例可以充分发挥等温级联扩增的高效体外扩增性能和编码悬浮微芯片高通量的检测功能；实现对受检样品的高灵敏度、高通量检测，并且无需多通道荧光检测中的复杂昂贵的光学配件，有效避免了潜在的光谱交叉干扰和有效荧光染料欠缺的问题，可用于一管反应中几十种miRNAs的平行高灵敏分析，且只需常规的分析设备。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
如下实施例采用的Let-7a、MiRNA-21、RCA引物、Let-7a锁式探针、MiRNA-21锁式探针、Let-7a捕获探针、miR-21捕获探针、UT的序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示，详见下表1。
如下实施例采用的编码悬浮微芯片为CN101543755A所述的编码微球。
如下实施例采用的其他试剂如缓冲液、酶等均可以通过业界已知的途径获取。
表1
Figure GDA0003103087960000081
本实施例提供的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法包括如下步骤：
(1)编码微球的捕获探针偶联，具体实验步骤如下：
编码微球先进行羧基化修饰。首先制备5％(v/v)的溶于95％的乙醇的3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷溶液。将所制备的编码微球悬浮于其中30min进行氨基硅烷化反应并以乙醇清洗。随后将编码微球悬浮在10％(w/v)的丁二酸酐中室温反应6h进行羧基化修饰，并用超纯水清洗两次。
羧基化修饰的编码微球以50μL MES溶液(100mM,pH 4.5)清洗并悬浮于其中，然后加入200mg/mL新鲜制备的EDC溶液和100μM氨基修饰的捕获探针，室温反应30min。上述反应重复进行4次。捕获探针偶联的编码微球以0.02％Tween和0.1％SDS清洗，重悬于杂交缓冲液(5×SSC和0.2％SDS)中，并于4℃保存。
(2)等温级联扩增，碱基堆积杂交与荧光显微镜成像
目标miRNA首先作为模板进行锁式探针的环化。以不同浓度的目标miRNA，100nM的锁式探针，15U的T4 RNA ligase 2，在10μL 1×连接缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT,pH 7.5)中37℃反应2h。而未环化的锁式探针则以20U Exo I在30℃反应1h降解，随后在80℃、20min灭活Exo I。在上述连接产物中加入100nM的RCA引物，1mM dNTPs，4Uphi29 DNA聚合酶，3U Nb.BbvCI切刻酶，在20μL的1×NEB buffer 2(50mM NaCl,10mMTris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT,pH 7.9)中30℃反应2h。上述扩增反应产物随后与捕获探针偶联的编码微球(～1000个)和200nM通用标签(Univeral Tag,UT)在50μL的杂交缓冲液(5×SSC和0.2％SDS)中42℃反应1h进行悬浮芯片的碱基堆积杂交。编码微球随后以5×SSC和0.1％SDS在30℃反应6min，然后以0.2×SSC在室温清洗2次，每次3min。数字编码的编码微球随后在尼康倒置荧光显微镜(Nikon,eclipse Ti)上观察成像。显微镜配以40×物镜，并以汞灯为光源。编码微球首先在明场通道观察，随后在Cy3荧光通道(Ex:543nm；Em:575nm)对UT标记的荧光进行成像。图形以CCD相机记录，并随后以Image J(NationalInstitutes of Health,free software)软件处理。
(3)miRNAs检测灵敏度分析
通过优化实验条件，如phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切刻酶的浓度，反应时间，反应温度等，考察了级联扩增技术对let-7a的检测灵敏度。一系列不同浓度的Let-7a(10pMto 10fM)，通过连接反应，RCA扩增，Nicking酶切和碱基堆积杂交后，在荧光显微镜的cy3通道观察相应的荧光信号。
通过Image J软件分析微球上的荧光强度，计算了其与let-7a的浓度之间的线性关系。可以看到，在Let-7a 10pM到10fM的4个数量级的浓度范围内，均获得了很好的线性(R＝0.99，参阅图4)。检测灵敏度可达10fM。这一灵敏度与其他超高灵敏的方法相当，表明所发展的技术能够有效用于miRNA高灵敏分析。
(4)miRNA检测特异性分析
miRNA具有非常高的序列同源性，其家族同源序列往往只有1-2个碱基的差异。因而，对miRNA同源序列的有效区分和特异性检测，且无交叉干扰是非常必要的。因而，以Let-7a家族中的let-7a,let-7b,let-7c和let-7d(序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9～SEQ IDNO:11所示，详见表2)为分析对象，进一步考察了所发展的方法对miRNA检测的特异性。
表2
Figure GDA0003103087960000101
只有let-7a得到了显著的荧光信号，而let-7b,let-7c或let-7d在编码微球上只有微弱的荧光信号。这一结果表明所发展的技术具有很高的检测特异性，能够有效区分具有同源序列只有1-2个碱基差异的miRNA。
(5)多种miRNAs的高灵敏分析
随后，将本实施例的检测方法用于miRNA多组分的高灵敏分析。两种miRNA，let-7a和miR-21做为靶标进行了考察。它们的捕获探针被修饰在相应的两种不同编码的编码微球上。这两种编码的编码微球随后混合。同时，也相应设计了let-7a和miR-21的扩增探针，并将其混合，两者在相同的条件下进行扩增，随后与混合的两种编码的悬浮芯片杂交，在荧光显微镜中观察结果。
在明场通道，两种不同编码的悬浮芯片能够直接鉴定和识别。在荧光通道，let-7a和miR-21的荧光强度同时被记录。将两种通道混合后，let-7a和miR-21即可在同一荧光通道实现平行和独立检测，这有效避免了多种染料或多种荧光通道的使用。
当let-7a和miR-21均不存在时，两种编码微球上均只有微弱的荧光；当只有let-7a加入时，其对应的悬浮芯片上出现了显著的荧光信号，而miR-21的芯片上的荧光依旧很微弱。同样的，当只有miR-21存在时，其对应的悬浮芯片上则出现了显著的荧光信号，而let-7a的芯片上的荧光则十分微弱。当let-7a和miR-21均存在时，两种编码微球上均出现了显著的荧光信号。这一结果表明，在本实施例的反应体系中，let-7a和miR-21的交叉反应很少，本实施例的检测方法能有效实现多种miRNA的高灵敏分析。
针对miR-21，本实施例中检测方法的高灵敏分析结果可以参阅图3a-图3c。
(6)细胞样品的检测
细胞总RNA的提取：人类乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中，于37℃在含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。当细胞生长到对数生长期时，使用德国凯杰生物公司的总RNA提取试剂盒对细胞中的总RNA进行抽提与纯化，提取与纯化操作严格按照试剂盒所附的说明书进行。所得的总RNA的浓度用紫外可见分光光度计进行测定。
基于上述的对多种miRNA的高灵敏和高特异性分析，进一步考察了所发展的方法的抗基质干扰的能力和在复杂样品中对miRNAs分析的可行性。选择了MDA-MB-231和MCF-7细胞裂解液，基于所建立的线性工作曲线，let-7a和miR-21的含量分别X和X/ug总RNA。为了确认这一结果的准确性，将let-7a和miR-21的标准品预添加至50pg总RNA中，对let-7a和miR-21的量通过五次平行分析计算回收率和重现性。这表明本实施例的方法能有效用于实际样品的检测，在临床应用中有广阔的应用前景。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tcgtcagtca ctcatctcc 19
<210> 4
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ctactacctc aggagatgag tgactgacga gctgaggcct atgtgcattc gctgaggaac 60
tatacaac 68
<210> 5
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ctgataagct aggagatgag tgactgacga gctgagggca ttctccatgt gctgaggtca 60
acatcagt 68
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
aaaaaaaaaa aggcctatgt gcattcgctg atgcgacct 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
aaaaaaaaaa agggcattct ccatgtgctg atgcgacct 39
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
aggtcgca 8
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
agagguagua gguugcauag uu 22

Claims (14)

1.序列如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示的锁式探针。
2.miRNAs的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的锁式探针。
3. 如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括序列如SEQ ID NO: 3所示的滚环扩增引物。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于还包括进行等温级联扩增所需的其它组件。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于包括：
序列如SEQ ID NO: 8所示的通用标签；
序列如SEQ ID NO: 4所示的锁式探针和序列如SEQ ID NO: 6所示的捕获探针，
或者，序列如SEQ ID NO: 5所示的锁式探针和序列如SEQ ID NO: 7所示的捕获探针；
所述捕获探针结合于编码悬浮微芯片表面，所述通用标签还具有荧光标记。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于包括：
序列如SEQ ID NO: 4所示的锁式探针和序列如SEQ ID NO: 6所示的捕获探针，
以及，序列如SEQ ID NO: 5所示的锁式探针和序列如SEQ ID NO: 7所示的捕获探针；
并且，表面结合有不同捕获探针的不同编码悬浮微芯片具有不同的编码。
7.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述进行等温级联扩增所需的其它组件包括聚合酶、核酸内切酶。
8. 如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述聚合酶包括phi29 DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶大片段或Vent exo- DNA聚合酶。
9.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述核酸内切酶包括Nb.BbvCI或Nt.BbvCI。
10. 如权利要求2-9中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于还包括核酸外切酶，所述核酸外切酶包括Exo I。
11.基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法，其特征在于包括：
以目标miRNAs作为模板与锁式探针、RNA连接酶在连接缓冲液中进行连接反应，实现锁式探针的环化；
将连接成环的锁式探针与滚环扩增引物、聚合酶、核酸内切酶及进行等温级联扩增所需的其它组件混合进行等温级联扩增反应，所述滚环扩增引物的序列如SEQ ID NO: 3所示；
将所述等温级联扩增反应的产物与偶联有捕获探针的悬浮编码微芯片、通用标签于杂交缓冲液中进行碱基堆积杂交反应，所述通用标签的序列如SEQ ID NO: 8所示，所述通用标签还具有荧光标记；以及
在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置对所述悬浮编码微芯片进行观测，实现对于目标miRNAs的检测；
其中，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 4所示，且对应捕获探针的序列如SEQ IDNO: 6所示；和/或，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 5所示，且对应捕获探针的序列如SEQ ID NO: 7所示。
12.根据权利要求11所述的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法，其特征在于还包括：在所述连接反应完成后，向所获反应混合物中加入核酸外切酶，将未环化的锁式探针降解。
13.根据权利要求11所述的基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的方法，其特征在于具体包括：在所述碱基堆积杂交反应结束后，以光学检测装置的明场通道对所述悬浮编码微芯片进行观测，以及，以光学检测装置的荧光通道对所述悬浮编码微芯片进行荧光成像。
14.基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的***，其特征在于包括：如权利要求2-10中任一项所述的检测试剂盒；以及，光学检测装置。
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