CN108641993A - 一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株 - Google Patents

一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。本发明提供了一种重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。本发明针对BVDV黏膜免疫的重要性，构建了细胞表面表达BVDV主要保护性抗原E2蛋白的重组乳酸乳球菌表达***，为BVDV口服活载体疫苗的研制提供基础。

Description

一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服 疫苗株
技术领域
本发明涉及一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)属于黄病毒科(Flavividae)的瘟病毒属(Pestivirus),可引起反刍动物病毒性腹泻/粘膜病(Bovinevirus diarrhea-mucosal disease,BVD-MD),临床上以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、妊娠母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。自1946年首次报道该病后，由于缺乏有效的防控技术，在全球普遍流行，给养牛业造成重大的经济损失。
疫苗免疫接种是预防该病的主要措施，但灭活疫苗效果不稳定，难以达到预防的目的，弱毒活疫苗存在排散病毒、病毒毒力返强等诸多不安全因素。因此，从BVDV经黏膜感染致病的角度出发，研制能有效的刺激黏膜免疫***产生免疫应答的口服疫苗对该病的防治具有重要意义。
近年来，黏膜疫苗抗原传递***成为传染病防御领域的新技术热点，目前研究的载体有微粒载体、细菌载体、病毒载体和植物载体，但主要集中在减毒的细菌菌株上，即活菌载体。活菌载体疫苗是黏膜免疫疫苗的重要组成部分，也是当今研究的热点。乳酸杆菌作为食品安全级的微生物，是动物和人体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维持肠道内菌落平衡、调节免疫***作用等益生作用。因此，以乳酸菌为载体作为外源基因的传递和表达***研制口服疫苗，具有重要开发前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。
本发明提供了一种重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。
所述特异DNA包括Usp45信号肽的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。
所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’端第106-1140位所示。
所述特异DNA由Usp45信号肽的编码序列、6×His标签的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因组成。
所述Usp45信号肽的编码序列如序列表的序列1自5’端第7-87位所示。
所述特异DNA如序列表的序列1所示。
所述特异DNA编码序列表的序列2所示的蛋白质。
所述特异DNA通过含有特异DNA的表达载体导入乳酸乳球菌。
所述表达载体为将含有特异DNA的片段***pNZ8148表达载体的多克隆位点中得到的。
所述表达载体为采用序列表的序列1自5’端第5-1140位所示的双链DNA分子替代pNZ8148表达载体的Xba I和NcoⅠ酶切位点间的片段得到重组表达载体。
以上任一所述乳酸乳球菌具体可为乳酸乳球菌NZ9000。
本发明还保护以上任一所述的重组菌在作为牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
所述牛病毒性腹泻病毒疫苗的免疫方式为口腔灌服。
本发明还保护以上任一所述的重组菌在制备牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
本发明还保护以上任一所述的重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。
本发明还保护一种牛病毒性腹泻病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述的重组菌。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的重组菌；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。
本发明针对BVDV黏膜免疫的重要性，构建了细胞表面表达BVDV主要保护性抗原E2蛋白的重组乳酸乳球菌表达***，为BVDV口服活载体疫苗的研制提供基础。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳检测E2基因在乳酸菌中的表达情况。
图2为重组菌pNZ8148-E2/NZ9000表达产物Western-blot分析。
图3为血清中BVDV E2特异性抗体效价的动态变化规律。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pNZ8148表达载体：上海北诺生物科技有限公司。
乳酸乳球菌NZ9000：上海北诺生物科技有限公司。
实施例1、表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建
一、重组表达载体的构建
采用序列表的序列1自5’端第5-1140位所示的双链DNA分子替代pNZ8148表达载体的Xba I和NcoⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体(已经测序验证)。
***序列与载体序列融合形成序列1。序列表的序列1中，自5’端第7至87位为Usp45信号肽的编码序列，第88至105位为6×His标签的编码序列，第106至1140位为优化后的E2基因序列。优化后的E2基因更适于在乳酸菌中表达。
序列表的序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。序列表的序列2中，第3至29位为Usp45信号肽，第30至35位为6×His，第36至379位为E2蛋白。
二、重组乳酸菌的构建及蛋白表达鉴定
1、将步骤一得到的重组表达载体导入乳酸乳球菌NZ9000，得到重组菌pNZ8148-E2/NZ9000。
2、将步骤1得到的重组菌接种于5ml含有0.5％(质量百分含量)葡萄糖和10g/ml氯霉素的M17液体培养基中，30℃、150rpm过夜培养。
3、完成步骤2后，将重组菌菌液按1:25接种于含有0.5％(质量百分含量)葡萄糖和10g/ml氯霉素的M17液体培养基中，30℃、150rpm培养至菌液OD600nm约为0.4。
4、完成步骤3后，取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，取上清液(重组菌诱导0h上清)，沉淀用100μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液重悬(重组菌诱导0h全菌)。剩余的培养体系中加入乳链菌肽(Nisin)(在培养体系中的浓度为1ng/ml)，30℃培养不同时间(2h、4h或8h)，诱导融合蛋白表达，取出1ml培养物(重组菌诱导2、4和8h上清)，10000r/min室温离心2min，取上清液，沉淀用100μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液重悬(重组菌诱导2、4和8h全菌)。
5、采用乳酸乳球菌NZ9000替代重组菌，按照步骤2-4进行操作，得到NZ9000菌株未诱导上清、NZ9000菌株未诱导全菌和NZ9000菌株诱导全菌(诱导4h)。
6、采用pNZ8148表达载体替代重组表达载体，按照步骤1-5进行操作，得到重组菌pNZ8148/NZ9000。
将上述过程中的样品进行SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
结果如图1所示。图1中，M:蛋白质分子质量标准；泳道1：NZ9000菌株未诱导上清培养液；泳道2：NZ9000菌株未诱导全菌；泳道3：NZ9000菌株诱导全菌；4-7：pNZ8148-E2阳性菌株诱导后0、2、4和8h上清培养液；8-11:pNZ8148-E2阳性菌株诱导后0、2、4和8h全菌。
结果表明，重组蛋白在菌体裂解物中获得了表达，为非分泌性表达，蛋白大小约为41.69KD，所表达蛋白与预期大小相符。
7、将上述过程中的样品进行western检测分析。
一抗为BVDV E2兔多克隆抗体(Biorbyt公司，货号；orb312169)，稀释比例为1；2000。
二抗为山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam公司，货号：ab6721)，稀释比例为1:5000。
结果见图2。图2中，泳道1为经Nisin诱导4h的pNZ8148/NZ9000全菌；泳道2为经Nisin诱导4h的重组菌pNZ8148-E2/NZ9000全菌；M为蛋白质分子质量标准；结果表明，诱导后重组pNZ8148-E2/NZ9000菌株于41.69KD处有明显条带，与预期的重组E2蛋白的大小相符，说明表达的蛋白和天然蛋白一样具有良好的反应原性。
实施例2、动物免疫实验
实验动物：新疆石河子某牛场筛选6-12月龄BVDV抗体检测为阴性的健康犊牛。BVDV抗体采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测试剂盒(IDEXX，产品编号:99-44000)。
1、将实验动物随机分为两组(每组6头)，分圈隔离饲养。
组Ⅰ(免疫组)：口腔灌服实施例1制备的重组菌pNZ8148-E2/NZ9000，剂量为每次20ml/头，重组菌pNZ8148-E2/NZ9000的浓度为1×1010CFU/mL。共免疫2次，每次连续免疫2天，间隔15天。
组Ⅱ(对照组)：口腔灌服实施例1制备的重组菌pNZ8148/NZ9000，剂量为每次20ml/头，重组菌pNZ8148/NZ9000的浓度为1×1010CFU/mL。共免疫2次，每次连续免疫2天，间隔15天。
2、分别于免疫后第0、7、21、36、60、90进行静脉采血，分离血清，采用采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测试剂盒(IDEXX)检测血清中的抗体(检测方法参照试剂盒说明书)。
结果如图3所示。结果表明，首免后第7天，重组菌pNZ8148-E2/NZ9000免疫组有抗BVDV的血清抗体的血清抗体,而后抗体效价逐渐升高,第21天与未免疫对照组差异显著(P<0.05)，第36天血清抗BVDV E2蛋白抗体效价达到最高，差异极显著(P<0.01)。在第36天后开始下降。
序列表
<110> 新疆农垦科学院
<120> 一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggcaaaa aaaagattat ctcagctatt ttaatgtcta cagtgatact ttctgctgca 60
gccccgttgt caggtgttta cgctatgcat caccatcatc atcatcattt ggattgtaag 120
ccagaatttt catatgctat tgctaaagat gaacgtattg gtcaattagg tgctgaaggt 180
ttaactacta cttggaagga atattcacca ggtatgaaat tagaagatac tatggttatt 240
gcttggtgtg aagatggtaa attaatgtat ttgcaacgtt gtactcgtga aactcgttat 300
ttggctattt tacatactcg tgctttacca acttcagttg tttttaaaaa gttgttcgac 360
ggtcgtaaac aagaagatgt tgttgaaatg aatgacaatt tcgaattcgg tttatgtcca 420
tgtgatgcta agccaattgt tcgtggtaaa ttcaatacta ctttgttaaa cggtccagct 480
tttcaaatgg tttgtccaat tggttggact ggtactgttt catgtacttc attcaatatg 540
gatactttgg ctactactgt tgttcgtact tatcgtcgtt caaagccatt tccacatcgt 600
caaggttgta ttactcaaaa gaatttgggt gaagatttgc ataattgtat tttgggtggt 660
aattggactt gtgttccagg tgaccaatta ttatataaag gtggttcaat tgaaagctgt 720
aaatggtgtg gttatcaatt caaagaatca gaaggtttac cacattatcc aattggtaaa 780
tgtaagttag aaaacgaaac tggttaccgt ttagttgatt caacttcatg taatcgtgaa 840
ggtgttgcta ttgttccaca aggtacttta aaatgtaaga ttggtaaaac tactgttcaa 900
gttattgcta tggatactaa gttaggtcca atgccatgtc gtccatatga aattatttca 960
tcagaaggtc cagttgaaaa aactgcttgt acttttaatt acactaagac tttgaagaac 1020
aagtactttg aaccacgtga ttcatatttt caacaatata tgttgaaggg tgaataccaa 1080
tattggtttg atttggaagt tactgatcat catcgtgatt attttgctga atcaatttaa 1140
<210> 2
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile
1 5 10 15
Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Met His His His
20 25 30
His His His His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Phe Ser Tyr Ala Ile Ala
35 40 45
Lys Asp Glu Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr
50 55 60
Trp Lys Glu Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu Glu Asp Thr Met Val Ile
65 70 75 80
Ala Trp Cys Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr Leu Gln Arg Cys Thr Arg
85 90 95
Glu Thr Arg Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser
100 105 110
Val Val Phe Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg Lys Gln Glu Asp Val Val
115 120 125
Glu Met Asn Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys
130 135 140
Pro Ile Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala
145 150 155 160
Phe Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr
165 170 175
Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Arg Thr Tyr Arg
180 185 190
Arg Ser Lys Pro Phe Pro His Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Asn
195 200 205
Leu Gly Glu Asp Leu His Asn Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys
210 215 220
Val Pro Gly Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys
225 230 235 240
Lys Trp Cys Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr
245 250 255
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val
260 265 270
Asp Ser Thr Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly
275 280 285
Thr Leu Lys Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr Val Gln Val Ile Ala Met
290 295 300
Asp Thr Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Glu Ile Ile Ser
305 310 315 320
Ser Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys
325 330 335
Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln
340 345 350
Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr
355 360 365
Asp His His Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Ile
370 375

Claims (10)

1.重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA包括Usp45信号肽的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。
3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’端第106-1140所示。
4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA如序列表的序列1所示。
5.如权利要求1至3任一所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA通过含有特异DNA的表达载体导入乳酸乳球菌，所述表达载体为将含有特异DNA的片段***pNZ8148表达载体的多克隆位点中得到的。
6.权利要求1至5任一所述的重组菌在作为牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
7.权利要求1至5任一所述的重组菌在制备牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
8.权利要求1至5任一所述的重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。
9.一种牛病毒性腹泻病毒疫苗，其活性成分为权利要求1至5任一所述的重组菌。
10.一种产品，其活性成分为权利要求1至5任一所述的重组菌；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。
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