CN105651840A - 一种检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

一种检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法，属于生物传感和电分析化学检测技术领域。本发明将金纳米粒子与巯基修饰的核酸适配体及硫堇共同作用形成稳定的纳米共轭物；同时在羧基化氧化石墨烯修饰的电极表面进行抗体的固定；识别Aβ寡聚体后进一步结合核酸适配体修饰的金纳米粒子共轭物，从而形成夹心型类免疫传感器；通过硫堇的电化学信号实现对Aβ寡聚体的测定。所述传感器灵敏度高、特异性好及稳定性高；与传统免疫传感器相比，具有制备简单及避免使用酶标抗体试剂的特点，可用于脑脊髓液中Aβ寡聚体的检测，促进阿尔茨海默病的早期诊断，具有临床应用价值。

Description

一种检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法，具体涉及一种以抗体和核酸适配体形成夹心型结构识别β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法，属于生物传感和电分析化学检测技术领域。
背景技术
随着我国步入老龄化社会，阿尔茨海默病(AD)的发病率逐渐提高，严重危害老年人的身心健康并影响生存质量。AD标志物的检测是实现早期诊断和了解病情发展的重要途径。研究表明，AD的发生和大脑里淀粉样斑块的形成密切相关。斑块形成是由于分泌酶复合物异常切割淀粉样前体蛋白而产生的过量β-淀粉样蛋白(Aβ)所致。与单体和纤维聚集体Aβ相比，Aβ寡聚体更大的比表面积使其含有丰富的β折叠构象，从而疏水残基从蛋白质表面被挤压出来引起钙离子内流、多巴胺外漏、线粒体去极化而导致细胞凋亡。因此，寡聚体被认为比纤维聚集体更具有毒性，可溶性Aβ寡聚体已经被作为AD的标志物。
常用的检测Aβ寡聚体的方法主要有酶联免疫法、磁共振成像法、光谱法、比色法及电化学法。在这些方法中，酶联免疫法具有高的可靠性，但比较耗时且需要昂贵的酶标抗体试剂；磁共振成像法需要复杂的大型设备；光谱法往往需要合成复杂的探针分子且信号容易受到生物体系中其他物质的干扰；纳米金比色法实现了Aβ的快速测定，然而选择性仍然需要提高。电化学法由于具备快速、简便及易微型化等优点，研究者利用电化学方法和生物分子(包括抗体、蛋白及多肽)与Aβ的强相互作用在检测Aβ方面获得了良好的选择性和灵敏度[(a)YuY.Y.,ZhangL.,LiC.L.,SunX.Y.,TangD.Q.,ShiG.Y.,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53:12832-12835.(b)LiH.,XieH.N.,CaoY.,DingX.R.,YinY.M.,LiG.X.,Anal.Chem.2013,85:1047-1052.(c)YuY.Y.,SunX.Y.,TangD.Q.,LiC.L.,ZhangL.,NieD.X.,YinX.X.,ShiG.Y.,Biosens.Bioelectron.2015,68:115-121.(d)LiuL.,HeQ.G.,ZhaoF.,XiaN.,LiuH.J.,LiS.J.,LiuR.L.,ZhangH.,Biosens.Bioelectron.2014,51:208-212.(e)LiuL.,ZhaoF.,MaF.J.,ZhangL.P.,YangS.L.,XiaN.,Biosens.Bioelectron.2013,49:231-235.(f)RamaE.C.,González-GarcíaM.B.,Costa-GarcíaA.,Sensor.Actuat.B2014,201:567-571.]。但是由于在体液中Aβ寡聚体浓度较低及易发生聚集形成纤维的特性，使得在实际样品检测中有相当大的难度。实现体液(如脑脊髓液)中的Aβ寡聚体检测对AD的早期诊断和病情控制具有重要的意义。
选择性是生物传感器重要的性能指标。能够实现对蛋白高特异识别的分子除了昂贵的抗体外，还有核酸适配体。核酸适配体的作用本质是一段单链核酸分子折叠形成特定三维结构而与生物靶标特异性结合。筛选出的核酸适配体不仅具有抗体所具备的高特异性、高亲和力和高稳定性，且还具有便于化学修饰、功能化、大量低成本与可重复性合成等传统免疫学与化学分子识别无可比拟的优势。Aβ寡聚体的核酸适配体能够在Aβ单体及纤维体共存下与其特异性结合[TsukakoshiK.,AbeK.,SodeK.,IkebukuroK.,Anal.Chem.2012,84:5542-5547.]。核酸适配体的成功筛选为选择性检测Aβ寡聚体提供了一种可能。另外，纳米材料的可控构筑将为提高测试的灵敏性提供契机。
本方法利用核酸适配体对目标分子的高特异性结合，设计构建抗体和核酸适配体夹心型类免疫电化学传感器；进而利用纳米材料的优异性能，引入电化学信号并实现信号的放大；将其应用于脑脊髓液中标志物Aβ寡聚体的测定，促进AD的早期诊断。目前未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器，实现AD体液中标志物分子Aβ寡聚体的高灵敏和高选择性检测。另一目的在于提供其制备方法。
为实现本发明目的，本发明以核酸适配体作为识别基团，硫堇作为标记基团，金纳米粒子作为信号放大基团，将金纳米粒子与巯基修饰的核酸适配体及硫堇共同作用形成稳定的纳米共轭物；同时在羧基化氧化石墨烯修饰的电极表面进行抗体固定，识别Aβ寡聚体后进一步结合核酸适配体修饰的金纳米粒子共轭物，形成夹心型类免疫传感器，通过硫堇的电化学信号实现对Aβ寡聚体的测定。
所述用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器具体通过如下方法制备而成：
1、核酸适配体
选用与Aβ寡聚体具有强结合能力的核酸适配体，其序列为：GCCTGTGTTGGGGCGGGTGCG，并进行5'SHC6的修饰。
2、制备AuNPs溶液：将柠檬酸溶液加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，搅拌反应，然后冷却到室温得AuNPs溶液，放置在冰箱中备用。取制备好的AuNPs和硫堇溶液混合，室温下搅拌、离心，取下层，用培养液溶解；最后加入上述核酸适配体，在室温搅拌下反应，经离心、洗涤、溶解，即得到核酸适配体和硫堇共同修饰的AuNPs共轭物。
柠檬酸与HAuCl4·4H2O的摩尔比为2：1；AuNPs和硫堇溶液的体积/摩尔比为7:0.22mL/mM；核酸适配体在溶液中的浓度为0.9μM。
3、氧化石墨烯的合成及羧基功能化
采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯：(1)低温反应阶段，在0-4℃冰浴中，加入浓硫酸，再加入石墨粉及硝酸钠，搅拌反应后从冰浴中取出，10-20℃条件下，缓慢加入高锰酸钾并持续搅拌反应；(2)中温反应阶段，将上述溶液移到37-40℃的水浴中，加入去离子水，继续搅拌，反应停止后冷却到室温；(3)将混合溶液移入到约90-95℃水浴中，在搅拌的条件下继续反应，随后加入去离子水终止反应；再加入H2O2，搅拌条件下反应；最后加入HCl，经洗涤、真空干燥后即得到氧化石墨烯固体。
浓硫酸、石墨粉、硝酸钠和高锰酸钾的摩尔比为1:0.20:0.014:0.045。
4、取上述制备好的氧化石墨烯固体溶于超纯水中配制成溶液，随后向其中加入NaOH和一氯乙酸，在超声波条件下进行反应，使氧化石墨烯表面的羟基和环氧基变成羧基，经过滤、洗涤、真空干燥、称量、再溶解，得到羧基化的氧化石墨烯溶液。
羧基化的氧化石墨烯溶液浓度优选0.5mg/mL。
5、电化学传感器的构筑：(1)通过滴涂的方式将羧基化的氧化石墨烯修饰到玻碳电极上，在红外灯下烤干，作为基质材料；(2)将该电极在酰胺键活化试剂NHS/EDC中活化，并用去离子水洗涤，(NHS/EDC摩尔比为1:15，浓度分别为2mM和30mM)；(3)然后将该电极浸入到抗体溶液中反应，接上抗体，接着用PBS缓冲溶液洗涤，除去表面物理吸附的物质；(4)用牛血清蛋白封闭溶液进行处理，消除非特异性结合的影响和封闭其余的活性位点；(5)将电极浸入到不同浓度的Aβ寡聚体溶液中，通过抗体与抗原的特异性结合识别Aβ寡聚体；(6)将该电极放入含有上述制备的AuNPs共轭物的溶液中培养，形成“三明治”型的类免疫传感器。
所述抗体溶液的最佳浓度为10μg/mL。NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益的效果：
(1)本发明类免疫传感器具有良好的选择性，在Aβ单体和纤维体等形式存在下能够选择性测定Aβ寡聚体，特异性好、选择性高，这是由抗体的特异识别作用和核酸适配体的高结合能力决定的。
(2)本发明类免疫传感器结构中用核酸适配体替代传统免疫传感器中的二抗分子，从而避免使用二抗分子昂贵的酶标抗体试剂。
(3)本发明利用纳米材料的信号放大作用，提高了灵敏度，检测限为45nM，可用于AD脑脊髓液中的Aβ寡聚体的测定，促进AD的早期诊断。与传统免疫传感器相比，具有制备简单及避免使用酶标抗体试剂的特点，具有临床应用价值。
附图说明
图1是本发明原理图。
图2是本发明类免疫传感器制备过程中的交流阻抗图谱，图中，a为裸玻碳电极，b为氧化石墨烯修饰后的电极，c为酰胺键活化试剂修饰后的电极，d为抗体修饰后的电极，e为识别Aβ寡聚体后的电极，f为进一步连接AuNPs共轭基团后的修饰电极。
图3是本发明类免疫传感器对不同浓度Aβ寡聚体的响应曲线图。
图4是本发明类免疫传感器的选择性柱状图，图中，a-f分别代表Aβ1-42纤维体，Aβ1-42单体，Aβ1-40纤维体，Aβ1-40单体，Aβ1-42/Aβ1-40寡聚体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1检测Aβ寡聚体的类免疫生物传感器的制备方法
(1)核酸适配体和硫堇在AuNPs上的共轭结合
选用与Aβ寡聚体具有强结合能力的核酸适配体，其序列为：GCCTGTGTTGGGGCGGGTGCG，并进行5'SHC6的修饰。
制备直径为20nm的AuNPs溶液：在快速搅拌的条件下将3.75mL1％(质量百分比)的柠檬酸钠溶液加入到沸腾的250mL0.01％(质量百分比)HAuCl4·4H2O溶液中，观察到溶液的颜色在2min之内会由浅黄色变成深紫色。保持混合溶液持续沸腾并搅拌15min，冷却到室温，即可获得AuNPs溶液，放置在4℃的冰箱中备用。然后，将制备好的7mLAuNPs和2mL1mM的硫堇溶液混合，室温下搅拌24h，离心(8000r/min，15min)，取下层，再用培养液溶解至5mL；最后加入45μL100μM的核酸适配体，在25℃搅拌的条件下反应5h，离心(8000r/min)15min、洗涤、溶解，即得到核酸适配体和硫堇共同修饰的AuNPs共轭物。
(2)氧化石墨烯的合成及羧基功能化
采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯：主要分为三个过程，(1)低温反应阶段，在低于4℃的烧杯中，加入46mL浓硫酸，再加入2g石墨粉及1g硝酸钠，搅拌1h后从冰浴中取出，维持温度不低于10℃，缓慢加入6g高锰酸钾并持续搅拌1h；(2)中温反应阶段，将上述溶液移到37℃的水浴中，加入160mL的去离子水，继续搅拌，反应停止后冷却到室温；(3)将混合溶液移入到约95℃水浴中，在搅拌的条件下反应30min，随后加入90mL去离子水终止反应；再加入30mL30％(质量百分比)的H2O2，搅拌条件下反应15min；最后加入180mL1％(质量百分比)HCl，洗涤、真空干燥后即得到氧化石墨烯固体。
取0.1mg上述制备好的氧化石墨烯固体溶于100mL超纯水中配制成1mg/mL溶液，随后向其中加入5.0gNaOH和4.0g一氯乙酸，超声波反应4h，使氧化石墨烯表面的羟基和环氧基变成羧基，过滤、洗涤、真空干燥、称量、再溶解，即得到0.5mg/mL羧基化的氧化石墨烯溶液。
(3)电化学传感器的构筑
Aβ寡聚体序列如非特别说明，均使用的是1-42氨基酸序列，选择性实验同时使用了1-42和1-40氨基酸序列。
电化学传感器的构筑过程具体如下：(1)通过滴涂的方式将10μL羧基化的氧化石墨烯修饰到玻碳电极上，在红外灯下烤干，作为基质材料；(2)在酰胺键活化试剂NHS/EDC(NHS/EDC摩尔比为1:15，浓度分别为2mM和30mM)中活化1h，并用二次去离子水洗涤；(3)将该电极浸入到10mg/mL抗体的溶液中，反应4h，接上抗体，接着用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤，除去表面物理吸附的物质；(4)用1％(质量百分比)的牛血清蛋白封闭溶液进行处理，以消除非特异性结合的影响和封闭其余的活性位点；(5)将电极浸入到不同浓度的Aβ寡聚体溶液中，通过抗体与抗原的特异性结合识别Aβ寡聚体；(6)将该电极放入含有共轭物的溶液中培养3h，形成“三明治”型的类免疫传感器。
应用例1对Aβ寡聚体的测定
将此类免疫传感器转移至0.1MPBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，利用微分脉冲伏安法测定硫堇的电化学信号。测定采用三电极***：修饰的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极。进一步优化实验条件，包括抗体的浓度(10μg/mL)、传感器与Aβ寡聚体的孵育时间(60min)及与AuNPs共轭物的孵育时间(3h)。在优化的实验条件下，根据硫堇的峰电流和Aβ寡聚体浓度建立工作曲线。该峰电流与Aβ寡聚体的浓度在0.2μM到20μM的范围内成正比，其线性方程为Ipa(μA)＝4.738+0.059C(μM)，相关系数为0.990，检测限为45nM。
应用例2本发明电化学传感器性能考察
为了研究本发明传感器的稳定性，分别采用7根电极，使用同样的方式同时构筑电化学传感器，测定同浓度的Aβ寡聚体。得到7次测定结果，其相对标准偏差为3.28％。说明该传感器具有好的重现性。此外，还对电化学传感器的稳定性进行了考察。将该传感器在4℃储存48h之后，测定得到的峰电流为最初电流的89.58％，这进一步说明了构筑的生物传感器具有好的稳定性。
当Aβ纤维体及Aβ单体存在时，与Aβ寡聚体相比峰电流较小，这主要是由于抗体与Aβ寡聚体特异性结合，不结合纤维体和单体，所以不会产生电化学信号的变化。从而说明了此类免疫传感器有很高的选择性。
应用例3脑脊髓液中Aβ寡聚体的测定
按照人工合成脑脊髓液的方法进行配置：150mMNaCl、3.0mMKCl、1.4mMCaCl2·2H2O、0.8mMMgCl2·6H2O、1mM磷酸盐组成。采用加标回收的方法，加入不同浓度的标准样品，进行分析。得到加标回收率为90.00％-108.45％，此结果基本符合要求。由此说明该方法对于实际样品中Aβ寡聚体的测定具有潜在的应用价值。
表1脑脊髓液中Aβ寡聚体的加标回收实验
。

Claims (6)

1.用于检测β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，通过如下方法实现：
(1)、选用核酸适配体
选用与Aβ寡聚体具有强结合能力的核酸适配体，其序列为：GCCTGTGTTGGGGCGGGTGCG，并进行5'SHC6的修饰；
(2)、制备AuNPs溶液：将柠檬酸溶液加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，搅拌反应，然后冷却到室温，得AuNPs溶液，放置在冰箱中备用；取制备好的AuNPs和硫堇溶液混合，室温下搅拌，离心，取下层，用培养液溶解；最后加入上述核酸适配体，在室温搅拌下反应，经离心、洗涤、溶解，即得到核酸适配体和硫堇共同修饰的AuNPs共轭物；
(3)、氧化石墨烯的合成及羧基功能化
采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯：A、低温反应阶段，在0-4℃冰浴中，加入浓硫酸，再加入石墨粉及硝酸钠，搅拌反应后从冰浴中取出，10-20℃条件下，缓慢加入高锰酸钾并持续搅拌反应；B、中温反应阶段，将上述溶液移到37-40℃的水浴中，加入去离子水，继续搅拌，反应停止后冷却到室温；C、将混合溶液移入到约90-95℃水浴中，在搅拌的条件下继续反应，随后加入去离子水终止反应；再加入H2O2，搅拌条件下反应；最后加入HCl，经洗涤、真空干燥后即得到氧化石墨烯固体；
(4)、取上述制备好的氧化石墨烯固体溶于超纯水中配制成溶液，随后向其中加入NaOH和一氯乙酸，在超声波条件下进行反应，使氧化石墨烯表面的羟基和环氧基变成羧基，经过滤、洗涤、真空干燥、称量、再溶解，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；
(5)、电化学传感器的构筑：A、通过滴涂的方式将羧基化的氧化石墨烯修饰到玻碳电极上，在红外灯下烤干，作为基质材料；B、将该电极在酰胺键活化试剂NHS/EDC中活化，并用去离子水洗涤；C、然后将该电极浸入到抗体溶液中反应，接上抗体，接着用PBS缓冲溶液洗涤，除去表面物理吸附的物质；D、用牛血清蛋白封闭溶液进行处理，消除非特异性结合的影响和封闭其余的活性位点；E、将电极浸入到不同浓度的Aβ寡聚体溶液中，通过抗体与抗原的特异性结合识别Aβ寡聚体；F、将该电极放入含有上述制备的AuNPs共轭物的溶液中培养，形成“三明治”型的类免疫传感器。
2.如权利要求1所述的用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，柠檬酸与HAuCl4·4H2O的摩尔比为2：1；AuNPs和硫堇溶液的体积/摩尔比为7:0.22mL/mM；核酸适配体在溶液中的浓度为0.9μM。
3.如权利要求1所述的用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，浓硫酸、石墨粉、硝酸钠和高锰酸钾的摩尔比为1:0.20:0.014:0.045。
4.如权利要求1所述的用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，NHS/EDC摩尔比为1:15。
5.如权利要求1所述的用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，抗体溶液浓度为10μg/mL；步骤(4)中羧基化的氧化石墨烯溶液浓度为0.5mg/mL。
6.用于检测Aβ寡聚体的类免疫电化学传感器，其特征在于，通过权利要求1-5其中之一所述的方法制备而成。
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