CN108641001A

CN108641001A - 结肠癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN108641001A
Application number: CN201810384084.1A
Authority: CN
Inventors: 田晓丽
Original assignee: Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2018-10-12

Abstract

本发明涉及提供了结肠癌的双靶点CAR‐T治疗载体及其构建方法和应用。双靶点CAR‑T治疗载体由慢病毒表达载体pCDH‑EF1α‑MCS‑(PGK‑Puro)和CAR结构两部分构成。所述的CAR结构具体为Igkappa‑iRGD‑CEA scFv‑(G₄S)₅‑Her‑2scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑T2A‑CCL19。以病毒感染方式获得含有该治疗载体的T细胞，即CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤结肠癌细胞。

Description

结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种CAR-T治疗载体，尤其是涉及结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用。

背景技术

结肠癌是结肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一。近年来，在我国的发病率和致死率呈不断上升趋势。目前，主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、中药治疗。但以上方式治疗效果有限，且毒副作用较大。虽然以外科手术为基础的结肠癌多学科综合治疗协作组(multidisciplinary team，MDT)诊治模式以及免疫治疗逐渐发挥越来越重要的作用，但是不能达到令人满意的效果，如免疫治疗存在着缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力以及肿瘤细胞表面主要组织相容性复合物(main histocompatibilitycomplex，MHC)表达下降产生免疫逃逸的问题。

CAR-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)的限制。近年来，CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。在治疗实体瘤方面，其安全性和有效性已得到证实。

中国专利CN107557388A公布了用于CAR-T细胞制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤细胞制品中的应用，同时还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。

中国专利CN107446938A公布了一种特异性靶向受体蛋白MAGEA及其CAR-T载体的构建方法，所述构建方法包括，先提取抗骨肉瘤的单克隆杂交瘤细胞的RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR，将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上，测序，获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白MAGEA，并将其表达序列克隆到CAR-T载体上，获得特异性靶向MAGEA的新型CAR-T载体。该发明能够为CAR-T细胞治疗的实体肿瘤，尤其是在骨肉瘤的免疫治疗上提供了有效的靶标。

中国专利CN107325185A公布了一种基于OCTS-CAR的PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体、编码基因、OCTS-CAR-T重组表达载体及其构建方法和应用。该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体包括依次串联连接的CD8 leader膜受体信号肽、双抗原结合区、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、OX40嵌合受体共刺激因子以及TCR嵌合受体T细胞激活域，其中，双抗原结合区包括以串联或转角连接方式连接的PSCA以及PDL1单链抗体的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner-Linker以及单链抗体间铰链Inter-Linker。此外，还提供了编码该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体的基因，重组表达载体及其构建方法和应用。

上述专利均是关于CAR-T细胞疗法的相关研究，但是目前缺少对于结肠癌进行双靶点CAR-T治疗的载体或相关研究。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一个目的：

提供一种嵌合抗原受体，即CAR，CAR结构包括CEA单链抗体、Her-2单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构。

其中，CEA单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原CEA设计的特异性抗原结合域，CEA单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，Her-2单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原Her-2设计的特异性抗原结合域，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，介导肿瘤免疫，同时抑制肿瘤内免疫抑制因子的释放，间接促进免疫细胞抗原提呈作用，并抑制血管形成，最终抑制肿瘤的生长；趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

此外，近年来研究发现，CCR7受体在结肠癌组织中表达，CCL19可直接与CCR7受体结合，激活受体后通路抑制肿瘤增殖、迁移及侵袭。

进一步地，CAR结构组成为Igkappa-iRGD-CEA scFv-(G₄S)₅-Her-2scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。

其中iRGD结构可表达iRGD肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，KazukiSugahara及其同僚曾经报告过iRGD的肽是一种可穿透肿瘤的肽，当iRGD作为一种单独的物质与抗肿瘤药物一同注射时，可大大增强药物传递及抗肿瘤活性。

CEA单链抗体，结构中表示为CEAscFv。

(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

Her-2单链抗体在结构中表示为Her-2scFv。

CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，能将CAR结构锚定于T细胞膜上，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

CD28-CD137为共刺激结构域，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

CD3ζ为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

T2A为linker-发现于明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna)，其作用是使一个单一片段编码蛋白质，其优点是两个基因(ORF)可通过T2A多肽连接成为一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，该融合蛋白可被识别T2A的蛋白酶切成两个蛋白，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

本发明第二个目的：

提供一种结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，包括第一个发明目的的嵌合抗原受体，以及PUC19质粒。即将第一个发明目的的嵌合抗原受体存在于PUC19质粒载体上。

本发明第三个目的：

提供一种结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，包括慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)和CAR。

其中，慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)，结构如图1所示。通过SnapGene软件分析该载体并查找相关文献可知，pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)用EcoRI与NotI双酶切***片段。该表达载体包括：EF1α启动子-是哺乳动物细胞特异性启动子，驱动能力较强；多克隆位点(MCS)-包含多个限制性酶切位点(restriction site)，是外源基因***的位置；WPRE元件-可提高mRNA的polyA加尾效率，改进转移基因的表达效率；SV40 polyA序列-能有效终止转录以及为转录的mRNA添加PolyA尾；杂交型RSV/5’LTR-含有启动子和增强子等调控元件，使其在293T细胞中高水平的表达全长病毒转录物；遗传要素(cPPT,gag,env,LTRs)-用于包装、转导和稳定地将病毒表达结构整合到宿主的基因组DNA中；SV40origin-使质粒在包装细胞中稳定增殖。

该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非***细胞和***细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。

本发明第四个目的：提供一种结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的构建方法。

将上述CAR结构按照基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后的CAR存在于PUC19质粒载体上；慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)购自SBI。将PUC19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ECoR、ⅠNot双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，得出载体和目的片段的浓度，将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化，质粒提取，最终获得含有特定CAR结构的重组质粒。

本发明第五个目的：提供结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，即提供一种CAR-T细胞。

将该治疗载体采用三质粒包装***进行慢病毒包装，组成为PSPAX2，pMD2G，结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，使用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，分别收集培养48h、72h后的病毒液，将此病毒液浓缩，并测病毒滴度，最终以MOI＝20感染T细胞，即可获得CAR-T细胞。

此三种质粒在体系(6cm皿体系)中的含量分别为4μg、0.5μg、3μg。

本发明中，CAR结构包括CEA单链抗体、Her-2单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构；CEA单链抗体、Her-2单链抗体是根据结肠癌细胞表面会表达肿瘤相关抗原CEA、Her-2确定的特异性结构，该结构表达的Anti-CEA、Anti-Her-2两种特异性抗体负责识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)，一方面可靶向性杀伤结肠癌细胞；另一方面，赋予T细胞新的抗原特异性，可有效避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。趋化因子CCL19可诱导免疫细胞浸润到肿瘤组织中发挥免疫功能。当T细胞通过病毒感染方式获得该载体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤结肠癌细胞。通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤结肠癌细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

由于该T细胞可同时表达针对结肠癌细胞表面的肿瘤相关抗原Her-2、CEA的抗体Anti-Her-2、Anti-CEA，使得其识别范围大大增加，对于结肠癌细胞的杀伤范围更广，会获得更好的治疗效果；同时，可以避免多次输注嵌合单个抗原受体的CAR-T细胞，不但减轻了对患者的伤害，也可以减轻其经济压力；另外，本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，并通过趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，抑制瘤内免疫因子的释放，使T细胞能克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，快速建立肿瘤免疫并消除小型或大型肿瘤负担。

附图说明

图1为慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)结构示意图；

图2为细胞毒性分析检测技术流程图；

图3为T84细胞系中靶向抗原CEA表达情况的Western blot检测结果图；

图4为T84细胞系中靶向抗原Her-2表达情况的Western blot检测结果图；

图5为pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)质粒经EcoR、ⅠNot酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

以下实施例中的材料来源说明如下：

1.慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自SBI；慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)结构如图1所示。

2.CAR结构序列由上海怡豪生物科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存；

3.限制性核酸内切酶EcoRⅠ、NotⅠ购自NEB；

4.T4 DNA ligase、Free H₂O购自宝生物；

5.感受态细胞购自Trans；

6.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；

7. 293T细胞、T84细胞购自中科院细胞库；

8.FBS，DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；

9.细胞裂解液RIPA，蛋白酶抑制剂购自碧云天；

10.BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光超敏显色试剂盒、Tween-20、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgGHRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG购自翊圣；

11.电泳液，快转液，胶购自Tanon；

12.脱脂奶粉购自BD；

13.PVDF膜购自Millipore；

14.膜再生液购自索莱宝生物科技有限公司；

15.Anti-CD3zeta antiboby购自abcam；

16.Beta Actin Antibody购自武汉三鹰生物技术有限公司；

17.蛋白Marker购自Thermo；

18.高压蒸汽灭菌锅购自上海申安；

19.鼓风干燥箱购自上海巴玖实业有限公司；

20.ProFlex PCR仪购自ABI；

21.Multiskan GO酶标仪+uDrop超微量板、流式细胞仪购自ThermoFisher；

22.ST16R台式冷冻离心机、Fresco微量离心机购自ThermoFisher；

23.HE120水平电泳槽、Tanon凝胶成像仪购自Tanon；

24.生物安全柜、CO₂直热式细胞培养箱、双开门4℃冰箱购自ThermoFisher；

25.移液器、电动助吸器购自Eppendorf；

26.隔水式恒温培养箱、恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；

27.Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳***购自Bio-Rad；

28.奥林巴斯显微镜购自奥林巴斯；

29.接种环、涂布棒洁特生物过滤股份有限公司；

30.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning；

一种嵌合抗原受体，即CAR，CAR结构包括CEA单链抗体、Her-2单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构。

CAR结构组成为Igkappa-iRGD-CEA scFv-(G₄S)₅-Her-2scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。

其中iRGD结构可表达iRGD肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，KazukiSugahara及其同僚曾经报告过iRGD的肽是一种可穿透肿瘤的肽，当iRGD作为一种单独的物质与抗肿瘤药物一同注射时，可大大增强药物传递及抗肿瘤活性。CEA单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原CEA设计的特异性抗原结合域，CEA单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。CEA单链抗体，结构中表示为CEAscFv。(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。Her-2单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原Her-2设计的特异性抗原结合域，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。Her-2单链抗体在结构中表示为Her-2scFv。CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，能将CAR结构锚定于T细胞膜上，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。CD28-CD137为共刺激结构域，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。CD3ζ为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用，核苷酸序列如SEQID NO.8所示。T2A为linker-发现于明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna)，其作用是使一个单一片段编码蛋白质，其优点是两个基因(ORF)可通过T2A多肽连接成为一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，该融合蛋白可被识别T2A的蛋白酶切成两个蛋白，其核苷酸序列如SEQID NO.9所示。趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，介导肿瘤免疫，同时抑制肿瘤内免疫抑制因子的释放，间接促进免疫细胞抗原提呈作用，并抑制血管形成，最终抑制肿瘤的生长；趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。近年来研究发现，CCR7受体在结肠癌组织中表达，CCL19可直接与CCR7受体结合，激活受体后通路抑制肿瘤增殖、迁移及侵袭。

结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，包括慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)和CAR。

其中，慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)，结构如图1所示。通过SnapGene软件分析该载体并查找相关文献可知，pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)用EcoRI与NotI双酶切***片段。该表达载体包括：EF1α启动子-是哺乳动物细胞特异性启动子，驱动能力较强；多克隆位点(MCS)-包含多个限制性酶切位点(restriction site)，是外源基因***的位置；WPRE元件-可提高mRNA的polyA加尾效率，改进转移基因的表达效率；SV40 polyA序列-能有效终止转录以及为转录的mRNA添加PolyA尾；杂交型RSV/5’LTR-含有启动子和增强子等调控元件，使其在293T细胞中高水平的表达全长病毒转录物；遗传要素(cPPT,gag,env,LTRs)-用于包装、转导和稳定地将病毒表达结构整合到宿主的基因组DNA中；SV40origin-使质粒在包装细胞中稳定增殖。该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非***细胞和***细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。

结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的构建方法：将上述CAR结构按照基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后的CAR存在于PUC19质粒载体上；慢病毒表达载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)购自SBI。将PUC19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ECoRⅠ、NotⅠ双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，得出载体和目的片段的浓度，将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化，质粒提取，最终获得含有特定CAR结构的重组质粒。

将该治疗载体采用三质粒包装***进行慢病毒包装，组成为PSPAX2，pMD2G，结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，此三种质粒在体系(6cm皿)中的含量分别为4μg、0.5μg、3μg。使用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，分别收集培养48h、72h后的病毒液，将此病毒液浓缩，并测病毒滴度，最终以MOI＝20感染T细胞，即可获得CAR-T细胞。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

(一)质粒提取

LB液体培养基的配制方法：电子天平称取5g液体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃～50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，转入到干净的500mL试剂瓶中备用，储存条件为4℃。

LB固体培养基的配制方法：电子天平称取5g固体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃～50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，倒板，凝固后，贴封口膜储存于4℃。

从-80℃冰箱分别取出甘油菌，甘油菌含有慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)和PUC19质粒，分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，各取8管，分别做好标记，于恒温摇床振荡培养12～16h，条件为37℃，250rmp。

质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司，按其说明书进行质粒提取。具体操作如下：以下CP3、P1、P2、P3、PW均属于上述试剂盒里面的试剂，货号：DP103-03

1)柱平衡：吸附柱CP3，500μL平衡液BL，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)；

2)取1mL过夜培养的菌液，加入离心管，12,000rpm，离心1min，尽量吸除上清(多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；

3)向菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，悬浮混匀沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低；

4)加入250μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充***解。(温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量)；

5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。(P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)；

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm，离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复一次；

8)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm，离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，并置于室温放置2min，以彻底晾干残余；

9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间滴加60μL Free H₂O，室温放置2min，12000rpm，离心2min，将质粒收集到离心管中，分别得到慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)与PUC19质粒。酶标仪测产物浓度，慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)浓度为358ng/μL；PUC19质粒为149.2ng/μL，写好标签，保存于-20℃备用。

(二)酶切、连接、转化

1.酶切

将慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)、PUC19质粒同时用以下体系进行EcoRI、NotI双酶切，37℃水浴1-2h；

pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)/PUC19

按照质粒浓度确定加样量，体系内质粒为2μg

2.琼脂糖凝胶电泳

慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)酶切产物需要0.8％的琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.16g于100mL锥形瓶中，加入20mL 1×TAE中，微波炉加热溶解，待冷却至50℃～60℃时，加入2μL的核酸染料(glod view)，摇匀，倒入到已插好梳子凝胶板中，凝固备用。

PUC19质粒酶切产物需要1.0％的琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.2g于100mL锥形瓶中，加入20mL 1×TAE中，微波炉加热溶解，待冷却至50℃～60℃时，加入2μL的核酸染料，摇匀，倒入到已插好梳子凝胶板中，凝固备用。

待胶冷却凝固后，在质粒酶切产物中按照终体积加入6×Loading buffer，吹打混匀，依次加入上样孔中。放入电泳槽，90V，30min，用凝胶成像仪观察并记录结果。琼脂糖凝胶电泳结果pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)如图5所示。

3.胶回收

用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，具体操作步骤如下：以下吸附柱CA2、溶液PN、均为上述试剂盒中的试剂，货号：DP209-02

1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)；

2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；

3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PN溶液)，56℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强；

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入；

5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心；

6)重复操作步骤(5)；

7)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(～13,400g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；

8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL FreeH₂O，室温放置2min。12,000rpm(～13,400g)离心2min收集DNA溶液，酶标仪检测浓度：pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)酶切后回收浓度是15.9ng/μL，CAR结构浓度为4ng/μL。

4.连接、转化

1)将回收片段按CAR结构:pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)＝5:1的摩尔比进行连接，16℃，4h于ProFlex PCR仪中连接。

连接体系如下：

后续操作均在超净工作台中进行。

其中，CAR结构组成为Igkappa-iRGD-CEA scFv-(G₄S)₅-Her-2scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。其中iRGD结构可表达iRGD肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Kazuki Sugahara及其同僚曾经报告过iRGD的肽是一种可穿透肿瘤的肽，当iRGD作为一种单独的物质与抗肿瘤药物一同注射时，可大大增强药物传递及抗肿瘤活性。CEA单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原CEA设计的特异性抗原结合域，CEA单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。CEA单链抗体，结构中表示为CEAscFv。(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。Her-2单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原Her-2设计的特异性抗原结合域，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。Her-2单链抗体在结构中表示为Her-2scFv。CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，能将CAR结构锚定于T细胞膜上，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。CD28-CD137为共刺激结构域，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。CD3ζ为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。T2A为linker-发现于明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna)，其作用是使一个单一片段编码蛋白质，其优点是两个基因(ORF)可通过T2A多肽连接成为一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，该融合蛋白可被识别T2A的蛋白酶切成两个蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，介导肿瘤免疫，同时抑制肿瘤内免疫抑制因子的释放，间接促进免疫细胞抗原提呈作用，并抑制血管形成，最终抑制肿瘤的生长；趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。CAR结构序列由上海怡豪生物科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存。

2)从-80℃冰箱中取出感受态细胞于冰上化开，从4℃取出固体培养基于37℃孵箱预热；

3)将连接产物转入到1.5mL离心管中；

4)向其中缓慢加入50μL感受态细胞，边加边搅动，使两者混匀；

5)将3中的离心管放于冰上30min后，于37℃水浴锅中热激90s；

6)热激后，立即取出置于冰上2min；

7)向其中加入950μL液体培养基，于恒温摇床培养40～60min，条件为37℃，200rmp；

8)6000rpm，离心2min，弃去大部分上清液，留40～60μL即可；

9)用枪头吹打重悬菌液，将菌液滴于预热的固体培养基上，做好标记，37℃孵箱过夜；

(三)提质粒、酶切验证、测序

1)挑取部分菌落于5mL液体培养基中，恒温摇床进行增菌培养，条件为37℃，250rmp，培养12～16h；

2)用购自天根生物科技有限公司的质粒小提试剂盒进行质粒抽提，并测定浓度；质粒抽提之前各取出500μL于1.5mLEp管中，用作菌种保存，储存于-80℃；

3)将所得质粒进行EcoRI、NotI双酶切，37℃水浴1-2h。酶切体系如下：

含CAR结构pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)质粒

按照质粒浓度确定加样量，体系内质粒为1μg

4)琼脂糖凝胶电泳。如上方法配置0.8％的琼脂糖凝胶50ml，并进行电泳，90V，20min，用凝胶成像仪观察并记录结果；

5)将条带正确的质粒取1μg送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，条带异常的质粒以及留存的菌液均丢弃。将测序结果正确的质粒进行抽提，测序结果错误的质粒及其菌液均丢弃。

(四)浓缩病毒液的制备

1.病毒液收集

采用三质粒包装***进行慢病毒包装。三质粒分别为含有CAR结构的慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2。细胞为293T细胞。

具体实施步骤如下：

1)转染前24h内进行铺板：一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，10cm皿中生长状态良好，生长密度达到80％的293T细胞吸弃废液；

2)向其中缓慢贴壁加入3mLPBS以洗涤细胞；

3)吸弃废液后，缓慢贴壁加入1mL胰酶，于恒温培养箱中消化2min；

4)向消化好的细胞中加入3mL的DMEM完全培养基(10％FBS)以终止消化，并转入15mL离心管中800rpm离心3min；

5)弃去上清，向细胞沉淀中加5mL DMEM完全培养基(10％FBS)重悬细胞，缓慢吹打混匀；

6)取6个6cm皿，并加5mL DMEM完全培养基(10％FBS)；

7)向每个6cm皿中加入720μL细胞悬液，小心混匀，使细胞需完全贴壁且贴壁均匀；

8)待生长密度达60～90％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；

9)根据转染细胞数量，按如下比例配置每个6cm皿所需的三质粒混合液

重组质粒 3μg

pMD2G 0.5μg

PSPAX2 4μg

按照各质粒浓度确定需要加入的剂量。本次需加入的剂量如下：

重组质粒(124ng/μL) 24.2μL

pMD2G(436ng/μL) 1.15μL

PSPAX2(246ng/μL) 14.5μL

向质粒混合液中加入2mL Opti-MEM，室温静置5min；

10)另需配置lipofectamine 2000(4℃保存)混合液，每个6cm皿所需lipofectamine 2000为2μL/μg三质粒混合液，并向其中缓慢滴加2mLOpti-MEM，室温静置5min；

11)将以上(9)和(10)混于一管中，室温静止20min；

12)将已铺好的293T细胞取出，吸弃废液，并小心贴壁加入1mLDMEM培养基，防止细胞漂浮；

13)将(11)中的混合液小心贴壁加入(12)中的细胞中，防止细胞漂浮，混匀后，继续培养72h；

14)收集72h后培养上清，通过0.45μm滤膜过滤备用；

2.病毒液浓缩

1)5×PEG8000 NaCl配制：称取NaCl 8.766g；PEG8000 50g溶解在200mL Milli-Q纯水中；121℃，湿热灭菌30min；保存在4℃；

2)每30mL过滤后的病毒初始液，加入5×PEG-8000 NaCl母液7.5mL；

3)每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4)4℃放置过夜；

5)4℃，4000g，离心20min；

6)吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体；

7)每30mL过滤后的病毒初始液，加入500μLPBS溶解慢病毒沉淀；

8)收集后的病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃备用(避免浓缩病毒液反复冻融)。

3.病毒滴度测定

1)取生长状态良好的293T细胞，消化后计数，按2×10⁵细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，培养6～10h至细胞贴壁；

2)向24孔板中细胞培养上清中加入不同浓度的浓缩病毒液，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中感染48h；

3)感染48h后，消化并收集细胞，流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据以下公式计算病毒滴度，单位为TU/mL：

T＝(铺板时细胞数×阳性细胞百分比×1000)/加入的病毒液体积(μL)

(五)病毒液感染T细胞

1.PBMC分离

1)用含有肝素的真空采血管收集约6mL人外周新鲜血液；

2)稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀；

3)加样：取50mL离心管，吸取6mL Ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中，(Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1)，管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面；

4)离心：18-20℃，2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；

5)回收：将移液管直接***单个核细胞层(或者先吸去上层的血浆)，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中；

6)洗涤：加入至少于PBMC(外周血单个核细胞)体积3倍的PBS，18-20℃，2000rpm，10min，两次；

7)细胞计数：弃上清，加1mLRPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。采用血细胞计数板计数：取一滴PBMC悬液与一滴2％台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/mL＝4个大方格细胞总数/4×10⁴×2(稀释倍数)

2.T细胞的激活与慢病毒感染

1)调整细胞密度至1×10⁶细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度100U/mL的IL-2、100ng/m L Anti-CD3(OKT3)、250ng/mL Anti-CD28，连续培养48h；

2)按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：

所需病毒量(mL)＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度

3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为8μg/m L的polybrene，充分混匀后，使用封口膜封住孔板，将孔板置于离心机中，800g离心60min；

4)取出孔板，将孔板置于37℃、5％CO₂的培养箱中，继续培养24h；

5)250g离心10min，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用；

(六)Western blot验证CAR结构是否表达

通过检测CAR结构中的CD3ζ链，来检测细胞中CAR的表达情况。

1.细胞总蛋白样品的提取与制备

1)收集细胞，包括未经处理的T细胞及被感染的T细胞；

2)根据细胞量向细胞中加细胞裂解液RIPA，用枪头小心吹打混匀，冰上放置10min；

3)观察液体是否相对清亮，若颜色偏黄，可补适当RIPA，涡旋震荡混匀后，继续于冰上放置10min；

4)重复步骤(3)；

5)待细胞充***解后，12000rmp，4℃，离心10min；

6)收集上清，采用BCA法测蛋白浓度，BCA试剂盒购自翊圣；

7)以最终上样量为10μL确定蛋白样品加样量，同时加入2μL5×loading Buffer，用Free H₂O补齐10μL使最终总蛋白量为20ng贴封口膜后100℃煮5min；

8)剩余蛋白样品可加入5×loading Buffer后保存。-20℃可保存一周，-80℃可保存一个月；

2.Western blot检测

1)将胶用夹子固定，向其中加入电泳液，确保不漏液；

2)向电泳槽中加入电泳液；

3)蛋白样品上样之前用涡旋震荡器混匀并短暂离心；

4)上样：每孔10μL；

5)电泳：80V，30min；转120V，直至结束；

6)转膜：裁取适当大小的PVDF膜，事先在甲醇液体中浸泡几分钟激活。按照滤纸-膜-胶-滤纸的顺序放好，进行电转，条件为湿转，恒流400mA，1h；

7)封闭：5％脱脂牛奶，室温封闭1h(或4℃过夜)；

8)PBST洗膜：5min/3次；

9)Anti-CD3zeta antiboby(1:1000)孵育，4℃过夜；

10)PBST洗膜：5min/3次；

11)HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(1:2000)孵育，室温1h；

12)PBST洗膜：5min/3次；

13)显色与拍照；

14)PBST洗膜：5min/3次；加入适量膜再生液，洗膜1h；

15)重新进行封闭，并孵育Beta Actin Antibody(1:4000)、HRP-labeled GoatAnti-MouseIgG(1:2000)，显色，观察内参β-actin；

3.细胞毒性分析检测

技术流程图见图2，具体操作流程如下：

1)设置检测板，同时设4个对照：靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组，实验组按20∶1、10∶1、5∶1、1∶1(效应细胞∶靶细胞)设置。靶细胞选择T84细胞系(Western blot检测其Her-2、CEA表达情况，T84细胞系中靶向抗原CEA表达情况如图3所示，T84细胞系中靶向抗原Her-2表达情况如图4所示)；

A.设立效应细胞孔：50μL效应细胞+50μL培养基；

B.实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μL效应细胞+50μL靶细胞；

C.设立靶细胞自发释放组：50μL靶细胞+50μL培养基；

D.设立靶细胞最大释放组：50μL靶细胞+50μL培养基+10μL裂解液(10×)；

E.设立体积校正对照组：100μL培养基+10μL裂解液(10×)；

F.设立背景对照组：100μL培养基；靶细胞接种数目的优化

2)细胞裂解及收获上清：每100μL培养基加10μL裂解溶液(10×)37℃，5％CO₂孵育45min，250g离心4min；

3)转移50μL上清至另一孔板，避光取12mL已解冻的检测缓冲液，将剩余的迅速冻存(可以37℃水浴解冻，但不可放置过长时间)。将12mL检测缓冲液添加到一瓶底物混合液(可用于两个96孔板)中，倒置混匀；

4)50μL/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30min(未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃，可保存6-8周)，添加50μL终止溶液；

5)将孔中含有的气泡去除，1h内检测吸收值(490或492nm)，至少检测两次吸收值；

6)结果统计

所有的实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值应减去背景平均吸收值；靶细胞最大释放组的吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值。校正后的值用于杀伤率的统计：

细胞杀伤率(％)＝[(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100％。

结果有两种表现方式：肉眼的直观观察以及通过测定LDH来反映细胞杀伤率；

肉眼观察可见，实验组靶细胞数量较之靶细胞自发释放组减少(铺板时各组靶细胞数相同，均匀铺板)，且随着实验组效应细胞：靶细胞比值的增大，靶细胞数量减少更加明显，说明效应细胞对靶细胞具有杀伤性。

此外，通过LDH的测定，可反映出细胞杀伤率，通过绘制效应细胞：靶细胞-细胞杀伤率折线图，可看出，两者是正相关的关系。

以上结果表明，经慢病毒感染得到的CAR-T细胞，可通过表达并识别针对肿瘤细胞表面的特异性抗原的抗体，特异性杀伤该肿瘤细胞。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海怡豪生物科技有限公司

<120> 结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgccgcggcg acaagggccc cgactgc 27

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgaagc tgcagcagtc aggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggata taccttcaca gactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag tactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagaaaagac 300

ctactacgct actttgacta ctggggccaa ggcaccacgg tcaccgtctc ctcaggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg acatcgagct cactcagtct 420

ccatcctcac tgtctgcatc tctgggaggc aaagtcacca tcacttgcaa ggcaagccaa 480

gacattaaca agtatatagc ttggtaccaa cacaagcctg gaaaaggtcc tagatctgct 540

catacgttac acatctacat tcagccaggc atcccatcaa ggttcagcgg aagtgggtct 600

gggagagatt attccttcag catcagcaac ctggagcctg aggatattgc aacttattat 660

tgtctacact atgataatct tcacacgttc ggagggggga ccaagctgga gctgaaacgg 720

gcg 723

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgggtgg aggcggttca 60

ggcggaggtg gctct 75

<210> 4

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacctccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gagcattagc agctatgtcg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgtatagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtagatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag agttacagtc ccccattcac ttttggtcag 300

ggaaccaaag tcgagattaa gcgtggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 360

ggcggctccg gtggtggtgg atccgaagtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 420

cgacctggcg gttccctgag actctcctgt gcagcctctg gcttcacctt cactgactac 480

tatatgcact gggtccggca agctccaggg aagggcctgg agtgggtcgc cagaattagt 540

cctggaggcg gatatatagg ctatgcggac tctgtgaagg gccgattcac catctccgcc 600

gacacctcta agaacacagc atatctgcaa atgaacagtc tgagagctga ggacacggcc 660

gtctattact gcgcaagaag ggactatggt gactacgggt ttgcttactg gggacagggt 720

actttggtta ccgtctcttc c 741

<210> 5

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttac 204

<210> 6

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agagtgaagt tcagcaggag cgcagagccc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 9

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaggcggag gcgggagagc agaagggaga ggaagcttgc taacctgtgg agacgttgag 60

gaaaatccag ggcca 75

<210> 10

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagttaa 297

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括CEA单链抗体、Her-2单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构，

其中，CEA单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

Her-2单链抗体结构是针对结肠癌细胞表面肿瘤相关抗原Her-2设计的特异性抗原结合域，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，嵌合抗原受体结构组成为Igkappa-iRGD-CEA scFv-(G₄S)₅-Her-2scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。

3.根据权利要求2所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，

iRGD核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

CEAscFv表示CEA单链抗体，

(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

Her-2scFv表示Her-2单链抗体，

CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

CD28-CD137为共刺激结构域，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，

T2A为linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.一种结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述嵌合抗原受体，以及载体。

5.根据权利要求4所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒表达载体。

6.根据权利要求5所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)。

7.一种如权利要求5或6所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的构建方法，其特征在于，

将嵌合抗原受体结构按照基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后存在于PUC19质粒载体上；将PUC19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ECoRⅠ、NotⅠ双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，得出载体和目的片段的浓度，将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化，质粒提取，最终获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，即所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体。

8.一种如权利要求5或6所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，其特征在于，用于构建CAR-T细胞，

将该治疗载体采用三质粒包装***进行慢病毒包装，组成为PSPAX2、pMD2G、结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体，使用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得CAR-T细胞。

9.根据权利要求8所述结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，其特征在于，PSPAX2、pMD2G、结肠癌的双靶点CAR-T治疗载体在体系中有固定的含量比例。

10.一种CAR-T细胞，其特征在于，采用权利要求8的应用方法制备得到。