CN108669298A - 一种饲用益生菌微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种饲用益生菌微胶囊，其特征在于，所述饲用益生菌微胶囊中的益生菌由动物双歧杆菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌组成，所述饲用益生菌胶囊还包括保护剂；所述保护剂包括甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖、色氨酸和无菌水。本发明的益生菌胶囊巧妙地将枸杞多糖、色氨酸和低聚木糖组合后与常规的保护剂成分组合制备得到本发明的保护剂，以上成分之间相互协同，使得益生菌微胶囊中的活菌在保藏过程中保持较高的活性，而不会被加工过程中的化学成分和低温条件等破坏灭活或者受到损伤，同时菌体在保藏后的测定中保持了较高的增殖活性。

Description

一种饲用益生菌微胶囊及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于饲料领域和生物技术领域的交叉领域，具体涉及一种饲用益生菌微胶囊及其制备方法和应用。

背景技术：

随着人们生活质量的持续提高, 畜牧业的发展也逐渐提升, 畜禽产品的安全问题也受到了普遍重视。由于我国畜禽养殖生产中抗生素、化学药物、激素等大量且不合理的使用, 使畜禽产品的安全生产受到严重破坏。特别是饲用抗生素，饲用抗生素的应用已有近70年的历史, 先后有60余种抗生素应用于畜牧业, 在动物疾病防治、提高饲料利用率和促进畜禽生长等方面发挥重要作用。但随着抗生素的大量、长期和不科学滥用, 细菌耐药性和药物残留等问题日益突出。随着人们对生活质量的追求及健康意识的增强, 世界上对饲用抗生素的限制和禁用呼声越来越高, 无抗生素日粮的概念也因此提出, 寻找新型绿色添加剂逐渐取代抗生素是畜牧业可持续发展的必然趋势。

益生菌是一类能产生确切健康功效, 从而改善宿主微生态平衡并发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。益生菌制剂是一种由活体益生菌制成的新式生物活性制剂, 目前，在饲料领域所运用的益生菌制剂主要包括乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母类和肠球菌类。研究表明益生菌能提高猪的生长性能、养分消化率及免疫能力等, 但其作用效果与益生菌的种类、使用量、动物自身生理与健康状况等因素相关。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。然而在实际应用中益生菌通常会受到胃酸和胆盐的影响，只有少量能到达肠道内，并且由于营养缺乏、胆汁盐侵蚀等因素使达到肠道内的益生菌的增殖受到抑制，很难发挥其原有功效。

基于益生菌制剂使用中存在的技术问题，发明专利申请CN201410344986.4公开了一种含植物提取物的益生菌缓释剂的制备方法，包括（1）将葡萄多酚粉、食用菌多糖粉溶于复合益生菌混合液中，得到原液A；（2）将原液A与海藻酸盐按比例混合均匀，加入冰醋酸充分溶胀，得到原液B；（3）将上述原液B以注射器滴加到氯化钙溶液中，得到凝胶缓释微球；（4）收集上述凝胶缓释微球，室温干燥，得到含有葡萄多酚、食用菌多糖的益生菌缓释剂。本发明通过葡萄多酚、食用菌多糖和益生菌的协同作用不仅可以提高活性益生菌的效用，同时起到增强人体的免疫力和对多种疾病的预防作用。发明专利申请CN201510901413.1公开了一种以抗性淀粉为壁材的肠道益生菌微胶囊及制备方法，该微胶囊以抗性淀粉为壁材、以肠道益生菌为芯材，通过将菌种活化和扩大培养，将提取的菌体与抗性淀粉混合，加入乳化剂和保护剂，均质后进行冷冻喷雾干燥得到所述微胶囊，其以抗性淀粉为壁材，使微胶囊经过胃和小肠时芯材可以被保护而不会被胃液和小肠降解，达到在大肠释放益生菌的目的；而且通过该方法制备的微胶囊分散性和溶解性好，菌体成活率高，有较长的保质期和良好的贮存稳定性。发明专利申请CN201610064261.9公开了一种定位缓释微囊益生菌由内至外依次包括菌体层、酸性包埋吸附层、以及复合离子层；菌体层包括益生菌和益生元，酸性包埋吸附层包括酸性物质，复合离子层包括碱性物质；通过将益生菌菌种活化后培养，生长至稳定期终止发酵，离心后收集菌体，在菌体中加入益生元得到菌悬液，将菌悬液与酸性物质成比例混合搅拌后，再与碱性物质成比例混合搅拌，得到双层微囊菌液，将双层微囊菌液冻干处理制得，有效保护益生菌，在目标位点释放益生菌菌体，使益生菌免受在食用过程中胃酸、胆汁盐、酶等外界因素影响。张董燕等（《中国畜牧兽医》，2016 ，43 (6) :1512-1516）研究了喷雾干燥技术制备饲用乳酸菌微胶囊制剂的，指出乳酸菌微胶囊技术是将核心菌体包覆于胃不溶、肠溶性的安全、特殊壁材中，可增加菌体对不良环境(胃液、胆盐等)的抵抗力，使其顺利到达肠道以发挥益生作用，且利于储存、加工和运输。利用喷雾干燥技术进行微胶囊制备具有包被速率快、生产成本低、适用于连续化生产等优点，但由于其存在较高进出口风温度及快速脱水过程,对于饲用乳酸菌的微胶囊制备在壁材物质及制备参数等方面具有严格的要求。然而，基于以上现有文献报道和专利文献公开可知，目前饲用益生菌微胶囊的发展尚处于起步阶段，产业化的产品种类较少，难以满足养殖行业的快速发展需求。

发明内容：

基于现有技术发展中，饲用益生菌微胶囊的发展尚不完善，产品种类较少，限制了其在养殖行业的广泛运用。本发明旨在提供一种饲用益生菌微胶囊及其制备方法和应用。

为解决以上技术问题以及达到相应的技术效果，本发明采用如下技术方案：

一种饲用益生菌微胶囊，其特征在于，所述饲用益生菌微胶囊中的益生菌由动物双歧杆菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌组成，所述饲用益生菌胶囊还包括保护剂。

所述保护剂包括甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖、色氨酸和无菌水。

所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水。

所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

所述的饲用益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，分别对动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌进行活化、培养，获得动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌的菌液，而后分别离心获得菌泥沉淀，采用PBS洗涤菌泥沉淀2-3遍，离心后获得动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥；

步骤二，按照质量比1：2：1称取步骤一制备的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥，混合均匀后得到混合菌泥，将混合菌泥与保护剂按照质量体积比1：5的比例将混合菌泥悬浮到保护剂中，并震荡混合均匀，得到混合菌液；

步骤三，将步骤二制备得到的混合菌液与海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器吸取逐滴滴入到壳聚糖-氯化钙溶液中进行成膜反应，静止、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球，得到海藻酸钠微胶囊；

步骤四，将步骤三得到的海藻酸钠微胶囊浸入到硫酸钠溶液中，浸泡15min，而后静置、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球；

步骤五，将步骤四收集的微球分装后，放入-80℃的超低温冰箱中预冻2h，而后放入真空冷冻干燥机内，干燥至水分含量低于25%，即得到所述的饲用益生菌微胶囊。

其中步骤一所获得的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥中活菌数分别是2×10⁸CFU/g、2×10⁸CFU/g、3×10⁸CFU/g。

其中步骤二中所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

其中步骤三中的海藻酸钠溶液是称取一定量的海藻酸钠在40℃用蒸馏水溶解，配置成的浓度为2%（w/V）的海藻酸钠溶液；其中混合菌液与海藻酸钠溶液体积比为1：8-9；所述壳聚糖-氯化钙溶液是用浓度为2%（w/w）的乙酸溶液溶解一定量的壳聚糖，得到浓度为2.5%（w/w）的壳聚糖乙酸溶液，再加入氯化钙，得到氯化钙浓度为2.5%（w/v）的壳聚糖-氯化钙溶液；所述成膜反应是在搅拌的情况下进行，搅拌15-20min。

所述步骤四中的硫酸钠溶液是浓度为2.2%（w/v）的硫酸钠溶液；海藻酸钠微胶囊与硫酸钠溶液的质量体积比是1：3-5。

本发明还请求保护所述饲用微生物微胶囊在动物饲料中的应用。所述动物包括常见的家畜、家禽和水产动物，优选地包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、草鱼、鲤鱼、青鱼、鲢鱼等常见的家畜、家禽和水产动物，特别优选的是猪，特别是断奶仔猪和育肥猪。其在饲料中的添加量为至少0.5%。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

第一，本发明独创地采用双层包埋的方式制备益生菌胶囊并运用于饲料领域，能够极好地保护益生菌通过胃液而进入肠道释放，这相比传统益生菌制剂而言，在胃液中大部分的益生菌被胃液的强酸性坏境杀死，而本发明的益生菌胶囊在胃液中的破坏率低，益生菌通过率高，能够有效到达肠道并发挥相应的益生功效。

第二，本发明在制备过程中独创性的采用了多种菌种保护成分，如常规的甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸；同时，发明人还独创地添加了枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸，三种成分在益生菌胶囊的制备过程中，能够较好的防止微生物细胞被化学试剂杀灭，也对于益生菌活性的保持发挥了不可磨灭的功效。

第三，本发明正是采用了发明人经过大量试验得到的最佳保护剂，巧妙地将枸杞多糖、色氨酸和低聚木糖组合后与常规的保护剂成分组合制备得到本发明的保护剂，以上成分之间相互协同，使得益生菌微胶囊中的活菌在保藏过程中保持较高的活性，而不会被加工过程中的化学成分和低温条件等破坏灭活或者受到损伤，同时菌体在保藏后的测定中保持了较高的增殖活性，因此，其效果明显优于对比实施例1-3的保藏活性。通过该试验可知，本发明的益生菌微胶囊的常温保藏周期长达90天，有利于饲料原料的保藏、运用和市场推广，特别是常温保藏的方式，不再需要农户采用低温冰箱保藏，方便养殖户采购使用，也有利于产品的市场推广和运用。

第四，经人工胃液处理后，实施例1-2中的益生菌的数量高于对比例1-3的活菌数量，而再次经过模拟肠液处理后，实施例1-2的益生菌的活菌数量仍远远高于对比例1-3的活菌数量，为对比例的3倍以上。以上释延能结果表明，本发明的独特配方相比对比例而言取得了预料不到的技术效果，能最大限度的保护益生菌在加工过程中收到伤害，保持较高的益生菌活性，从而更加有益动物健康。

第五，本发明实施例1和2的益生菌胶囊饲喂仔猪，在日均增重方面优于对比例和空白对照组，其日均增重率相较最佳的对比例2而言，其日均增重量也提高了近18g/d，且腹泻率也仅相当于对比例2的1/3，以上试验结果表明，本发明的益生菌胶囊相比对照组和对比例而言，在保护肠道健康和促进仔猪增重方面，取得了预料不到的技术效果。

总而言之，本发明的益生菌胶囊巧妙地将枸杞多糖、色氨酸和低聚木糖组合后与常规的保护剂成分组合制备得到本发明的保护剂，以上成分之间相互协同，使得益生菌微胶囊中的活菌在保藏过程中保持较高的活性，而不会被加工过程中的化学成分和低温条件等破坏灭活或者受到损伤，同时菌体在保藏后的测定中保持了较高的增殖活性，常温保藏的方式，不再需要农户采用低温冰箱保藏，方便养殖户采购使用，也有利于产品的市场推广和运用。

具体实施方式：

实施例1：一种饲用益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，分别对动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌进行活化、培养，获得动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌的菌液，而后分别离心获得菌泥沉淀，采用PBS洗涤菌泥沉淀2遍，离心后获得动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥；

步骤二，按照质量比1：2：1称取步骤一制备的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥，混合均匀后得到混合菌泥，将混合菌泥与保护剂按照质量体积比1：5的比例将混合菌泥悬浮到保护剂中，并震荡混合均匀，得到混合菌液；

步骤三，将步骤二制备得到的混合菌液与海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器吸取逐滴滴入到壳聚糖-氯化钙溶液中进行成膜反应，静止、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球，得到海藻酸钠微胶囊；

步骤四，将步骤三得到的海藻酸钠微胶囊浸入到硫酸钠溶液中，浸泡15min，而后静置、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球；

步骤五，将步骤四收集的微球分装后，放入-80℃的超低温冰箱中预冻2h，而后放入真空冷冻干燥机内，干燥至水分含量低于25%，即得到所述的饲用益生菌微胶囊。

其中步骤一所获得的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥中活菌数分别是2×10⁸CFU/g、2×10⁸CFU/g、3×10⁸CFU/g。

其中步骤二中所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

其中步骤三中的海藻酸钠溶液是称取一定量的海藻酸钠在40℃用蒸馏水溶解，配置成的浓度为2%（w/V）的海藻酸钠溶液；其中混合菌液与海藻酸钠溶液体积比为1：9；所述壳聚糖-氯化钙溶液是用浓度为2%（w/w）的乙酸溶液溶解一定量的壳聚糖，得到浓度为2.5%（w/w）的壳聚糖乙酸溶液，再加入氯化钙，得到氯化钙浓度为2.5%（w/v）的壳聚糖-氯化钙溶液；所述成膜反应是在搅拌的情况下进行，搅拌20min。

所述步骤四中的硫酸钠溶液是浓度为2.2%（w/v）的硫酸钠溶液；海藻酸钠微胶囊与硫酸钠溶液的质量体积比是1：4。

实施例2：一种饲用益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，分别对动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌进行活化、培养，获得动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌的菌液，而后分别离心获得菌泥沉淀，采用PBS洗涤菌泥沉淀3遍，离心后获得动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥；

步骤二，按照质量比1：2：1称取步骤一制备的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥，混合均匀后得到混合菌泥，将混合菌泥与保护剂按照质量体积比1：5的比例将混合菌泥悬浮到保护剂中，并震荡混合均匀，得到混合菌液；

步骤三，将步骤二制备得到的混合菌液与海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器吸取逐滴滴入到壳聚糖-氯化钙溶液中进行成膜反应，静止、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球，得到海藻酸钠微胶囊；

步骤四，将步骤三得到的海藻酸钠微胶囊浸入到硫酸钠溶液中，浸泡15min，而后静置、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球；

步骤五，将步骤四收集的微球分装后，放入-80℃的超低温冰箱中预冻2h，而后放入真空冷冻干燥机内，干燥至水分含量低于25%，即得到所述的饲用益生菌微胶囊。

其中步骤一所获得的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥中活菌数分别是2×10⁸CFU/g、2×10⁸CFU/g、3×10⁸CFU/g。

其中步骤二中所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

其中步骤三中的海藻酸钠溶液是称取一定量的海藻酸钠在40℃用蒸馏水溶解，配置成的浓度为2%（w/V）的海藻酸钠溶液；其中混合菌液与海藻酸钠溶液体积比为1：8；所述壳聚糖-氯化钙溶液是用浓度为2%（w/w）的乙酸溶液溶解一定量的壳聚糖，得到浓度为2.5%（w/w）的壳聚糖乙酸溶液，再加入氯化钙，得到氯化钙浓度为2.5%（w/v）的壳聚糖-氯化钙溶液；所述成膜反应是在搅拌的情况下进行，搅拌15min。

所述步骤四中的硫酸钠溶液是浓度为2.2%（w/v）的硫酸钠溶液；海藻酸钠微胶囊与硫酸钠溶液的质量体积比是1：5。

实施例3：对比实施例的设置

由于益生菌制剂发挥相关作用的关键在于益生菌的活菌含量，而在加工过程中，益生菌的活性极易受到外界环境的影响而导致益生菌死亡，因此，保证生产过程中益生菌的活性极其重要，因而，发明人在研发过程中，着重对保护剂的相关成分进行了研究，在大量试验的基础上，筛选得到本发明最佳的保护剂。以下记录了本发明研发过程中较佳的保护剂成分，虽然其保护效果略差于本发明，但也给与了发明人诸多启示，在此一并论述，特设置对比实施例1-3。以下三个对比实施例除保护剂与实施例1不同外，其他条件均与实施例1相同。

对比实施例1：保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，海藻糖10%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、海藻糖分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到对比实施例1所述的保护剂。

对比实施例2：保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到对比实施例2所述的保护剂。

对比实施例3：保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，海藻糖8%，低聚木糖3.5%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、海藻糖、低聚木糖分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到对比实施例3所述的保护剂。

实施例4：稳定性试验

取饲用益生菌微胶囊约1g，以铂纸密封，分别于37℃下分别于第1天、第30天、第60天、第90天的取样，测其中的活菌数a，初始微胶囊中活菌数为a0，求出各温度下保存不同时间后的相对活性(A=a/a0*100%)，结果如下表：

表1 稳定性试验结果

基于以上稳定性试验结果可知，本发明实施例1-2的饲用益生菌微胶囊能够较好的保持益生菌微生物的活性，其在历经60天保藏后，仍保持90%以上的益生菌活性，在经过90天常温保藏后，其活性仍然达到80%以上，符合相关的饲料使用标准。而对比实施例1-3在第60天时，其活性均下降到80%以下，不再符合相关的饲料使用标准，而经过90天的保藏，相关微胶囊中的益生菌已经大部分失活，完全失去商品价值。基于以上实施例和对照实施例的比较可知，期间的差异主要在于保护剂成分的不同，本发明实施例1、2正是采用了发明人经过大量试验得到的最佳保护剂，巧妙地将枸杞多糖、色氨酸和低聚木糖组合后与常规的保护剂成分组合制备得到本发明的保护剂，以上成分之间相互协同，使得益生菌微胶囊中的活菌在保藏过程中保持较高的活性，而不会被加工过程中的化学成分和低温条件等破坏灭活或者受到损伤，同时菌体在保藏后的测定中保持了较高的增殖活性，因此，其效果明显优于对比实施例1-3的保藏活性。通过该试验可知，本发明的益生菌微胶囊的常温保藏周期长达90天，有利于饲料原料的保藏、运用和市场推广，特别是常温保藏的方式，不再需要农户采用低温冰箱保藏，方便养殖户采购使用，也有利于产品的市场推广和运用。

实施例5：益生菌胶囊在模拟胃液和肠液中的活性

人工模拟胃液的配制：取稀1M盐酸16.4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。

人工模拟肠液的配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，即得。

将2g微胶囊均匀地分散到20ml在37℃孵育的人工模拟胃液中，孵育1h后，取出一半，测定其中的活菌数；剩余的一半，加入37℃温育的人工模拟肠液20ml，孵育1h后，测定其中的活菌数，结果如下表2：

表2 胃液和肠液处理结果

由以上实验结果可知，经人工胃液处理后，实施例1-2中的益生菌的数量高于对比例1-3的活菌数量，而再次经过模拟肠液处理后，实施例1-2的益生菌的活菌数量仍远远高于对比例1-3的活菌数量，为对比例的3倍以上。以上释延能结果表明，本发明的独特配方相比对比例而言取得了预料不到的技术效果，能最大限度的保护益生菌在加工过程中收到伤害，保持较高的益生菌活性，从而更加有益动物健康。

实施例6：益生菌胶囊对断奶仔猪平均日增重和腹泻率的影响

选取出生日期相近、未断奶仔猪120头，待到合适的断奶时机，统一进行断奶处理。将所筛选的120头断奶仔猪平均分为空白对照组、实施例1试验组、实施例2试验组，对比试验例1-3试验组，每组20头，每组4个重复，每个重复5头。在仔猪刚断奶时每天早晨6点喂食前空腹称重，计算每组断奶仔猪的平均日增重和腹泻率，试验天数为30ｄ。试验组所采用的仔猪饲料中均添加有0.5%质量百分比的相应实施例的益生菌胶囊，空白对照组采用常规的仔猪饲料进行饲喂，仔猪均自由哺乳和采食。其中腹泻率计算：每天观察每组猪群的健康状况，记录腹泻情况，最后以组为单位统计仔猪腹泻头数（１头断奶仔猪腹泻１天记１次腹泻)。

表3 益生菌胶囊对断奶猪平均日增重和腹泻率的影响

由以上表3的试验结果可知，本发明实施例1和2的益生菌胶囊饲喂仔猪，在日均增重方面优于对比例和空白对照组，其日均增重率相较最佳的对比例2而言，其日均增重量也提高了近18g/d，且腹泻率也仅相当于对比例2的1/3，以上试验结果表明，本发明的益生菌胶囊相比对照组和对比例而言，在保护肠道健康和促进仔猪增重方面，取得了预料不到的技术效果。

实施例7：对于某北农的繁殖猪场进行饲喂试验，在断奶仔猪饲料中添加0.8%的本发明实施例1的益生菌胶囊，观察仔猪的生长和腹泻情况，反馈结果表明，采用益生菌胶囊能够改善仔猪的生长状况，仔猪增重情况得到改善，腹泻率和死亡率降低，而且相比传统的益生菌制剂具有更好的技术效果。

对于雏某农牧在本地的生猪养殖场进行饲喂试验，在育肥生猪饲料中添加0.5%的本发明实施例2的益生菌胶囊，观察育肥猪的育肥情况和腹泻情况，结果表明，相比传统的益生菌制剂，本发明的益生菌胶囊能提高日均增重约2%左右，且腹泻率降低了20个百分点以上。

Claims (9)

1.一种饲用益生菌微胶囊，其特征在于，所述饲用益生菌微胶囊中的益生菌由动物双歧杆菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌组成，所述饲用益生菌胶囊还包括保护剂；所述保护剂包括甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖、色氨酸和无菌水。

2.根据权利要求1所述的饲用益生菌胶囊，其特征在于：所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

3.根据权利要求1或2所述的饲用益生菌胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，分别对动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌进行活化、培养，获得动物双歧杆菌、屎肠球菌和干酪乳杆菌的菌液，而后分别离心获得菌泥沉淀，采用PBS洗涤菌泥沉淀2-3遍，离心后获得动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥；

步骤二，按照质量比1：2：1称取步骤一制备的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥，混合均匀后得到混合菌泥，将混合菌泥与保护剂按照质量体积比1：5的比例将混合菌泥悬浮到保护剂中，并震荡混合均匀，得到混合菌液；

步骤三，将步骤二制备得到的混合菌液与海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器吸取逐滴滴入到壳聚糖-氯化钙溶液中进行成膜反应，静止、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球，得到海藻酸钠微胶囊；

步骤四，将步骤三得到的海藻酸钠微胶囊浸入到硫酸钠溶液中，浸泡15min，而后静置、过滤、收集微胶囊球体，用灭菌的PBS洗涤微球；

步骤五，将步骤四收集的微球分装后，放入-80℃的超低温冰箱中预冻2h，而后放入真空冷冻干燥机内，干燥至水分含量低于25%，即得到所述的饲用益生菌微胶囊。

4.根据权利要求3所述的饲用益生菌胶囊的制备方法，其特征在于，其中步骤一所获得的动物双歧杆菌菌泥、屎肠球菌菌泥和干酪乳杆菌菌泥中活菌数分别是2×10⁸CFU/g、2×10⁸CFU/g、3×10⁸CFU/g。

5.根据权利要求3所述的饲用益生菌胶囊的制备方法，其特征在于，其中步骤二中所述保护剂包括以下重量百分含量的成分：甘油2%，脱脂奶粉7.8%，抗坏血酸0.75%，枸杞多糖7.5%，低聚木糖3.5%，色氨酸0.2%，其余为无菌水；所述保护剂采用如下方法制备得到：将甘油、脱脂奶粉、抗坏血酸、枸杞多糖、低聚木糖和色氨酸分别灭菌后，混合，溶解于无菌水中，搅拌均匀即得到所述的保护剂。

6.根据权利要求3所述的饲用益生菌胶囊的制备方法，其特征在于，其中步骤三中的海藻酸钠溶液是称取一定量的海藻酸钠在40℃用蒸馏水溶解，配置成的浓度为2%（w/V）的海藻酸钠溶液；其中混合菌液与海藻酸钠溶液体积比为1：8-9；所述壳聚糖-氯化钙溶液是用浓度为2%（w/w）的乙酸溶液溶解一定量的壳聚糖，得到浓度为2.5%（w/w）的壳聚糖乙酸溶液，再加入氯化钙，得到氯化钙浓度为2.5%（w/v）的壳聚糖-氯化钙溶液；所述成膜反应是在搅拌的情况下进行，搅拌15-20min。

7.根据权利要求3所述的饲用益生菌胶囊的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的硫酸钠溶液是浓度为2.2%（w/v）的硫酸钠溶液；海藻酸钠微胶囊与硫酸钠溶液的质量体积比是1：3-5。

8.权利要求1或2所述的饲用益生菌微胶囊在动物饲料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物包括常见的家畜、家禽和水产动物，优选地包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、草鱼、鲤鱼、青鱼、鲢鱼等常见的家畜、家禽和水产动物，特别优选的是猪，特别是断奶仔猪和育肥猪，其在饲料中的添加量为至少0.5%。