CN108636471A - 一种核酸扩增装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸扩增装置，包括机箱、平板微流控芯片、毛细管微反应器，所述的加热装置包括加热块、温控器、继电器，所述的加热装置的加热块采用独立控温设计，其导热板的凹槽设计，使得本装置既可用于平板式微流控芯片的加热控温，也可以用于毛细管微反应器的控温。本发明还提供了上述核酸扩增装置在连续流核酸扩增反应***及液滴微流控核酸扩增反应***中的应用，能够有效地提高核酸扩增反应的控温效率，缩短反应时间。

Description

一种核酸扩增装置及其应用

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及一种核酸扩增装置及其应用。

背景技术

核酸是所有形式的生命体存在的基础，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。目前，核酸体外扩增及检测技术是基因克隆、基因分型、基因诊断和核酸测序等生物及医学领域的基础，发挥着相当重要的作用。核酸扩增技术可以大致分为变温扩增技术和等温扩增技术。

核酸扩增仪(PCR仪)是一种温度控制仪，其中变温扩增技术所使用的温度控制仪还需满足热循环的要求，一般PCR仪根据PCR技术的原理，将温度设定为三个区间，分别是双链DNA变性即双链解链(90℃-96℃)、引物与模板DNA复性即退火(25℃-65℃)和引物延伸(70℃-75℃)，进行循环多次的升降温，但由于温差大会造成能源浪费，同时升降温时间过长会造成总体反应时间增加。等温扩增技术是在恒定温度下操作的一种核酸扩增技术，有很高的灵敏度和特异性，一般PCR仪都可进行等温扩增。

液滴微流控技术是指利用微尺度管道控制体积在皮升至纳升间的微小流体进行流动然后发生化学反应或者传热等物理反应的技术。通过不相溶的流体把连续流体分散成液滴，每个液滴是一个独立的微反应器，样品的消耗少，液滴的大比表面积有更好的传热传质效率，通过选择合适的连续相，可以阻隔样品与微通道的接触，避免了污染，这些优点使得液滴微流控技术在药物输运、单细胞分析、基因检测等科学研究领域有着特别重要的应用。

然而传统的PCR仪，采用半导体控温方式，加热区是一个固定的空间，通过一段时间快速升降温完成不同反应温度之间的切换，这种控温方式对仪器的性能要求很高。对于液滴微流控核酸扩增反应***来说，与传统PCR的几十微升反应体系相比，液滴体积小，通常是纳升级甚至皮升级，升降温所需要的热量远远低于普通PCR管，半导体控温方式对时间和能源来说都是某种程度上的浪费。

此外，目前大多数液滴微流控反应***均采用普通PCR仪实现温度控制，通常采用的方式是将微流控芯片置于加热块上进行升降温控制，但是这种方式一方面热量从芯片底部传导到微通道内部要损失一部分，另一方面芯片上部为敞开体系，加速了热量的损失，不利于精准控温。而毛细管***是无法用商品化PCR仪器加热的，而且由于毛细管管壁很薄，传热快，就使得表面加热的方式散热快，更不易控温。

实用新型CN2464731Y和专利CN106434280A分别公开了两种圆柱型PCR扩增装置，其中前一个装置由缠绕于圆截面柱心上的n匝毛细管、加热单元、流速控制单元和与加热单元相连的温度控制单元构成，加热单元由m块或m对相互独立的弧形恒温块组成闭合圆。但是该实用新型的圆柱型设计所需的毛细管的长度较长，样品的消耗量较大。而且该***只能够作为毛细管PCR反应器，对于平板微流控芯片***并不适用。而后一个装置以水为传热液体，通过加热水来控制不同温区的温度，采用步进电机控制圆盘控温模块旋转来实现对微流控芯片的加热，以及在不同温度之间进行切换。该装置***比较复杂，步进电机加上液体传热等。其实液滴体积小，金属加热块足够满足其热量需求，而且其技术细节描述不够详细准确，也缺少实际应用的数据，因此很难判断其实用性。

发明内容

本发明提供了一种核酸扩增装置，整个装置结构简单，不需要升降温程序，适合用于微流控芯片及毛细管核酸反应的温度控制。

一种核酸扩增装置，包括机箱、平板微流控芯片、毛细管微反应器，机箱上设有加热装置，机箱侧面带有出风口，机箱内置风扇，所述的加热装置包括加热块、温控器、继电器，所述的加热块底部带有热电偶和加热片，所述的加热块至上而下依次包括盖板、导热板和加热板；其中，导热板的上、下表面设有凹槽，所述凹槽与毛细管微反应器相配合；盖板与平板微流控芯片相固定。

所述加热装置为若干组，若干组的加热块彼此平行放置，相邻加热块的间距为1～5mm。

作为优选，所述的加热装置为3～5个。

所述的加热块均独立配有温控器、热电偶、加热片及继电器，所述的热电偶和加热片通过继电器与温控器相连，当热电偶检测到的温度低于设定值时，导通继电器，通过加热片使加热板升温，在温度高于设定值时，切断继电器，停止加热。所述的各加热块的温度能被单独温控调节为核酸扩增变性温度区的温度或退火/延伸温度区的温度。

作为优选，所述的加热块为长方体。

所述加热板，导热板及盖板的材质为金属，鉴于金属的导热、导电综合性能考虑，作为优选，所述的加热板、导热板及盖板采用黄铜或铝制成。

所述的温控器为XM708专家PID控制仪；热电偶为Pt100贴片；加热片为PTC陶瓷加热片。

所述加热块、热电偶和加热片的尺寸不做特殊要求，可根据实际需要设定；且加热片的功率可根据实际应用灵活设定。

所述平板微流控芯片内部设有的蛇形微反应通道通过标准光刻技术加工得到，其内壁经硅烷化处理，各平行反应通道的轴线与彼此平行的加热块的平行线垂直。

所述平板微流控芯片为硅、玻璃或塑料材质。

所述毛细管微反应器，由一根石英毛细管在同一平面内蛇形盘绕，或多根毛细管用硅胶管蛇形连接形成，各节圆柱管道轴线与彼此平行的加热块的平行线垂直，具体操作即为将毛细管微反应器的毛细管卡入导热板的上、下表面设有的凹槽。

所述机箱壳体内置一个风扇，随电源开关工作，可以加快加热块的散热速率。

本发明提供了上述核酸扩增装置在连续流核酸扩增反应***及液滴微流控核酸扩增反应***中的应用。

本发明装置的工作原理为：通过将加热块独立控制为与核酸扩增步骤相对应的温度区：变性温度区和退火/延伸温度区，从而使被固定在加热块上的毛细管微反应器或微流控芯片的微反应通道的温度与相应的温度区相同，反应溶液以某一速度连续通过微反应通道时，可以在不同的温度区发生相对应的反应，蛇形盘绕的微反应通道可以使反应溶液在不同温度区内循环进行，实现连续流核酸扩增反应。基于同样的原理，本发明装置也可以实现液滴微流控核酸扩增反应。

本发明设计的加热块独立控温，当各加热块的温度一致时，可以进行等温扩增反应；当两侧的若干个加热块的温度调节为变性温度，中间的若干个加热块的温度调节为退火/延伸温度时，本发明的核酸扩增装置还可进行PCR变温扩增反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)三层金属加热块既可用于平板式微流控芯片的加热控温，也可以用于毛细管微反应器的控温。

(2)可以通过夹心式结构对微流控芯片实现充分有效地控温，提高控温效率，缩短反应时间。

(3)金属加热块表面的凹槽设计，能够有效地提高毛细管微反应器的传热效率，加速反应进行。样品的消耗量减少，从而节约了时间、人力和资源成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中核酸扩增装置的机箱结构示意图。

图2为本发明实施例1中核酸扩增装置的加热装置的内部结构示意图。

图3(a)为本发明实施例1中核酸扩增装置的加热块的导热板的俯视图；图3(b)为导热板A方向的侧视图。

图4为本发明实施例1中核酸扩增装置的加热装置与平板芯片或毛细管反应器配合使用模式图：其中(a)代表毛细管反应器应用模式；(b)代表平板微流控芯片应用模式。

图5为本发明应用例1中核酸等温扩增反应产物的凝胶电泳图。

图6为本发明应用例2中PCR扩增反应产物的凝胶电泳图。

图7为本发明应用例3中液滴式核酸等温扩增结果的荧光信号检测图，其中(a)为反应1min的荧光信号检测图，(b)为反应5min的荧光信号检测图。

其中，机箱1，加热块2，盖板21，导热板22，加热板23，温控器3，热机电偶4，加热片5，风扇6，继电器7，毛细管微反应器8，平板微流控芯片9，出风口10，电源开关11，螺纹固定阀12，导热板上的凹槽221。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，有必要指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，并不能理解为对本发明保护范围的界定。

本发明装置的平板微流控芯片和毛细管微反应器的毛细管内壁疏水化处理步骤如下：

(1)活化，取4gNaOH，溶于水配成2M的NaOH溶液，通入毛细管内部30min。之后将去离子水通入毛细管内部30min清洗掉NaOH溶液，再通入乙醇30min，然后将毛细管放入真空干燥箱中80℃真空干燥3个小时(通入速度均为10μL/min)。

(2)硅烷化，首先量取100μL的OTCS加到40ml异辛烷中，配得硅烷化试剂。然后依次将硅烷化试剂、异辛烷、乙醇通入毛细管内部，将毛细管放入真空干燥箱中80℃真空干燥3个小时即可。

实施例1：

一种核酸扩增装置，包括机箱1、毛细管微反应器8、平板微流控芯片9，其中，机箱1上表面设有3个长方体加热块2、3个温控器3，机箱1侧面设有出风口10和电源开关11，机箱内置风扇6，机箱结构示意图参见图1。

如图2所示，所述的长方体加热块2底部设有热电偶4和加热片5，通过继电器7与温控器3相连，且每个加热块2均独立配有温控器3、及继电器7，以上部件共同构成加热装置。

所述的加热块至上而下依次包括盖板21、导热板22和加热板23；其中，导热板22的上、下表面设有凹槽221，导热板的俯视图如图3(a)所示，其侧视图如图3(b)所示，所述凹槽221与毛细管微反应器8相配合；盖板21上设有螺纹固定阀12，用于固定平板微流控芯片9。

上述3个加热块2为黄铜材质，彼此平行放置，相邻加热块的间距为2mm；其中加热块的盖板21、导热板22和加热板23的长度均为70mm，宽度均为15mm，厚度为3mm。

所述的温控器3为XM708专家PID控制仪。

所述的热电偶4为长度6mm，宽度3mm，厚度1mm的Pt100贴片。

所述的加热片5为PTC陶瓷加热片，其长度为50mm，宽度为10mm，厚度为3mm，发热功率为70W。

所述机箱壳体内置一个风扇6，随电源开关11工作，可以加快加热块的散热速率。

本发明装置应用于核酸扩增反应时，具体分为毛细管微反应器应用模式和平板微流控芯片应用模式，分别如图4(a)和图4(b)所示。

具体应用时，毛细管微反应器8的毛细管卡入导热板的凹槽221内，蛇形结构的毛细管微反应器的各节圆柱管道轴线与彼此平行的加热块的平行线垂直放置，毛细管微反应器两端接入连续流核酸扩增反应***或液滴微流控核酸扩增反应***即可；或，

平板微流控芯片9的蛇形微反应通道的各节圆柱管道轴线与彼此平行的加热块的平行线垂直放置，微反应通道两端接入连续流核酸扩增反应***或液滴微流控核酸扩增反应***即可。

应用例1

采用在本发明装置毛细管微反应器中进行连续流核酸指数滚环扩增反应，本装置毛细管反应器的微反应通道选用内径50μm的石英毛细管，硅烷化处理使毛细管内壁疏水，卡入导热板上、下表面的凹槽。

设计一个指数滚环扩增反应，首先以HPV-11的一段序列为靶标(Target)，相应序列如下：

Target：3’-ACACCGCTCTGTTGAAAGGG

Circle：

GTGAATGTCTACTTGTGGCGAGACAACTTTCCCTTTGCAATAACATTATACGCCATCCTCAGCCAGCCTCTTGCCAGT

再设计一段与RCA产物(RCPs)序列互补配对的一条新引物P2

RCPs：5’-ACTGGCAAGAGGCTGGCTGA

P2：3’-TGACCGTTCTCCGACCGACT

5μL体系的指数滚环扩增条件如表1所示：

表1 5μL体系的指数滚环扩增反应物的用量

注：dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸。

同样的反应液各5uL，以0.5μL/min的流速分别注射到商品PCR仪和本发明装置的毛细管微反应器中进行核酸扩增反应。其中本发明装置的加热块2的温度均设置为65℃；在65℃下进行恒温扩增10分钟，然后在1％的琼脂糖凝胶电泳中分离检测，结果如图5所示，其中，1和2分别是商品化PCR仪中的样品和空白对照结果；3和4分别是毛细管中的样品和空白对照的凝胶电泳结果。由图4可知，用本发明装置进行滚环扩增反应，其反应效率和产物量均与商品化仪器相当。

应用例2

采用在本发明装置平板微流控芯片中进行连续流在连续流核酸PCR扩增反应。

设计一个PCR反应，首先以植物基因组TRNL的一段序列为靶标，设计引物序列如下：

Primer-1 GGGGATAGAGGGACTTGAAC

Primer-2 CGAAATCGGTAGACGCTACG；

PCR扩增体系和程序

1.PCR扩增体系：在0.2mL Eppendorf离心管中加入以下反应物：

2.PCR程序：

如图2所示，玻璃微流控芯片9固定于盖板21上，加热块2设有三个单独温控的变性温度区和退火/延伸温度区，分别为94℃，55℃和72℃。

同样的反应液各20uL，分别在商品PCR仪和本装置的平板微流控芯片中进行核酸扩增反应，然后在1％的琼脂糖凝胶电泳中分离检测，其结果如图6所示，其中1和2分别是商品化PCR仪中的样品和空白对照结果；3和4分别是平板微流控芯片中的样品和空白对照的凝胶电泳结果。可见，用本装置进行PCR扩增反应的纯度和灵敏度也与商品化仪器相当。

应用例3

利用本发明装置实现液滴微流控核酸扩增反应，所述液滴微流控液滴核酸扩增反应***包括液滴生成装置、核酸扩增装置和核酸检测装置，与连续流核酸扩增反应的区别是反应液经液滴生产装置生成平均体积为纳升的液滴，所生成的纳升级液滴经注射泵进入核酸扩增装置进行核酸扩增反应，反应结束后的液滴到达核酸检测装置进行检测。

本应用中，反应液经液滴生产装置生成平均体积为0.29nL的液滴，经注射泵历时33s进入核酸扩增装置的平板微流控芯片的石英毛细管中进行等温核酸扩增反应，3个加热块2的温度均设置为65℃，反应10分钟，反应结束40s后，液滴到达核酸检测装置，其中核酸检测装置的激发光为460nm，液滴中的荧光分子被激发，产生荧光信号，检测结束后30s，液滴离开核酸检测装置，整个过程耗时共计750s，即12.5min。

本应用例所用反应液与应用例1相同。

图7为液滴中荧光信号的检测结果，从荧光信号的明显变化可以判断出液滴中发生了指数滚环扩增反应，从而证明本发明装置可以实现液滴微流控核酸扩增反应。

上述是结合具体实施方式及应用例对本发明作详细说明，但是本发明的实施方式并不受其限制，其它任何在本发明专利核心指导思想下所作的改变、替换、组合简化等都包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸扩增装置，包括机箱(1)、毛细管微反应器(8)、平板微流控芯片(9)，机箱(1)上设有加热装置，机箱侧面带有出风口(10)，机箱内置风扇(6)，其特征在于，所述的加热装置包括加热块(2)、温控器(3)、继电器(7)，所述的加热块(2)底部带有热电偶(4)和加热片(5)，所述的加热块(2)至上而下依次包括盖板(21)、导热板(22)和加热板(23)；其中，导热板(22)的上、下表面设有凹槽(221)，所述凹槽(221)与毛细管微反应器(8)相配合；盖板(21)与平板微流控芯片(9)相固定。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述加热装置为若干组，若干组的加热块(2)彼此平行放置，相邻加热块的间距为1～5mm。

3.根据权利要求2所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述的加热装置为3～5个。

4.根据权利要求2或3所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述的加热块为长方体。

5.根据权利要求1所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述的加热板(23)、导热板(22)及盖板(21)的材质为黄铜或铝。

6.根据权利要求1所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述毛细管微反应器(8)，由一根石英毛细管在同一平面内蛇形盘绕，或多根毛细管用硅胶管蛇形连接形成。

7.根据权利要求6所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述的毛细管微反应器(8)的毛细管卡入导热板(22)的上、下表面设有的凹槽(221)。

8.根据权利要求1所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述平板微流控芯片(9)内部设有蛇形微反应通道，所述微反应通道通过标准光刻技术加工得到,并且内壁经硅烷化处理。

9.根据权利要求8所述的核酸扩增装置，其特征在于，所述的平板微流控芯片内部设有的蛇形微反应通道，其平行反应通道的轴线与彼此平行的加热块的平行线垂直。

10.根据权利要求1～9任一项所述的核酸扩增装置在连续流核酸扩增反应***及液滴微流控核酸扩增反应***中的应用。