CN108627646A - 一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器及用于检测癌胚抗原 - Google Patents

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Abstract

一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器及在检测癌胚抗原中的应用，属于荧光生物传感器技术领域。该传感器是基于二种材料基础上构建的，一是具有高效荧光猝灭能力和对单链DNA、单链DNA与蛋白复合物具有良好生物识别功能的二维MoS2纳米片；二是具有特异性识别抗原、成本低、稳定性好、易于修饰等特点的癌胚抗原适配体。该生物传感器具有构建简单，快速检测，灵敏度高，特异性好，成本低廉，可重复性好等特点。本发明所构建的生物传感器在最佳优化条件下，对癌胚抗原的线性检测范围是100pg/mL～100ng/mL，检测下限为34pg/mL。该荧光生物传感器在多种肿瘤的筛选、诊断和预后评价方面有良好的应用前景。

Description

一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物 传感器及用于检测癌胚抗原
技术领域
本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体涉及一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器及用于检测癌胚抗原。
背景技术
因处于晚期的肿瘤治愈率很低，所以早诊早治是战胜肿瘤的一个重要方法，而高灵敏检测肿瘤标志物可以大大提高肿瘤早期诊断的准确率。简单、快速和灵敏的检测肿瘤标志物癌胚抗原对于筛查、诊断和预后评估多种胃肠道肿瘤都非常重要。目前临床上用于癌胚抗原检测的方法主要有酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法和化学发光免疫测定法，然而这些免疫方法存在着成体高，检测慢，对操作人员技术要求高，检测过程繁琐等缺点。生物传感器因具有构建简单、快速分析，成本低，灵敏度高等优点而备受关注。因此开发用于肿瘤标志物检测的生物传感器具有非常重要的临床应用前景。生物传感器很多是在纳米材料的基础上建立的，常用的材料有金纳米粒子，碳纳米管，石墨烯，二维过渡金属硫化物，二维过渡金属氧化物等(M.C.Canbaz,C.S. Simsek,M.K.Sezginturk,Electrochemicalbiosensor based on self-assembled monolayers modified with gold nanoparticlesfor detection of HER-3,Analytica Chimica Acta,2014, 814,31-38.H.P.Peng,Y.Hu,P.Liu,Y.N.Deng,W.Peng,W.Chen,A.L.Liu,Y.Z.Chen, X.H.Lin,Label-freeelectrochemical DNA biosensor for rapid detection of mutidrug resistance genebased on Au nanoparticles/toluidine blue–graphene oxide nanocomposites.Sensors and Actuators B:Chemical 2015,207,269-276.)。随着石墨烯的问世，二维纳米材料受到越来越多的关注。与其它材料相比，二维金属硫化物表现出良好的生物学应用潜能：1)较高的表面积体积比，可以负载多种大量的功能性分子，2)较强的荧光猝灭能力，3)在近红外处有很强的吸收，4)良好的光热效应，5)超薄的横向维度使其具有发光性能，已用于研究酶活性和细胞活力。目前基于二维金属硫化物构建的电化学免疫传感器用于检测分析过氧化氢，葡萄糖，多巴胺，DNA较多，而针对蛋白型肿瘤标志物的荧光生物传感器很少。因此，构建一种简单，快速，成本低，灵敏度高的用于检测肿瘤标志物的荧光生物传感器具有重要意义，而使用具有高效猝灭能力和良好生物识别功能的二维MoS2纳米片和具有成本低，稳定性好，易于修饰等特点的适配体是实现这种性能优良的生物传感器的一种有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器及用于检测癌胚抗原。该传感器是基于二种材料基础上构建的，一是具有高效荧光猝灭能力和对单链DNA、单链DNA与蛋白复合物具有良好生物识别功能的二维MoS2纳米片；二是具有特异性识别抗原，成本低，稳定性好，易于修饰等特点的癌胚抗原适配体。该生物传感器具有构建简单，快速检测，灵敏度高，特异性好，成本低廉，可重复性好等特点。将二维的MoS2纳米材料用于构建生物传感器来检测肿瘤标志物，且同时用适配体取代抗体进行靶向蛋白的识别，并且适配体对靶向蛋白有很好特异性和选择性。本发明中与适配体连接的荧光染料是德克萨斯红(Texas Red)，该荧光染料在适宜的条件下可以与MoS2纳米片发生荧光共振能量转移。
本发明所述的一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器的制备方法，其步骤如下：
(1)设计癌胚抗原适配体探针5’-Texas Red(德克萨克斯红) –ATACCAGCTTATTCAATT-3’，送生物工程公司合成，得到适配体探针粉末；其中核苷酸序列来自于文献：S.Su,M.Zou,H.Zhao,C.Yuan,Y.Xu,C.Zhang,L.Wang,C.Fan, L.Wang,Shape-controlled gold nanoparticles supported on MoS(2)nanosheets: synergisticeffect of thionine and MoS(2)and their application for electrochemical label-free immunosensing,Nanoscale 2015,7,19129-35；
(2)将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中(该缓冲液含有浓度为100mM的 NaCl、浓度为5mM的KCl和浓度为5mM的MgCl2，溶剂为去离子水)，将2μL、5 μM适配体探针溶液加入到该离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液，得到已知浓度的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到离心管中，癌胚抗原的终浓度为0.1～100ng/mL；然后用10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液补充体积至 1400～1900μL，并在37℃水浴锅中孵育1～3小时；
(3)将MoS2纳米片溶液加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为 2mL，混匀后室温下反应5～20分钟；离心管中，MoS2纳米片的终浓度为100～300 μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
(4)将步骤(3)得到的溶液加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，然后绘制荧光强度与癌胚抗原浓度之间的关系曲线；从而得到本发明所述的基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器；比色皿光程长10mm，激发波长为 595nm，发射波长为618nm；
(5)未知浓度癌胚抗原的检测：将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，得到未知浓度的癌胚抗原溶液；用该溶液代替步骤(2)中已知浓度的癌胚抗原溶液，加入到离心管中，然后进行步骤(2)和步骤(3)所述的后续操作，进行荧光光谱测定，然后根据步骤(4)中的绘制荧光强度与癌胚抗原浓度之间的关系曲线计算得到癌胚抗原的浓度。
本发明的优点在于：
1)将经典的二维纳米材料MoS2纳米片应用于构建生物传感器体系。因为二维的MoS2纳米片不仅具有高效的荧光猝灭能力，还具有生物识别能力，能够识别适配体、适配体与蛋白的复合物，使传感器的构建简化，免去了多种材料的制备过程，同时使检测过程快速。
2)选用适配体来代替传统的蛋白抗体进行靶向蛋白的识别，使得传感器制备成本更低，且稳定性更好。
3)该传感器具有较好的选择性和较高的灵敏度，检测线为34pg/mL，线性检测范围是0.1～100ng/mL。
4)响应时间快，在1分钟内大部分荧光被猝灭，5分钟内MoS2纳米片对适配体探针荧光猝灭达到稳定状态。
工作原理：
荧光基团Texas Red作为荧光共振能量转移的供体，其激发波长为595nm，发射波长为618nm。MoS2纳米片作为荧光共振能量转移的受体，具有高效的猝灭能力。荧光标记的适配体通过适配体与MoS2纳米片间的范德华力吸附到MoS2纳米片表面，从而使荧光基团和MoS2纳米片间距离拉近，使得二者之间的荧光共振能量转移发生，最终导致荧光基团的荧光被猝灭。当反应体系中存在癌胚抗原时，癌胚抗原会与它的适配体发生特异性结合，导致适配体构象改变，从而使适配体与MoS2纳米片间的作用力变弱，使其从MoS2纳米片表面脱离，这样使荧光基团和MoS2纳米片间距离变大，不能发生荧光共振能量转移，最终荧光基因的荧光恢复，通过荧光信号的变化来实现癌胚抗原的检测。
附图说明
图1为基于MoS2纳米片基础上构建的用于检测癌胚抗原的荧光生物传感器原理示意图。
图2为适配体和适配体/癌胚抗原分别在加入MoS2纳米片后的荧光猝灭曲线；
图3a为对比例、实施例1、实施例2和实施例3产物的荧光光谱图；
图3b为对比例、实施例1、实施例2和实施例3产物与癌胚抗原孵育后的荧光光谱图。
图4为对比例、实施例1、实施例2和实施例3产物在608nm处的荧光强度和加入癌胚抗原后在608nm处的的荧光恢复强度(ΔF)对比图。
图5a为实施例2产物在加入不同浓度癌胚抗原后的荧光光谱图；
图5b为本发明构建的荧光生物传感器的荧光恢复比率F/F0与不同浓度蛋白间的敏感性分析曲线，插图为荧光恢复比率F/F0与不同浓度蛋白取对数后的校准曲线。F 和F0分别为实施例2产物加入癌胚抗原前后在608nm处的荧光强度。
图6为基于MoS2纳米片和适配体探针基础上构建的荧光生物传感器的选择性示意图。BSA：牛血清白蛋白，IgG：免疫球蛋白G，ssDNA：单链DNA。
如图1所示，适配体通过与MoS2纳米片间的范德华力吸附到MoS2纳米片表面，从而使荧光基团和MoS2纳米片间距离拉近，使得二者之间的荧光共振能量转移发生，最终导致荧光基团的荧光被猝灭。当反应体系中存在癌胚抗原时，癌胚抗原会与它的适配体发生特异性结合，导致适配体构象改变，从而使适配体与MoS2纳米片间的作用力变弱，使其从MoS2纳米片表面脱离，不能发生荧光共振能量转移，最终荧光基因的荧光恢复，通过荧光信号的变化来实现癌胚抗原的检测。
如图2所示，MoS2纳米片对适配体探针和适配体探针/癌胚抗原的猝灭是非常快的，在5分钟内达到平衡。
如图3所示，在适配体和MoS2纳米片体系、适配体/癌胚抗原和MoS2纳米片体系中，对比例和实施例1、实施例2和实施例3呈现不同的荧光光谱，且与对比例相比，在适配体和MoS2纳米片体系中实施例1、实施例2和实施例3中的荧光被更好的猝灭。当在适配体/癌胚抗原和MoS2纳米片体系中，对比例和实施例1、实施例2 和实施例3荧光均被不同程度的恢复。.
如图4所示，与对比例相比，实施例1、实施例2和实施例3中的荧光均被更有效的猝灭，且在加入相同浓度的癌胚抗原后，对比例、实施例1、实施例2和实施例3中的荧光均得到恢复。其中实施例2中的荧光在适配体和MoS2纳米片体系中绝大部分荧光被猝灭，并且在适配体/癌胚抗原和MoS2纳米片体系中荧光得到最大程度的恢复，表现出最佳的传感特性。
如图5a所示，在实施例2中随着加入癌胚抗原浓度的增加，荧光信号也在逐渐增强，在蛋白浓度大于等于80ug/mL获得最大的荧光信号。
如图5b所示，在实施例2中荧光恢复比率F/F0随着加入癌胚抗原浓度增加也在逐渐增大，如***所示，在癌胚抗原浓度在0.1-100ng/mL范围时，荧光恢复比率F/F0与蛋白浓度的对数值呈线性相关，线性方程为F/F0＝6.8408+6.78455log[CEA] (R2＝0.9828)。表明实施例2传感器具有良好的敏感特性。
如图6所示，在同样的传感体系中分别加入对照组样品(BSA，IgG,，ssDNA) 和空白组样品以及不同浓度的癌胚抗原，发现加入的对照组样品(BSA，IgG,，ssDNA) 荧光强度都和空白组样品(control)的荧光强度接近，而加入癌胚抗原后，即使是低浓度的癌胚抗原(1ng/mL)，其传感体系荧光强度明显高于各对照组。表明该生物传感器具有较好的选择性。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行了实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
对比例1
1、设计适配体探针，送上海生工生物工程公司合成；癌胚抗原适配体探针序列：5’-Texas Red(德克萨克斯红)–ATACCAGCTTATTCAATT-3’，得到适配体探针粉末；其中核苷酸序列来自于文献：S.Su,M.Zou,H.Zhao,C.Yuan,Y.Xu,C.Zhang, L.Wang,C.Fan,L.Wang,Shape-controlled gold nanoparticles supported on MoS(2) nanosheets:synergistic effect of thionine and MoS(2)and their application forelectrochemical label-free immunosensing,Nanoscale 2015,7,19129-35.
2、将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中(该缓冲液含有浓度为100mM的 NaCl、浓度为5mM的KCl和浓度为5mM的MgCl2，溶剂为去离子水)，将2μL、5 μM适配体探针溶液加入到该离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液，得到终浓度为10ng/mL的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到离心管中；然后用10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液补充体积至1900μL，并在37℃水浴锅中孵育2小时；
3、将市售的浓度为1mg/mL的MoS2纳米片溶液100μL加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为2mL，混匀后室温下反应10分钟；离心管中， MoS2纳米片的终浓度为50μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
4、取步骤(3)得到的溶液2mL加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，通过对荧光信号的强度的检测实现对癌胚抗原浓度的检测。比色皿光程长10mm。激发波长为595nm，发射波长为618nm。
实施例1
1、设计适配体探针，送上海生工生物工程公司合成；癌胚抗原适配体探针序列：5’-Texas Red(德克萨克斯红)–ATACCAGCTTATTCAATT-3’，得到适配体探针粉末；其中核苷酸序列来自于文献：S.Su,M.Zou,H.Zhao,C.Yuan,Y.Xu,C.Zhang, L.Wang,C.Fan,L.Wang,Shape-controlled gold nanoparticles supported on MoS(2) nanosheets:synergistic effect of thionine and MoS(2)and their application forelectrochemical label-free immunosensing,Nanoscale 2015,7,19129-35.
2、将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中(该缓冲液含有浓度为100mM的 NaCl、浓度为5mM的KCl和浓度为5mM的MgCl2，溶剂为去离子水)，将2μL、5 μM适配体探针溶液加入到该离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液，得到终浓度为10ng/mL的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到离心管中；然后用10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液补充体积至1800μL，并在37℃水浴锅中孵育2小时；
3、将市售的浓度为1mg/mL的MoS2纳米片溶液200μL加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为2mL，混匀后室温下反应10分钟；离心管中， MoS2纳米片的终浓度为100μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
4、取步骤(3)得到的溶液2mL加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，通过对荧光信号的强度的检测实现对癌胚抗原浓度的检测。比色皿光程长10mm。激发波长为595nm，发射波长为618nm。
实施例2
1、设计适配体探针，送上海生工生物工程公司合成；癌胚抗原适配体探针序列：5’-Texas Red(德克萨克斯红)–ATACCAGCTTATTCAATT-3’，得到适配体探针粉末；其中核苷酸序列来自于文献：S.Su,M.Zou,H.Zhao,C.Yuan,Y.Xu,C.Zhang, L.Wang,C.Fan,L.Wang,Shape-controlled gold nanoparticles supported on MoS(2) nanosheets:synergistic effect of thionine and MoS(2)and their application forelectrochemical label-free immunosensing,Nanoscale 2015,7,19129-35.
2、将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中(该缓冲液含有浓度为100mM的 NaCl、浓度为5mM的KCl和浓度为5mM的MgCl2，溶剂为去离子水)，将2μL、5 μM适配体探针溶液加入到该离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液，得到终浓度为10ng/mL的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到离心管中；然后用10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液补充体积至1600μL，并在37℃水浴锅中孵育2小时；
3、将市售的浓度为1mg/mL的MoS2纳米片溶液400μL加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为2mL，混匀后室温下反应10分钟；离心管中， MoS2纳米片的终浓度为200μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
4、取步骤(3)得到的溶液2mL加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，通过对荧光信号的强度的检测实现对癌胚抗原浓度的检测。比色皿光程长10mm。激发波长为595nm，发射波长为618nm。
实施例3
1、设计适配体探针，送上海生工生物工程公司合成；癌胚抗原适配体探针序列：5’-Texas Red(德克萨克斯红)–ATACCAGCTTATTCAATT-3’；其中核苷酸序列来自于文献：S.Su,M.Zou,H.Zhao,C.Yuan,Y.Xu,C.Zhang,L.Wang,C.Fan,L. Wang,Shape-controlledgold nanoparticles supported on MoS(2)nanosheets:synergistic effect ofthionine and MoS(2)and their application for electrochemical label-freeimmunosensing,Nanoscale 2015,7,19129-35.
2、将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中(该缓冲液含有浓度为100mM的 NaCl、浓度为5mM的KCl和浓度为5mM的MgCl2，溶剂为去离子水)，将2μL、5 μM适配体探针溶液加入到该离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液，得到终浓度为10ng/mL的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到离心管中；然后用10mM、Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液补充体积至1400μL，并在37℃水浴锅中孵育2小时；
3、将市售的浓度为1mg/mL的MoS2纳米片溶液600μL加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为2mL，混匀后室温下反应10分钟；离心管中， MoS2纳米片的终浓度为300μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
4、取步骤(3)得到的溶液2mL加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，通过对荧光信号的强度的检测实现对癌胚抗原浓度的检测。比色皿光程长10mm。激发波长为595nm，发射波长为618nm。

Claims (3)

1.一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器，其特征在于：是由如下步骤制备得到，
(1)设计癌胚抗原适配体探针5’-Texas Red–ATACCAGCTTATTCAATT-3’，送生物工程公司合成，得到适配体探针粉末；
(2)将适配体探针粉末用蒸馏水溶解，得到5μM的适配体探针溶液；取离心管加入998μL、10mM Tris-HCl缓冲液，将2μL、5μM适配体探针溶液加入到上述离心管中，震荡混匀；将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl缓冲液，得到已知浓度的癌胚抗原溶液；将该溶液加入到上述离心管中，癌胚抗原的终浓度为0.1～100ng/mL；然后用10mM、Tris-HCl缓冲液补充体积至1400～1900μL，并在37℃水浴锅中孵育1～3小时；
(3)将MoS2纳米片溶液加入到步骤(2)的溶液中，使离心管中溶液的体积为2mL，混匀后室温下反应5～20分钟；离心管中，MoS2纳米片的终浓度为100～300μg/mL，适配体探针的终浓度为5nM；
(4)将步骤(3)得到的溶液加入到比色皿中，进行荧光光谱测定，然后根据测得的荧光强度与癌胚抗原浓度的数值关系拟合得到荧光强度－癌胚抗原浓度标准曲线；从而制备得到基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器。
2.权利要求1所述的一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器在检测癌胚抗原中的应用。
3.如权利要求2所述的一种基于二维MoS2纳米片和癌胚抗原适配体构建的荧光生物传感器在检测癌胚抗原中的应用，其特征在于：将癌胚抗原溶于10mM、Tris-HCl缓冲液，得到未知浓度的癌胚抗原溶液；用该溶液代替权利要求1步骤(2)中已知浓度的癌胚抗原溶液，加入到离心管中，进行权利要求1步骤(2)～(4)所述的各项操作，然后进行荧光光谱测定，根据测得的荧光强度通过标准曲线计算得到癌胚抗原的浓度。
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