CN108627590A - 一种测定依地酸二钠含量的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定依地酸二钠含量的高效液相色谱分析方法，所述方法包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，硫酸铁作为稀释剂，以添加有四丁基氯化铵的乙酸钠缓冲液‑乙腈为流动相，缓冲液‑乙腈的比例为4∶6；检测波长为350nm；流速为1.0ml/min；进样体积为25μl。采用本方法可将依地酸根离子进行有效分离并能准确定量。本方法专属性强、精密度好、准确度高，可快速准确的测定依地酸二钠的含量。

Description

一种测定依地酸二钠含量的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及食品、药品、保健品及化妆品等的检测方法，具体的说涉及一种测定依地酸二钠含量的高效液相色谱分析方法。

背景技术

依地酸二钠是一种强络合剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域(ClaudiaOviedo.EDTA：The chelating agent under environmental scrutiny[J]Quim.Nova，Vol.26，No.6，901-905，2003)。主要用作抗氧化增效剂、抗菌增效剂、水的软化剂和抗凝血剂(Raymond C Rowe，Paul J Sheskey and Sian C Owen.Handbook of PharmaceuticalExcipients.Fourth Edition.[M]London，Chicago：Pharmaceutical Press，2003)。据文献报道，依地酸二钠易与钙鏊合，长期大剂量使用或静脉滴注速度过快情况下，依地酸二钠可与血液及骨骼中的钙结合，产生鏊合物水溶液，导致低血钙症或骨钙流失，危害人身健康，存在安全隐患。为保证依地酸二钠浓度在安全及有效范围内，其浓度已作为相关产品质量控制的一个指标，且一般浓度范围为0.005％～0.1％(W/V)(郑俊民.药用辅料手册[M].北京：化学工业出版社，2005.263)。目前测定不同样品中依地酸二钠含量的方法有分光光度法(Clinckemaille，G.G.Determination of nitrilotriacetic acid andethylenediaminetetra-acetic acid in granular detergent formulations.[J]Analytica Chimica Acta，(1968).43，520-522.)、滴定法(Hamano.Sensitivespectrophotometric method for the determination of ethylenediaminetetraaceticacid in foods.[J]Analyst，(1993).118，909-912.)、气相色谱法(Nishikawa，Y.Determination of nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acidin environmental samples as their methyl ester derivatives by gaschromatography-mass spectrometry.[J]Journal of Chromatography A，(1995).690，109.)、离子色谱法(Ammann，A.A.Determination of strong binding chelators andtheir metal complexes by anion-exchange chromatography and inductivelycoupled plasma mass spectrometry.Journal of Chromatography A，(2002).947，205-216.)、毛细管电泳(Chen，Z.Confirmation of iron complex formation usingelectrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)and sample stacking foranalysis of iron polycarboxylate speciation by capillaryelectrophoresis.Microchemical Journal，(2007).86，94-101)及质谱法(XiaoqunWei.Rapid determination of trace EDTA in wines and beers by LC-MS/MS，[J]LWT-Food Science and Technology，(2016).72：485-491)。气相色谱、离子色谱、毛细管电泳及质谱均需要高昂费用的精密仪器，操作环境要求高等特点，不具有广泛普及性。用于依地酸二钠原料含量测定的方法仍为滴定法([M]中国药典2015年版，第四部，523-524，[M]欧洲药典7.5，1824-1825)，由于该法不能有效区分依地酸二钠络合物和其他络合物，滴定液配制繁琐操作费时，指示剂终点靠人眼判断易存在主观性，测定结果多有偏差。因此，需要寻找一种具有广泛适用性的测定依地酸二钠原料含量的方法，以弥补现有不足。为我国依地酸二钠的市场监管和企业质量控制提供技术支撑，不断促进我国药用辅料质量标准的提高，科学有效监控其利用现状，完善相关产品质量风险监控指标，进一步保障广大人民群众的饮食、用药等方面的安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种广泛普及性的可快速、准确测定依地酸二钠含量的高效液相色谱分析方法，实现快速准确定量分析依地酸二钠的含量，以弥补现有技术的不足，保证了依地酸二钠原料产品质量及辅料添加有依地酸二钠的相关产品的质量控制。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

一种测定依地酸二钠原料含量的高效液相色谱分析方法，采用反相高效液相色谱方法，具体色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料粒径为3～5μm，柱长150mm～300mm。

流动相：以(四丁基氯化铵2.8g+醋酸钠4.1g+990ml水溶解，冰醋酸调pH至4.0，加水稀释至1L，用0.45μm滤膜滤过)为A相，以[乙腈-A(6∶4)]为B相。

流速：0.8～1.2ml/min。

柱温：25～40℃。

检测波长：350nm±4nm。

进样量：10～50μl。

优选色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料粒径为5μm，柱长250mm，以(四丁基氯化铵2.8g+醋酸钠4.1g+990ml水溶解，冰醋酸调pH至4.0，加水稀释至1L，用0.45μm滤膜滤过)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为350nm，进样量为25μl，等度洗脱10min。

稀释剂：精称硫酸铁0.20g，用流动相A相溶解并稀释至1L，经0.45μm滤膜滤过即得。

对照品溶液制备：

对照品贮备液：精密称取EDTA二钠对照品适量至200ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

对照品溶液：精取对照品贮备液2ml至10ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。

供试品溶液

精取本品30mg，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精取2ml至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，即为供试品溶液。

有益效果

采用本发明所述高效液相色谱分析方法的条件，实现了依地酸二钠在色谱柱上的保留，监测并记录到依地酸络合物的洗脱色谱曲线。本方法的线性范围宽，为3～100μg/ml，且线性好(r＝1.000)；回收率高，平均回收率为102.8％；灵敏度高，检测限及定量限分别为12.5ng和40ng；重复性良好(n＝6)RSD为0.64％。采用本发明的方法可快速准确测定依地酸二钠原料的含量并适用于其他含有依地酸二钠的相关产品中依地酸二钠含量的测定，具有普遍适用性。

附图说明

附图1为空白溶液的液相色谱图

附图2为依地酸二钠对照品溶液的液相色谱图

附图3为含量测定线性范围

附图4为检测限

具体实施例

通过如下实施例对本发明作进一步的说明，但实施例并不局限于本发明的保护范围。

主要仪器及色谱条件：

安捷伦1260系列高效液相色谱仪；配置DAD紫外检测器，自动进样器，openlab CDS液相色谱工作站。

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

试剂与药品：

四丁基氯化铵(含量：≥97％；西格玛奥德里奇)，乙腈(色谱级，默克公司)冰醋酸(色谱级，美国天地有限公司)，EDTA二钠对照品(以EDTA二钠计，含量为90.5％，USP)，依地酸二钠原料(某公司，批号：160101、160102、160103)，其他试剂为国产分析纯。

实验中用水均为经millipore Q制备的纯化水。

对照品贮备液：精密称取EDTA二钠对照品适量至200ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

对照品溶液：精取对照品贮备液2ml至10ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。

供试品溶液

精取本品30mg，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精取2ml至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，即为供试品溶液。

流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：350nm；进样量：25μl；按照100％A 5min，10s内切换90％A并保持50s，10s内切换50％A并保持110s，10s内切换0％A并保持290s，10s内切换100％A并保持至36min结束程序，对空白溶剂、对照品和供试品分别进行检测，结果如附图1、2及3。标准品溶液峰面积平均值为196.9(n＝6)，RSD为0.29％，供试品溶液峰面积平均值分别为184.2、180.9及181.1(n＝6)，对应RSD为0.56％、0.88％及1.44％。

根据公式：

依地酸二钠含量(％)＝(待测品峰面积/标准品峰面积)*(标准品浓度/待测品浓度)*100％按照上述色谱条件进行如下实施例：

实施例1进样精密度

表1 同一份标准品溶液6次重复进样的峰面积

进样次数	1	2	3	4	5	6
							峰面积	196.1	196.7	196.6	195.9	195.5	196.4

同一份标准品溶液进样六次峰面积平均值为196.2，RSD为0.23％，结果表明本方法检测依地酸二钠含量精密度高。

实施例2线性关系试验

精取对照品贮备液适量，用稀释剂稀释制成系列浓度分别为3、6、15、30、60、75ug、100ug/ml线性试验用标准溶液，按本发明方法进样检测，对标准品溶液浓度(X)与峰面积(Y)进行数据回归分析，线性关系如图4所示，回归方程为Y＝6.5558x+0.8932，r＝1.0000。结果表明依地酸二钠在溶液浓度为3～100μg/ml范围内，峰面积与溶液浓度呈现良好线性关系。

实施例3检测限及定量限

取线性与范围项下浓度为30μg/ml的对照溶液系列稀释后进样检测，按信噪比约为3计算，

实施例4加样回收率试验

精称批号为160103的依地酸钠原料6份，各约30mg，置200ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，精取2ml至10.0容量瓶中，加对照品溶液定容至刻度。进样分析，记录峰面积，测得平均回收率为(n＝6)102.8％(RSD 1.42％)，结果表明该方法加样回收率良好。

实施例5重复性实验

精称批号为160103的依地酸钠原料6份，各约30mg，照供试品溶液制备方法制样，进样分析。按外标法计算每份供试品的含量，该批原料含量为100.1％(RSD为0.64％)，结果表明重复性良好。

实施例6依地酸二钠原料含量的测定及与滴定法测定含量结果的比较

精称三批原料约30mg，各2份，置200ml量瓶中，照供试品溶液制备方法制样，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图，采用外标法将标准品及供试品峰面积及浓度代入公式即可得依地酸二钠的含量，三批供试品含量平均值分别为(n＝4)100.1％、99.8％及100.2％，对应RSD为0.52％、0.51％及0.79％。根据中国药典2015年版第四部，精称三批原料药约0.4g，各2份，按步骤进行溶解和滴定。三批供试品含量平均值分别为(n＝2)99.4％、99.3％及99.5％。对两种方法所得数据进行统计学分析，P＝0.12，表明两种方法测定的结果差异不显著。结果表明，本方法的专属性强、灵敏度高、精密度好、可准确快速测定依地酸二钠的含量。

Claims (2)

1.一种采用高效液相色谱测定依地酸二钠含量的方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以[四丁基氯化铵(2.5～3.1g)+醋酸钠(3.6～4.5g)]+990ml水溶解，冰醋酸调pH至3.6～4.4，加水稀释至1L，用0.45μm滤膜滤过)为A相，以[乙腈-A(4∶6)～(8∶2)]为B相，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为350nm±4nm，进样量为10～50μl。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于流动相A相为1L水相中含四丁基氯化铵2.8g及醋酸钠4.1g，其pH值为4.0，流动相B相为乙腈与流动相A的混合溶液，乙腈与流动相A的混合比例为(6∶4)，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为350nm，进样量为25μl。