CN101663406A - 用于得到未知生物分子和单链核酸的结合谱的核酸芯片及其制备方法和利用该核酸芯片分析未知生物分子的方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种为用于得到未知生物分子和单链核酸的结合谱的核酸芯片及其制备方法和利用该核酸芯片分析未知生物分子的方法。所述核酸芯片用于分析生物样本中所含的未知生物分子的生物学意义。所述核酸芯片是通过以下步骤制备的：使含有未知生物分子的生物样本和具有任选的碱基序列的任选单链核酸进行反应，以确定能够与未知生物分子结合的结合生物分子的单链核酸；以及合成捕获单链核酸，该捕获单链核酸包括确定的结合生物分子的单链核酸和/或具有与所述确定的结合生物分子的单链核酸的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸；以及使所述捕获单链核酸固定在基底上。

Description

用于得到未知生物分子和单链核酸的结合谱的核酸芯片及其制备方法和利用该核酸芯片分析未知生物分子的方法

技术领域

本发明涉及一种用于得到未知生物分子和单链核酸的结合谱的核酸芯片及其制备方法，以及利用该核酸芯片的分析未知生物分子的方法。

背景技术

用于获得未知的生物分子(蛋白质和碳水化合物)图谱的技术，随着物理学、生物化学和生物信息学的发展而发展。但是现有的方法和装置在其使用以及维护费、简易性、准确度、敏感度、检测时间和过程的自动化等方面存在很多问题，因此，对有效的新方法和装置的需求很高。

用于生成生物样本中的未知生物分子的定量状态的综合信息(即未知生物分子的图谱(profile)的方法，不是最终的目标，而是为了达到目标的一种手段，但是因为可用于微生物、细胞、组织等，所以被广泛应用于医学、兽医学、环境工程、食品工程、农业等领域。

核酸是核苷酸通过共价键连接的线性多聚体，核苷酸是小分子有机化合物，由磷酸、糖和嘌呤(腺嘌呤或者鸟嘌呤)或者嘧啶(胞嘧啶、胸嘧啶、或尿嘧啶)组成。核酸以单链或者双链形式存在。单链核酸在特定的物理条件下通过核苷酸之间的氢键和相互作用来结合，而形成独特的空间结构，但这种空间结构由单链的碱基序列所决定。

核酸(例如脱氧核糖核酸(DNAs)和核糖核酸(RNAs))是用于表达细胞结构和酶等具有活性的蛋白质的信息的储存体。在1982年发现RNA能够形成具有酶活性的复杂二级结构的报道后，有很多对核酸的结构特性及其相关特定功能的报道。

由4个碱基的重复单位构成的核酸，以高密度的多种空间结构的形式存在，这样的空间结构能够与特定物质相互作用而形成稳定的复合物。

某些核酸能够用作包括蛋白质在内的特定分子的配体。从具有多种碱基序列的单链核酸的文库中，通过筛选过程和碱基序列，筛选出能够以高亲合力(affinity)和特异性与特定物质结合的核酸。

使用体外反复筛选技术，称作指数级富集的配体***进化技术(SELEX，Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)，从能够高亲合力和特异性地与多种特定分子(例如蛋白质)结合的任意的核酸文库中识别出核酸配体、末端适配体(aptamer)((Tuerk C.and Gold L.；Science，249，pp505-510，1990)。

SELEX技术实现了对能够以高亲合力结合于生物分子(如蛋白质)的核酸(适配体)的筛选，而无论这些生物分子在自然条件下是否与核酸结合。

在对与特定生物分子(例如蛋白质)特异性地结合的核酸进行筛选之前，需要使所述特定生物分子对于常规的SELEX方法来说是安全的。也就是说，根据常规的SELEX方法，能够结合于感兴趣的核酸的蛋白质(即，所述特定生物分子)首先能够通过大量的生产和纯化而获得，然后与单链核酸库进行反应，随后进行反复筛选和扩增，以选择具有高度亲合力的核酸(适配体)。因此，通过SELEX的常规的核酸筛选方法，并不能够完全没有认识到关于筛选并利用作为对于生物样本中的多种“未知生物分子”种群具有生物学意义的核酸组的全部技术精神。

包括未知分子的生物分子的图谱(例如，在生物样本中发现的如组织、细胞聚集物、单细胞、微生物等)是通过利用其物理和化学性质的多种方法制备的。例如，可以利用生物分子的分子量或者pI值等进行电泳，从而给出显示生物样本中的生物分子的定量状态的图谱。

此外，还可以对所述图谱进行分析以确定有用的生物分子，将这些有用的生物分子分离出并用MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight)等方法确认。近年来，进行着很多根据SELDI-TOF-MS(Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry)的蛋白质谱的研究(Adam et al.，Cancer Research，62，3609-3614.2002；Li et al.，Clinical Chemistry，48，1296-1304.2002；andPetricoin et al.，The Lancet，359，572-577.2002)。

并且最近通过高通量地筛选(High Throughput Screening)蛋白质物质，开发了蛋白质芯片(Protein chip)或者适配体芯片(Aptamer chip)(Smith etal.，Mol Cell Protomics，11-18.2003；and McCauley et al.，Anal Biochem，319(2)，244-250.2003)。

蛋白质芯片(在独立的区域中以有序的方式固定的不同蛋白质分子如抗体)能够用于对感兴趣的物质进行识别和定量。最常见的蛋白质芯片为抗体微列阵，其中利用微阵列点样器(Microarrayer)所述抗体被点样(spotting)在所述蛋白质芯片上。为了以一个芯片能够提供尽可能多的信息，蛋白质芯片必须能够在狭窄的面积中高密度地集成多种抗体，并且检测方法必须能够检测到产生的非常弱的信号。此外，随着对蛋白质生物信息的增加，其集成度向着更高的趋势发展，因此，需要定性并定量地更快速、准确地分析蛋白质芯片的新方法。

目前优选的检测方法是激光诱导的荧光检测法(laser inducedfluorescence)，还开发出了电化学检测方法。如上所述，提供了通过使用蛋白质芯片的用于获得和分析生物样本中特定蛋白质的多种技术。然而，这些方法存在以下缺点：需要使用昂贵的装置和试剂；需要进行复杂的过程；以及只能应用于抗体分子。

适配体芯片中，所述蛋白质芯片上除了使用适配体(核酸)代替例如抗体以外，其它要素非常相似。

如上所述，开发的用于揭示生物样本中的生物分子的定量状态的利用蛋白质芯片和适配体，存在使用昂贵的装置和试剂、以及需要进行复杂的操作的缺点。尤其是，开发的蛋白质芯片或适配体芯片还受到从其中制作抗体或者适配体的蛋白质的限制。

生物样本由数百万个蛋白质组成，但是现在已知的蛋白质的数量只不过数万个。因此，需要能够获得生物样本中的未知生物分子(如未知蛋白)的定量状态(即图谱)的技术。

在总体上分析生物样本的生物分子的研究，可以用于通过分析医学上与疾病相关的生物分子的谱来查明可以诊断疾病的生物分子、可以分析治疗效果的生物分子、对疾病发病和进程起重要作用的生物分子、与对疾病的灵敏度相关的生物分子、以及作为新药开发的靶标的生物分子等。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够生成生物样本中含有的未知的生物分子和单链核酸的结合谱的核酸芯片，并利用该核酸芯片通过生成的结合谱来分析包括与未知的生物分子相关的疾病信息在内的各种生物学意义。

根据本发明，提供一种用于生成单链核酸和未知的生物分子的结合谱的核酸芯片及其制备方法，以及利用所述核酸芯片的对未知生物分子进行分析的方法。根据本发明的核酸芯片可以用于分析生物样本中含有的未知的生物分子的生物学意义。

根据本发明的核酸芯片的制备方法，其中，该方法包括：第一步骤，使含有未知生物分子的生物样本和具有任选碱基序列的任选单链核酸进行反应，以确定能够与未知生物分子结合的结合生物分子的单链核酸；以及第二步骤，合成捕获单链核酸并将该捕获单链核酸固定在基底上，所述捕获单链核酸包括确定的结合生物分子的单链核酸和/或具有与所述确定的结合生物分子的单链核酸的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸。

根据本发明的核酸芯片包括固体基底，该固体基底固定有捕获单链核酸；该捕获单链核酸包括能够与所述未知生物分子相结合的结合生物分子的单链核酸，和/或与所述结合生物分子的单链核酸互补的单链核酸。

根据本发明的对未知生物分子进行分析的方法包括以下步骤：制备根据本发明的核酸芯片；使与所述核酸芯片的捕获单链核酸具有相同的碱基序列的单链核酸和所述生物样本中的未知生物分子反应，以形成生物分子-靶单链核酸的复合物，并分离(separating)所述生物分子-靶单链核酸的复合物；对所述生物分子-靶单链核酸的复合物中的靶单链核酸进行分离(isolating)、扩增和标记；使标记的所述靶单链核酸和所述核酸芯片的捕获单链核酸反应，从所述标记的靶单链核酸在所述芯片上的分布中得到结合谱；将得到的结合谱与先前存在的结合谱数据进行比较，以分析所述未知生物分子的生物学意义。

本发明的原理是，将核酸芯片(其中捕获单链核酸与能够结合未知生物分子的结合生物分子单链核酸互补)固定在基底(用于获得所述捕获单链核酸与分离自生物分子-靶单链核酸的复合物的靶单链分子之间的杂交性能，所述生物分子-靶单链核酸复合物是由感兴趣的未知生物分子与结合生物分子的单链核酸的联合所产生的)上，以分析杂交性能(即，所述未知生物分子与所述单链核酸之间的结合谱)。因此，使用与能够与未知生物分子结合的所述单链核酸相互补的单链核酸，作为所述芯片上的捕获单链核酸。但是，在分析未知的生物分子的过程中，在扩增从生物分子-靶单链核酸的复合物中分离的靶单链核酸的过程中，也会产生同能够与未知生物分子结合的靶单链核酸互补的单链核酸(具有与保留在所述靶单链核酸中的信息相同或相似的信息)。因此，能够结合未知生物分子的结合生物分子的单链核酸也可以用作所述芯片的捕获单链核酸。此外，可以同时将结合生物分子的单链核酸和与所述结合生物分子的单链核酸互补的单链核酸用作所述捕获单链核酸。

利用根据本发明的核酸芯片分析未知的生物分子，能够积累到广泛的图谱数据。从这些数据中，能够自然地发现对未知生物分子的生物学意义的分析有贡献的特异性单链核酸，由此可以发掘出对分析未知生物分子具有意义的单链核酸。

能够适用根据本发明的核酸芯片的所述生物样本包括细菌、真菌、病毒、细胞、以及组织等。可以通过根据本发明的核酸芯片分析其生物学意义的生物分子选自由蛋白质、碳水化合物、脂质、碳酸氢盐、多糖、糖蛋白、激素、受体，抗原、抗体、酶、以及它们的组合所组成的组中。

根据本发明的核酸芯片的制备方法中，第一步骤是使含有未知的生物分子的生物样本和具有任选碱基序列的单链核酸(以下称为“任选单链核酸”)反应，以确定能够与未知的生物分子结合的单链核酸(以下称为“结合生物分子的核酸”)。

优选地，结合生物分子的单链核酸的确定可以通过以下步骤实现：使所述生物样本的未知生物分子与任选的单链核酸反应，以制备生物分子-单链核酸的复合物；对所述生物分子-单链核酸的复合物进行清洗，基于所述单链核酸对所述生物分子的亲合力，筛选其中的单链核酸与所述生物分子以预期的程度或更好的程度进行结合的复合物；从筛选到的所述复合物中分离出单链核酸，并对该单链核酸进行扩增；以及将扩增的单链核酸克隆至载体中，并确定所述单链核酸的碱基序列。

对所述生物分子-单链核酸的复合物的筛选和扩增可以反复地进行多次。但是，由于生物样本含有多种不同量的生物分子，因此，相对于反复地进行结合生物分子的单链核酸的筛选和扩增的循环方法，优选通过仅进行一次选择和扩增后并多次清洗的线性方法来制备。

所述任选单链核酸可以为通过将具有如下的任选碱基序列的单链DNA寡核苷酸转换成双链DNA后，通过体外转录(in vitro transcription)而制备得到的任选的RNAs。

5′GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N₄₀ CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3′(这里划线的碱基排列是恒定区(invariable regions)，N₄₀是表示在各位置上A、G、T、C四个碱基以相同浓度存在。)

用于PCR(聚合酶链式反应)的如SEQ ID NO.1所示的FW引物(5′-GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3′：)能与上面碱基排列的划线部分碱基的5’端进行碱基配对，并含有噬菌体T7的RNA聚合酶的启动子碱基序列。

用于PCR的如SEQ ID NO.2所示的RE引物(5′-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3′)能与上面碱基排列的划线部分碱基的3’端进行碱基配对。

结合生物分子的单链核酸为含有’-F-取代嘧啶碱基的单链RNA，并且可以通过体外转录和纯化而制备。

含有合成的任选单链核酸的溶液(以10¹⁵碱基序列/lml的浓度)可以与生物分子反应30分钟。

将由结合生物分子单链核酸得到的RT-PCR(反转录PCR)产物***到载体中，以固定单克隆，该单克隆可以用于确定结合生物分子的单链核酸的碱基序列。

此时在反应温度比进行SELEX的温度低的温度下，进行单链核酸与生物分子之间的反应，优选在20至37℃的温度中进行。

通常，所述反应在存在过量的蛋白质和单链核酸的情况下进行，以防止结合生物分子的单链核酸的非特异性结合。优选使用酵母tRNA(yeasttRNA)、鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)或者人胎盘基因DNA(humanplacental DNA)。

在制备核酸芯片的方法中，第二步骤是将确定的结合生物分子的单链核酸和/或捕获单链核酸固定在基底上，所述捕获单链核酸具有与所述确定的结合生物分子的单链核酸的碱基序列互补的序列。

由于所述捕获单链核酸是对杂交程度产生很大影响的核心要素，所以其碱基序列的确定非常重要。固定在本发明的核酸芯片上的各捕获单链核酸由特定(unique)的碱基组成，所述捕获单链核酸和靶单链核酸的杂交(hydrids)需要维持适当的Tm值。因此，所述杂交的杂交程度需要维持未被荧光标记的靶单链核酸污染的信号值。

因此，所述捕获单链核酸的碱基序列是由在上述第一步骤中从任选的单链核酸中筛选的结合生物分子的单链核酸的碱基序列所确定的。优选情况下，所述捕获单链核酸为具有16bp至60bp的碱基序列的寡核苷酸。

所述核酸芯片的基底可以为无机基底(如玻璃或硅)或聚合体基底(如PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene))，优选为玻璃基片(glass slide)。所述基底可以被使用以氨基或者醛基涂覆。例如，所述捕获单链核酸可以按顺序固定在涂覆了GAPS(伽玛氨基丙基硅烷)的基片(例如，UltraGAPSTM涂覆的基片(Corning公司))上，以制作核酸芯片。

在根据本发明的核酸芯片的制备中，可以使用微阵列***(Microarrayersystem)，将各个捕获单链核酸溶于可控浓度的缓冲液中。此时，在点样时，阵列中的湿度维持70至80％。在湿盒(humidified chamber)中孵育后，将点样的玻片在UV交联器(crosslinker)中进行烘烤(baking)。

在将所述捕获单链核酸固定在玻璃基片上后，立刻将基片进行离心干燥并避光保存。

可以通过已知的多种方法(M.schena；DNA microarray；a practicalapproach，Oxford，1999)来制作其中规则地分布有所述捕获单链核酸的核酸芯片。

只要所述核酸芯片能够准确地分析未知生物分子的生物学意义，考虑到制造成本和分析效率，减少所述核酸芯片上固定的捕获单链核酸的个数是有益的。

因此，本发明的核酸芯片的制备方法可以进一步包括下面的步骤：对各捕获单链核酸对未知生物分子的生物学意义的贡献度进行分析，并根据对未知生物分子的生物学意义的贡献度来筛选所述捕获单链核酸，以减少固定在所述芯片上的捕获单链核酸的个数。

根据蛋白质基底的高通量筛选，根据本发明的核酸芯片和分析方法能够以较低的成本进行简单、高效的分析。由于具有获得包括微生物、细胞、蛋白质在内的生物样本中的未知的生物分子的谱的能力，因此，所述芯片和方法可以用作分析包括医学、兽医学、环境工程、食品工程、农业等在内广泛的领域中的未知的生物分子的生物学意义的工具。

在分析未知的生物分子的生物学意义的过程中，根据本发明的核酸芯片和分析方法不仅能检测未知的生物分子的生物学功能并确定所述生物分子的结构，还能用于筛选特异性地结合于生物分子的单链核酸。因此，使用筛选的单链核酸，所述芯片和分析方法可以用于准确地了解所述生物分子的功能。

在对生物样本的全部生物分子的研究中，与疾病相关的生物分子的谱的研究对以下生物分子的确定中是有用和有效的：能够用作诊断标记的生物分子、能够监测疾病结果的生物分子，在疾病的发病和进程中起重要作用的生物分子、对特定的疾病具有灵敏度的生物分子、以及作为新药开发的靶标的生物分子等。

附图说明

下面将参考以下附图对本发明的上述和其它目的、特点和其它优点进行更加详细的描述，其中，

图1是显示用于确定制备本发明的核酸芯片所必需的结合生物分子的单链核酸(SSNA)的过程的示意图；

图2是说明获得生物分子和本发明的核酸芯片上的单链核酸之间的结合谱的过程的示意图；

图3显示了使用根据本发明的核酸芯片而生成的(A)健康人和(B)稳定性心绞痛患者(stable angina pectoris patient)的血清谱；

图4是说明通过利用根据本发明的核酸芯片并使用根据疾病而分类的患者的血液来构建谱数据库的流程的示意图；

图5是说明通过利用根据疾病类型构建的谱数据库和人工神经网络算法的程序来诊断患者疾病的流程的示意图；

图6是说明通过利用根据本发明的核酸芯片生成的人血清蛋白质谱(protein profiles)的数据库和人工神经网络算法的程序来诊断心血管疾病而获得的结果的图；

图7是说明通过利用根据本发明的核酸芯片生成的人血清蛋白质谱(protein profiles)的数据库和人工神经网络算法的程序来诊断肝癌而获得的结果的图；

图8是说明通过利用根据本发明的核酸芯片生成的人血清蛋白质谱(protein profiles)的数据库和人工神经网络算法的程序来诊断肝癌转移而获得的结果的图；

图9是说明通过利用根据本发明的核酸芯片生成的人血清蛋白质谱(protein profiles)的数据库以确定心血管疾病患者的生物分子特征的过程的图；

图10是说明通过利用根据本发明的核酸芯片生成的人血清蛋白质谱(protein profiles)的数据库以确定心肌梗塞患者的血清中特异性地存在的蛋白质的光谱(spectrum)的图；

图11是显示通过对利用根据本发明的核酸芯片而获得的谱进行分析而筛选到的单链核酸向肺癌细胞株NCI-H1299的结合的图；

图12是显示通过对存在于大肠杆菌和沙门氏菌的表面的生物分子的谱进行分析而筛选到的结合生物分子的单链分子对大肠杆菌KCTC 12006和沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)的特异性的图；

图13是显示利用根据本发明的核酸芯片选定的对大肠杆菌具有特异性的结合生物分子的结合单链核酸和纳米金粒子，在对污染了大肠杆菌的食物的定性和定量分析中的应用的图。

具体实施方式

以下，参照附图和实施例详细说明根据本发明的核酸芯片、该核酸芯片的制备方法、以及利用该核酸芯片的未知的生物分子的分析方法。以下的具体例子只是举例地说明本发明，不能限制本发明的范围。

实施例1结合于人血清蛋白的单链核酸的制备

如图1所示，利用具有如下任选碱基序列的单链核酸的DNA寡核苷酸，通过PCR(聚合酶链式反应)制备双链DNA后，通过体外转录制造单链核酸的RNA文库(任选的单链核酸)。

5′-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N₄₀

CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3′(这里划线的碱基排列是恒定区(invariable regions)，N₄₀是表示在各位置上A、G、T、C四个碱基以相同浓度存在。)

用于PCR的如SEQ ID NO.1所示的FW引物能与上面碱基排列的划线部分的碱基5’端进行碱基配对，并包括噬菌体T7的RNA聚合酶的启动子碱基序列。用于PCR的SEQ ID NO.2的RE引物能与上面碱基排列的划线部分的碱基3’端进行碱基配对。FW和RE引物为以后的克隆分别含有EcoRI和BamHI限制性内切酶的限制性酶切位点。

与生物样本反应的任选的单链核酸构成包括2’-F-取代嘧啶的RNA文库。在PCR引物的存在下，通过PCR将DNA单链核酸文库转录体转换成双链DNA转录体，随后在体内进行转录。

PCR是将作为模版的1,000pmoles单链核酸转录体、2,500pmoles PCR的引物对(5P7)在50mM KCl、10mM Tris-Cl(pH 8.3)、3mM MgCl₂、0.5mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、0.1U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer、Foster City Calif.)中进行的，之后，用QIAquick-spin PCR纯化柱(QIAGENInc.，Chatsworth Calif.)纯化。

具有2’-F-取代嘧啶的任选的单链核酸是通过双链DNA的体外转录合成并纯化而准备。将200pmoles双链DNA转录体、40mM Tris-Cl(pH 8.0)、12mM MgCl₂、5mM DTT、1mM亚精胺、0.002％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、4％PEG 8000、5U T7RNA聚合酶、还有1mMATP、GTP以及3mM 2′F-CTP、2′F-UTP，在37℃中反应6-12小时后，用Bio-Spin 6层析柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules Calif.)纯化后，利用紫外分光光度计检测纯化的核酸的量及其纯度。

将含有10¹⁵碱基序列/ml的浓度的所述合成的任选的单链核酸的溶液，以200pmol/200μl的浓度加入在选择缓冲溶液(50mM Tris·Cl(pH7.4)、5mMKCl、100mM NaCl、1mM MgCl₂、0.1％NaN₃)中，80℃下加热10分钟后，在冰上放置10分钟。添加使用的单链核酸的5倍量的酵母tRNA(酵母tRNA，Life Technologies公司)和0.2％BSA(牛血清白蛋白，Merck公司)准备反应溶液。

将10μl的血清样本添加在90μl的PBS溶液中，放入硝酸纤维素膜盘(nitrocellulose membrane disc)，一边晃动一边反应30分钟。将上述准备的RNA单链核酸在附着血清样本的膜盘上进行处理反应30分钟。

能够与人血清样本(生物分子)结合的单链RNA是筛选的首要目标。在所述单链RNAs与人血清样本的反应后，以多种清洗缓冲液反复清洗过程，以通过一次的选择过程确保人血清蛋白(生物分子)-单链核酸复合物。

使用0至1×SELEX缓冲液或者0至500mM EDTA溶液作为生物分子-单链核酸复合物的清洗缓冲液。将分离的复合物进行RT-PCR，以制备能够指示结合于血清蛋白的RNA(生物分子结合单链核酸)的DNA池。此时，也可以多次反复上述的选择和扩增过程，以构建结合生物分子的单链核酸。

随后，将获得的RT-PCR产物DNA克隆在在质粒上而确保单克隆。根据标准方法分离所述质粒并使用该质粒来确定结合生物分子的单链核酸的碱基序列。

用于为了生成生物分子的谱的根据本发明的核酸芯片的捕获单链核酸的碱基序列与能够与人血清蛋白(生物分子)结合的单链核酸或结合生物分子的单链RNAs的碱基序列互补。因此，在使用模拟核酸的二级结构的MFOLD程序确认结合生物分子的单链RNAs的二级结构和该二级结构的自由能后，通过筛选具有最高稳定度的二级结构的结合生物分子的单链RNAs来确定所述捕获单链核酸。

实施例2核酸芯片的制备

化学合成(Bioneer公司，韩国)具有与实施例1中确定的约3,000多个结合生物分子的单链RNAs的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸(寡核苷酸)，作为固定在玻璃基片上的捕获单链核酸。

将所述捕获单链核酸按顺序固定在GAPS(伽玛氨基丙基硅烷)的基片(如UltraGAPSTM涂覆的基片(Corning公司))上，以制备核酸芯片。

核酸芯片的制作使用别针(pin)方式的微阵列***(Microarrayer system，GenPak公司)，点间距(spot spacing)是使点中心间距(center-to-center)达到370μm。将各捕获单链核酸溶于标准溶液中并调节浓度。此时阵列中的湿度维持70％，进行点样(spotting)。点样的载片在湿盒(humidified chamber)中放置24-48小时后，在UV交联器(crosslinker)中进行烘烤(baking)。用公知的方法将捕获单链核酸固定在基片上后，立刻将基片进行离心干燥后，避光保存。

实施例3人血清(生物分子)-靶单链核酸复合物和靶单链核酸的制备

将用于携带用以制备所述核酸芯片的结合生物分子的单链核酸的实施例1中制得的质粒等量混合，以准备为了准备与未知的生物分子结合的单链核酸池的转录体的质粒池。与人血清蛋白结合的单链核酸池是使用化学合成的PCR引物并随后进行体外转录而从所述质粒池中制得的。

在准备的质粒池中将1pg质粒作为转录体，在含有100pM 5′-引物、100pM 3′-引物、dNTP混合物(5mM dATP、5mM dCTP、5mM dGTP、5mM dTTP)的PCR缓冲溶液中通过标准PCR方法以94℃30秒、52℃30秒、72℃20秒的条件，反复进行30次循环，合成双链核酸，用QIAquick-spin PCR纯化柱(QIAGEN Inc.，Chatsworth Calif.)纯化。

通过体外转录合成具有2’-F-取代嘧啶的靶单链RNAs，并进行纯化。

将200pmoles双链DNA转录体、40mM Tris-Cl(pH 8.0)、12mM MgCl₂、5mM DTT、1mM亚精胺、0.002％Triton X-100、4％PEG 8000、5U T7RNA聚合酶、还有1mM ATP、GTP以及3mM 2′F-CTP、2′F-UTP在37℃中反应6-12小时后，用Bio-Spin 6层析柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules Calif.)纯化。

用于分析的人血清是健康人和稳定性心绞痛(angina prctoris)患者的血清，将10μl的血清样本添加在90μl的PBS溶液中，放入硝酸纤维素膜盘(nitrocellulose membrane disc)，一边晃动一边反应30分钟来准备样本。加入上述准备的100-400ng的靶单链RNAs反应30分钟，形成生物分子-靶单链RNA复合物。

将准备的单链RNA在附着血清样本的盘(disc)上进行处理反应30分钟。用选择缓冲液或者50mM EDTA洗3次，分离获得反应产物。

将附着血清蛋白质(生物分子)-靶单链核酸的盘(disc)在RT-PCR溶液中进行处理而进行RT-PCR来准备以Cy-5标记的引物(5′-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3′：SEQ ID NO.3)。在上述准备的质粒池中，利用准备的靶单链核酸，使用标记Cy-3的引物(5′-Cy3-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3′)，按照与上述相同的方法进行RT-PCR。将上述两种溶液按等量混合制作靶单链核酸。

实施例4核酸芯片和靶单链核酸的反应

如图2所示，将实施例3中制备的靶单链核酸与位于所述核酸芯片上的捕获单链核酸在60℃中孵育4-12小时以进行预杂交，在42℃中用0.1×SSC的溶液清洗。此时杂化溶液含有1M氯化钠和0.3M柠檬酸钠、0.5％SDS或者100μg/ml鲑鱼精DNA、0.2％牛血清白蛋白或者单链核酸。

在预杂交结束后，将玻璃基片与实施例3中制备的溶液在42℃中处理12小时，以进行杂交，用清洗液清洗核酸芯片。此时，清洗液的组成是例如1×SSC+0.2％SDS、1×SSC+0.2％SDS、0.5×SSC+0.2％SDS、0.01×SSC+0.2％SDS顺序的步骤，各步骤在42℃中进行30分钟。

实施例5核酸芯片点样的检索及分析

当实施例4的清洗结束后，将玻璃基片离心干燥后，利用具有为了激发(excitation)所使用的荧光染料的适当波长激光(Cy5，635nm)的激光扫描仪(laser scanner，GenePix4000，Axon公司)进行检索。

荧光图像是用多图像标记的图像文件(multi-image-tagged image file，TIFF)格式储存后，用适当的图像分析(image analysis)软件(GenePix Pro3.0，Axon公司)分析。

每点(spot)的信号强度(signal intensity，单位：quanta)是使用除去周围背景的基本信号后的，在这里背景信号表示由在特定点周围的4个点的周边信号组成的局部背景(local background)。

通常情况下，当90％以上显示超过背景信号+2标准偏差(S.D.；standarddeviation)的信号强度时，点的像素(pixel)强度被认为是有效的数据，反之，点的像素(pixel)强度不用做数据分析。

根据标记效率(Labeling efficient)的偏差(variation)是利用内部标准(internal standard，IS)的信号进行平均化(例如，标准强度＝探针强度/内部标准强度)，在进行单标记(mono-labeling)的情况下用Cy5频道的信号强度(signal intensity)记录其结果，在点样(spotting)为两倍以上的情况下使用平均值。靶单链核酸的信号强度(signal intensity，S)是对于点具有的像素(pixel)求出各自的信号强度后，使用它们的中间值。信号强度(S)是利用内部标准(IS)将根据标记效率的偏差平均化。

S′(标准值)＝S(Cy5-参照)×(Cy5-IS)。

通过上述方法弄清像素密度的分析结果和实际样本量之间的关系，以确定其相互关系。可以将核酸芯片的荧光资料图像化，由全部点的模式在生物样本中确认生物分子谱，并且可以将点的模式用分级聚类(HierarchicalClustering)和人工神经网(Artificial Neural Network)等方法等分析而使用。

点的荧光度可以根据捕获单链核酸和靶单链核酸形成的双链的性质而改变。人血清蛋白-(靶)单链核酸复合物的结合程度和量是根据它们之间的特异性和结合能力来确定的。

源于人血清蛋白-靶单链核酸复合物的靶单链核酸和附着于核酸芯片上的捕获单链核酸的碱基序列会影响靶单链核酸和捕获单链核酸的双链稳定性，并且所述核酸芯片上的靶单链核酸的量会影响荧光强度。

即，荧光度表示靶单链核酸的量，靶单链核酸的量表示人血清蛋白-靶单链核酸复合物的量，并且该复合物的量表示生物样本中存在的生物分子的量。从而可以由点的荧光度在含有与点相应的未知的生物分子的生物样本中，来确认特定生物分子的量。结果，分析形成的点的荧光强度，以确认全部点的模式，从而确定人血清蛋白的谱。

形成的点显示绿-黄-红色的色谱，是由标记Cy-3的靶单链核酸和标记Cy-5的靶单链核酸(均与所述芯片上的捕获单链核酸杂交)的比例产生的。由于特定点的色谱的强度表示组成人血清的特定血清样本中存在的特定生物分子(蛋白质)的量，显示核酸芯片上的全部点的色谱的图像在特定生物样本中相当于生物分子的谱。

更详细地，在特定点上与所述捕获单链核酸杂交以形成双链核酸的靶单链核酸是由标记Cy-3的靶单链核酸和标记Cy-5的靶单链核酸组成的。前者以恒定的量存在，后者与人血清中的相应的生物分子成比例存在。据此，特定的点是在后者相对地少量存在时为绿色，存在的量差不多时为黄色，过量存在时为红色。

所述核酸芯片的点的荧光强度根据双链核酸内靶单链核酸的个数而改变，这与存在的生物分子的个数有关。因此，表示本发明的核酸芯片的全部点的色谱图像的影像数据，提供了含有未知的生物分子的生物样本的所有生物分子的谱。

以上的测试结果如图3所示。如图3所示，在基于能够与血清蛋白结合的靶单链核酸的捕获单链核酸附着的部位点，所述玻璃基片显示出多种荧光强度的绿-黄-红的色谱。

根据图3的结果，基于能够与人血清蛋白结合的本发明的靶单链核酸的核酸芯片，能够提供人血清蛋白质的谱，该人血清蛋白质的谱在(A)健康人和(B)稳定性心绞痛患者之间是不相同的。

图4说明了通过利用根据本发明的核酸芯片并使用患有不同类型疾病的患者的血液样本来构建谱数据库的流程。图5说明了通过利用根据疾病类型构建的谱数据库和人工神经网络算法的程序来诊断患者疾病的流程。

如图4所示，由多种生物样本中获得的谱构建的数据库，能够进行分析并有效地用于采集生物信息学数据。

利用健康人以及患有包括稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛和心肌梗塞在内的心血管疾病的患者的血清谱数据库，检查一位叫Lee 2-1(99)的人的血清样本，结果如图6所示。根据72.5％的10倍交叉确认证实(cross validation)，可以预测为健康人。

用于构建诊断心血管疾病的数据库的血清样本的临床资料如下表1所示，健康人37名、稳定性心绞痛患者36名、不稳定性心绞痛患者27名和心肌梗塞患者27名，共127名。

表1心血管疾病患者的临床信息

利用健康人和肝癌患者的血清谱数据库，检查一位叫KIM的人的血清样本，结果如图7所示，根据93.0％的10倍交叉证实(cross validation)可以预测为肝癌患者。

另外为了检查有无转移，利用健康人、非转移肝癌患者和转移肝癌患者的血清蛋白谱数据库，检查一位姓KIM的人的血清样本，结果如图8所示，根据76.0％的10倍交叉证实(cross validation)可以预测为非转移-肝癌患者。

用于构建肝癌诊断用数据库的血清样本的临床资料如表2所示，健康人19名、非转移肝癌患者72名和转移性肝癌患者11名，肝癌患者共83名，样本总数为102例。

表2肝癌患者的临床信息

图9说明了用于鉴定患有心血管疾病的患者的生物分子特征的流程。如图所示，通过比较健康人和患者的血清谱，来确定对心血管疾病患者具有特异性的点，相对应的单链核酸附着有生物素并与抗生蛋白链菌素(streptavidin)反应，然后与血清样本反应，以通过电泳分离法分离得到的复合物。分离出得到的条带，以识别生物分子。图10是结合在筛选的单链核酸上的蛋白质的MALDI-TOF-TOF谱，显示了所述蛋白质的氨基酸序列。

如上所述，固定有源自能够与生物分子结合的单链核酸的单链核酸的本发明核酸芯片，能够应用于对特定的生物样本的标记生物分子的探索和分析。

并且，在通过医学上有用的生物标记构建数据库后，获得感兴趣人体的血清谱，通过利用人工神经网络算法与数据库进行比对，以检查心血管疾病的有无及其种类、肝癌发病的有无和转移程度。

使用按照疾病类型构建的数据库的比对，能够确定对特定的疾病具有特异性的点，对于所述点相对应的单链核酸的检测，可以用于识别作为疾病标记的蛋白质。

实施例6细胞表面生物分子的谱的生成及应用

6-1.核酸芯片的制备

按照上述实施例1和2的方法制备本发明的核酸芯片，所核酸芯片用于获得人肺癌细胞株NCI-H1299的表面生物分子的谱。将准备的任选的单链核酸与肺癌细胞反应后，使用清洗缓冲液清洗细胞，以除去未结合的或弱结合的单链核酸，以5,000×g的转速离心，从而分离出细胞(生物分子)-单链核酸的复合物。重复这些过程，以分离出能够与肺癌细胞的表面生物分子结合的单链核酸。

从分离的单链核酸中制备克隆，并分析碱基序列。从中选定了1,000多个能够与表面生物分子结合的单链核酸。按照实施例2的方法合成与选定的1,000多个结合生物分子的单链核酸互补的寡核苷酸(捕获单链核酸)，并将其固定在固体基底上，以制备根据本发明的核酸芯片。

6-2.细胞表面生物分子的谱的生成

利用按照上述实施例6-1的方法制备的核酸芯片，生产肺癌细胞株NCI-H1299的表面分子的谱。将肺癌细胞株和单链核酸池反应后，对得到的生物分子-单链核酸的复合物进行清洗和分离。将所述复合物的单链核酸通过实施例3的方法扩增和标记。将捕获单链核酸和标记的单链核酸用实施例4的方法进行反应。标记在所述靶单链核酸上的物质的测定，是通过实施例5的方法进行的，获得肺癌细胞表面生物分子的谱。

使用得到的谱，筛选推测能够强力地结合在肺癌细胞上的单链核酸。在荧光扫描之前，它们附着FITC并与肺癌细胞株进行孵育。荧光图像如图11所示。

如图所示，通过对利用本发明的核酸芯片获得的谱进行分析筛选的阳性单链核酸，能够与肺癌细胞株结合。

实施例7大肠杆菌的表面生物分子的谱的生成及应用

7-1.核酸芯片的制备

使用如实施例1和2所述的方法制备用于获得大肠杆菌KCTC12006的表面生物分子的谱的本发明的核酸芯片。

将准备的单链核酸与大肠杆菌细胞进行反应后，使用清洗缓冲液清洗细胞，以除去其中未结合的或结合程度弱的单链核酸，从而分离出细胞(生物分子)-单链核酸的复合物，以5,000×g的转速离心分离所述细胞-单链核酸的复合物。重复这些过程，以分离出能够结合大肠杆菌细胞表面生物分子的单链核酸。

从分离的单链核酸中制备克隆，并分析碱基序列。从中选定了1,000多个能够结合表面生物分子的单链核酸。按照实施例1的方法合成与选定的约1,000多个结合生物分子的单链核酸互补的寡核苷酸(捕获单链核酸)，并将其固定在固体基底上，以制备根据本发明的核酸芯片。

7-2.大肠杆菌的表面生物分子的谱的生成

利用按照上述实施例7-1的方法制备的核酸芯片，生产大肠杆菌KCTC12006的表面分子的谱。将大肠杆菌和单链核酸池反应后，清洗和分离得到的生物分子-单链核酸的复合物。将所述复合物的单链核酸根据实施例3的方法进行扩增和标记。将捕获单链核酸和标记的单链核酸根据实施例4的方法进行杂交。对标记在所述靶单链核酸上的物质的检测是通过实施例5的方法进行的，得到大肠杆菌细胞表面生物分子的谱。

按照与获得大肠杆菌KCTC12006的表面生物分子的谱相同的方法，获取沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)的表面生物分子的谱，构建数据库后，基于分级聚类方法筛选特异性地结合在大肠杆菌上的单链核酸。用SPR装置(BIAcore公司)测定单链核酸的特异性，结果如图12所示。相对于沙门氏菌，筛选的单链核酸对大肠杆菌上具有更强的特异性。

通过使用单链核酸适配体和纳米金颗粒的生物分子的分析方法(例如，参照韩国专利申请号10-2006-0072480，专利号10-828936)，所述筛选的单链核酸可以用于测定食物中大肠杆菌的有无和食物中大肠杆菌的污染程度。结果如图13所示。将洗过的食物与单链核酸在SELEX缓冲液中反应，并在添加NaCl溶液后与金纳米颗粒反应。没有大肠杆菌的则显示为透明的几乎无色的绿色，污染大肠杆菌的变成红色。颜色的强度与大肠杆菌的量成比例。

工业适用性

如上所述，本发明提供了用于获得未知生物分子和单链核酸之间的结合谱的核酸芯片、该核酸芯片的制备方法、以及利用该核酸芯片的未知生物分子的分析方法。基于高通量筛选(High Throughput Screening)，所述方法能够以较低的成本简单且高效地分析疾病。

近年来，已经开发了用于高通量筛选蛋白质物质的蛋白质芯片和适配体。由于具有识别微生物、病毒、细胞和组织的未知生物分子的能力，所述方法能够用于包括医学、兽医学、环境工程、食品工程、农业在内的广泛的领域中。

虽然以示例性的目的公开了本发明的优选实施方式，但本领域的技术人员应该理解的是，在不背离本所附权利要求公开的范围和精神的情况下，可以对本发明进行多种修改、补充和替换。

Claims (8)

1、一种制备核酸芯片的方法，其特征在于，该方法包括：

使含有未知生物分子的生物样本和具有任选碱基序列的任选单链核酸进行反应，以确定能够与未知生物分子结合的结合生物分子的单链核酸；以及

合成捕获单链核酸并将该捕获单链核酸固定在基底上，所述捕获单链核酸包括确定的结合生物分子的单链核酸和/或具有与所述确定的结合生物分子的单链核酸的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸，

所述核酸芯片能够用于获取所述单链核酸与所述未知生物分子之间的结合谱，从而能够用于对所述生物样本中的未知生物分子的生物学意义进行分析。

2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述结合生物分子的单链核酸由以下过程确定：

使所述任选的单链核酸与所述生物样本的未知生物分子进行反应，以形成生物分子-单链核酸的复合物；

对所述生物分子-单链核酸的复合物进行清洗，基于所述单链核酸对所述生物分子的亲合力，筛选其中的单链核酸与所述生物分子以预期的程度或更好的程度进行结合的复合物；

从筛选到的所述复合物中分离出单链核酸，并对该单链核酸进行扩增；以及

将扩增的单链核酸克隆至载体中，并确定所述单链核酸的碱基序列。

3、根据权利要求2所述的方法，其中，所述筛选和扩增重复进行多次。

4、根据权利要求1-3中的任意一项所述的方法，其中，该方法还包括：基于所述捕获单链核酸对生物学意义分析的贡献度，来限定所述捕获单链核酸对所述未知生物分子的生物学意义分析的范围，以减少所述捕获单链核酸的数量。

5、根据权利要求1-3中的任意一项所述的方法，其中，所述生物样本是选自由细菌、真菌、病毒、细胞和组织所组成的组中的至少一种，

所述生物分子是选自由蛋白质、碳水化合物、脂质、碳酸氢盐、多糖、糖蛋白、激素、受体，抗原、抗体和酶所组成的组中的至少一种。

6、一种核酸芯片，该核酸芯片用于获取生物分子与单链核酸之间的结合谱以分析生物样本中含有的未知生物分子的生物学意义，其中，所述核酸芯片包括固体基底，该固体基底固定有捕获单链核酸；该捕获单链核酸包括能够与所述未知生物分子相结合的结合生物分子的单链核酸，和/或与所述结合生物分子的单链核酸互补的单链核酸。

7、一种分析未知生物分子的方法，其中，该方法包括：

制备包括固体基底的核酸芯片，所述固体基底固定有捕获单链核酸；该捕获单链核酸包括能够与所述未知生物分子相结合的结合生物分子的单链核酸，和/或与所述结合生物分子的单链核酸互补的单链核酸；

使与所述核酸芯片的所述捕获单链核酸具有相同碱基序列的单链核酸与所述未知生物分子进行反应，以形成生物分子-靶单链核酸的复合物，对所述生物分子-靶单链核酸的复合物进行分离；

对所述生物分子-靶单链核酸的复合物中的靶单链核酸进行分离、扩增和标记；

使标记的所述靶单链核酸与所述核酸芯片的捕获单链核酸进行反应，从所述标记的靶单链核酸在所述芯片上的分布中得到结合谱；以及

将得到的结合谱与先前存在的结合谱数据进行比较，以分析所述未知生物分子的生物学意义。

8、一种用于确定在未知生物分子的生物学意义分析中起作用的特异性单链核酸的方法，其中，该方法包括使用由权利要求7所述的方法构建的数据库。

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