CN108610420A - 抗cd19的人源化抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从鼠源单克隆抗体制备得到的抗CD19的人源化抗体、包含该人源化抗体的嵌合抗原受体以及表达该人源化抗体的免疫细胞。本发明的人源化抗体不仅不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，其亲和力还优于鼠源抗体，具备优异的活性和安全性，从而为治疗表达CD19的肿瘤提供了一种新的手段。

Description

抗CD19的人源化抗体以及靶向CD19的免疫效应细胞
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗或诊断领域。更具体地，本发明涉及抗CD19的人源化抗体以及靶向CD19的免疫效应细胞。
背景技术
B细胞包括前B细胞(pre-B cell)、早期发育的B细胞(即：不成熟B细胞)、和成熟B细胞等，成熟B细胞通过末端分化成为浆细胞和恶性B细胞。大多数的前B急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏恶性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些非急性淋巴母细胞性白血病都高表达CD19(Nadler等人，J.Immunol.,131:244-250(1983)；Loken等人，Blood，70：1316-1324(1987))。在浆细胞上的CD19的表达进一步说明其可在不同的B细胞瘤例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏瘤上表达(Grossbard等，Br.J.Haematol,102:509-15(1998)；Treon等，Semin.Oncol,30:248-52(2003))。因此CD19被认为是多种血液肿瘤的靶标。
目前针对CD19的抗体主要是鼠源抗体(鼠抗)，如J Immunol.1987May 1；138(9):2793-9公开了鼠抗HD37、安进公司已上市的药物Blinatumomab等，但鼠抗具有较强的免疫原性，在临床应用中会引起人抗鼠抗体(HAMA)反应和抗抗体反应(AAR)等，导致半衰期缩短，易被清除，治疗效果减弱，严重的甚至威胁患者的人生命。
常用的降低鼠抗免疫原性的方法为将其进行人源化，如采用人源的框架区替换鼠的框架区，以降低异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。例如，CN102209556A公开了鼠抗HD37的一种人源化抗体，并宣称当VH(重链可变区)的91位采用苯基丙氨酸取代丝氨酸，会增加表达水平。
由于人源化的框架区有很多，因此如何筛选合适的框架区并高表达出人源的抗体、同时使得人源化改造后抗体的结合能力等得以保持，是人源化的技术难点。特别是，抗体人源化后，由于氨基酸序列的改变，通常使得肽链大小、电荷、疏水性、空间构象等发生改变，氢键的形成也与鼠源不同，从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象，因此，通常人源化后抗体的亲和力、特异性等与鼠抗相比均会降低10倍以上(Vahideh Ahmadzadeh等,Monoclonal antibodies in immunodiagnosis and immunotherapy,volume 33,number2,2014)。
因此，本领域急需人源化的抗体，其相比于鼠抗，能够具备相同、甚至更有的亲和力，并且不产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，从而具备更高的安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供抗CD19的人源化抗体以及靶向CD19的免疫效应细胞。
在第一方面，本发明提供一种针对人CD19的人源化抗体，所述人源化抗体与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力(EC50)小于10nM。
在优选的实施方式中，所述人源化抗体与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力(EC50)在1-10nM之间。
在具体的实施方式中，所述人源化抗体的轻链可变区的框架区如SEQ ID NO:1的1-23、39-53、61-92和102-111所示；和/或所述人源化抗体的重链可变区的框架区如SEQ IDNO:3的1-30、36-49、67-98和114-124所示。
在具体的实施方式中，所述抗体选自下组：
(a)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区或其变体；
(b)一种抗体，具有SEQ ID NO:3所示的重链可变区或其变体；
(c)一种抗体，具有(a)所述抗体的轻链可变区和(b)抗体所述的重链可变区；和
(d)一种抗体，与(a)～(c)中任一项所述的抗体竞争结合人CD19的人源化抗体。
在具体的实施方式中，(a)所述的变体具有SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ IDNO:13所示的LCDR2、和SEQ ID NO:14所示的LCDR3。
在具体的实施方式中，(a)所述的变体具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区。
在具体的实施方式中，(b)所述的变体具有SEQ ID NO:15所示的HCDR1、SEQ IDNO:16所示的HCDR2、SEQ ID NO:11所示的HCDR3。
在具体的实施方式中，(b)所述抗体的变体具有SEQ ID NO:5所示的重链可变区。
在具体的实施方式中，所述人源化抗体选自：
(a)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:3所示的重链可变区；
(b)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区；
(c)一种抗体，具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ ID NO:3所示的重链可变区；和
(d)一种抗体，具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区。
在优选的实施方式中，所述人源化抗体的重链可变区的91位不是苯丙氨酸。
在第二方面，本发明提供编码本发明第一方面所述的抗体的核苷酸序列。
在第三方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明第二方面所述的核苷酸序列。
在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第三方面所述的表达载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的核苷酸序列。
在第五方面，本发明提供本发明第一方面所述的人源化抗体的用途，用于制备特异性靶向表达CD19的肿瘤细胞的靶向性药物、抗体药物偶联物或多功能抗体；或
用于制备诊断表达CD19的肿瘤的试剂；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
在第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包含胞外域、跨膜域及胞内信号域，所述胞外域包含本发明第一方面所述的抗体，该抗体优选单链抗体或结构域抗体。
在具体的实施方式中，所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和初级信号域。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括铰链域。
在具体的实施方式中，所述的跨膜域选自TCR的alpha、beta、zeta链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5,CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；和/或
所述共刺激信号域选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2CSLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和/或
所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d，和CD3ζ，
更佳的，
所述的跨膜域选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；和/或
所述共刺激信号域选自CD137，CD134，CD28和OX40；和/或
所述初级信号域选自CD3ζ，
最优的，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区：
本发明第一方面所述的抗体、CD8和CD3ζ；
本发明第一方面所述的抗体、CD8、CD137和CD3ζ；
本发明第一方面所述的抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或
本发明第一方面所述的抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
在具体的实施方式中，
所述胞外域具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
所述跨膜域选自SEQID NO：27所示的CD28跨膜域、SEQ ID NO：33所示的CD8跨膜域；
所述共刺激信号域选自SEQ ID NO：29所示的CD28胞内域和SEQ ID NO：35所示的CD137的胞内域或其混合。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体选自：
嵌合抗原受体一，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQID NO：27所示的跨膜域、SEQ ID NO：29所示的共刺激信号域、以及SEQ ID NO：31所示的初级信号域(huHD37-28Z)；
嵌合抗原受体二，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQ ID NO：33所示的跨膜域、SEQ ID NO：35所示的共刺激信号域、以及SEQ ID NO：31所示的初级信号域(huHD37-BBZ)；或
嵌合抗原受体三，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQ ID NO：27所示的跨膜域、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：35所示的共刺激信号域、以及SEQID NO：31所示的初级信号域(huHD37-28BBZ)。
在第七方面，本发明提供编码本发明第六方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在第八方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明第七方面所述的核苷酸序列。
在第九方面，本发明提供一种病毒，所述的病毒包含本发明第八方面所述的表达载体。
在第十方面，本发明提供本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、或第七方面所述的核苷酸序列、或第八方面所述的表达载体、或第九方面所述的病毒的用途，用于制备靶向表达CD19的肿瘤细胞的基因修饰的免疫细胞。
在第十一方面，本发明提供一种基因修饰的免疫细胞，其转导有本发明第七方面所述的核苷酸序列，或本发明第八方面所述的表达载体或本发明第九方面所述的病毒；或其表达本发明第六方面所述的嵌合抗原受体。
在具体的实施方式中，本发明的基因修饰的免疫细胞还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；
较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；
较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；
较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。
在第十二方面，本发明提供本发明第十一方面所述的基因修饰的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制表达CD19的肿瘤的药物。
在第十三方面，本发明提供一种多功能免疫辍合物，所述的多功能免疫辍合物包括：
本发明第一方面所述的抗体；以及
与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：靶向除CD19以外的其他肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。
在具体的实施方式中，所述的靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或
所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素；较佳地，所述的细胞因子包括：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。
在优选的实施方式中，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
在具体的实施方式中，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体，其与本发明第一方面所述的抗体形成T细胞参与的双功能抗体，优选的，所述结合T细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体。
在具体的实施方式中，本发明的多功能免疫辍合物是融合多肽，本发明第一方面所述的抗体以及与之连接的功能性分子之间还包括连接肽。
在第十四方面，本发明还提供编码本发明第十三方面所述的多功能免疫辍合物的核苷酸序列。
在第十五方面，本发明提供本发明第十三方面所述的多功能免疫辍合物的用途，用于制备抗肿瘤药物，或
用于制备诊断表达CD19的肿瘤的试剂；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
在第十六方面，本发明提供一种药物组合物，其包括：
本发明第一方面所述的抗体或编码该抗体的核苷酸序列；或
本发明第六方面所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列；或
本发明第十一方面所述的基因修饰的免疫细胞；或
本发明第十三方面所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核苷酸序列。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1比较了HD37、人抗体可变区、人抗体可变区/连接区、及人源化抗体huHD37的氨基酸序列；
图2显示了SEC分析huHD37(ScFv_Fc)的聚集情况；
图3显示了还原条件下的纯化的huHD37的SDS PAGE凝胶电泳；
图4显示了通过流式细胞术测定的纯化HD37，人源化抗体huHD37与K562-CD19和K562细胞结合的情况；
图5显示了HD37与人源化的抗体huHD37，ScFv与人IgG1Fc部分嵌合以后与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力；
图6比较了6B3、8E5及人源化抗体huHD37的氨基酸序列；
图7显示了SEC分析克隆6B3(scFv_Fc)的聚集情况；
图8显示了SEC分析克隆8E3(scFv_Fc)的聚集情况；
图9显示了6B3,8E3(scFv_Fc)与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力；
图10显示了huHD37CAR的结构示意图；
图11显示了huHD37CAR+T及Mock+T细胞阳性率；
图12显示了CD19抗原表位在肿瘤细胞系上的暴露情况；及
图13比较了huHD37二代及四代CAR T细胞的体外活性。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现根据本发明从鼠源单克隆抗体制备得到的结合CD19的人源化抗体不仅不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，其亲和力还优于鼠抗，从而具备优异的活性和安全性。在此基础上完成了本发明。
为了更易于理解本发明，首先定义一些术语。
术语“CD19”包括但不限于人CD19的变体、同种型和物种同源物。在某些情况下，本发明的人源化抗体可与人以外的物种的CD19交叉反应。在某些情况下，抗体可以完全对一种或多种人CD19蛋白特异并且可以表现出物种或其它类型的非人交叉反应。示例性的人CD19的完整氨基酸序列具有SwissPort登录号P15391(SEQ ID NO：18)。CD19也被称为B细胞表面抗原B4，B细胞抗原CD19、CD19抗原或Leu-12。人CD19被Entrez Gene称为Gene ID：930，被HGNC称为HGNC：1633。CD19可以被称为CD19的基因编码。本文中“人CD19”的使用涵盖了人CD19的所有已知的或仍未被发现的等位基因和多态形式。
术语“抗体”可以是完整的免疫球蛋白分子，包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体，未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所诉的衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL包括互补性决定区(CDR)和构架区(FR)。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的多种细胞(如效应细胞)和经典补体***的第一成分(C1q)。
术语“抗体”还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段、单链抗体(scFv)、结构域抗体，二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体。由于抗体可以多种方式修饰，术语“抗体”应理解为还包括任何具有抗体结合结构域或与之同源的结合结构域的多肽或蛋白。术语“Fab”包括包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。
本文使用的术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接成DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
本文中的术语“人源化抗体”是指其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人的框架序列上.在人的框架序列和源自另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列中也可以进行额外的框架区修饰。
如果抗体的可变框架区获得自使用人种系免疫球蛋白基因的***，则本文中使用的人源化抗体包括这样的重链或轻链可变框架区，所述可变框架区是特定的人种系序列(人基因)的“产物”或“源自”所述特定的人种系序列。此类***包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。可以通过比较人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列，来鉴别包括这样的重链或轻链可变框架区的人源化抗体，所述可变框架区是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”所述人中西免疫球蛋白序列。包括是特定的人种系免疫球蛋白序列的“产物”的重链或轻链可变框架区的人源化抗体具有氨基酸序列与特定的人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区100％相同的重链或轻链可变框架区。由于例如天然存在的体细胞突变或有意导入的定点突变，相比特定种系序列的重链或轻链可变框架区，包括“源自”所述特定的人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区的人源化抗体可含有氨基酸差异。然而，通常选定的人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因的重链或轻链可变框架区编码的氨基酸序列至少90％相同，并且，当相比其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)时，含有鉴别所述人源化抗体是源自人的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与由种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列克优选至少95％，更优选至少96％，最优选至少97％，特别是至少98％，最特别是至少99％相同。通常，源自特定的人种系序列的人源化抗提的重链或轻链可变框架区将展现出与由人种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列不超过10个、优选不超过5个、或者甚至更优选不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
术语“亲本抗体”包括即将进行修饰产生其他人源化抗体的鼠抗或人源化抗体。
本文中使用的术语“变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。在具体的实施方式中，本文中的变体抗体序列具有与亲本抗体序列至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、最优选至少约99％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其地氨基酸序列。术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、添加和/或缺失，“氨基酸取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指94位的精氨酸被赖氨酸替换，本文中使用的“氨基酸***”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。
本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、***和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的急性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。
本文中使用的术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”包括细胞介导的反应，其中，表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体后，引起靶细胞裂解。在各个方面，增强ADCC效应子功能可以意指增强的效价或增强的功效。实验背景中使用的“效价”意指当观察特定的治疗功效EC50时抗体的浓度(半最大有效浓度)。实验背景中使用的“功效”意指饱和水平的抗体的最大可能的效应子功能。
本文中使用的术语“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”包括细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体后引起靶细胞的吞噬作用。
本文中使用的术语“CDC”或“补体依赖性细胞毒性”包括这样的反应，其中，一种或多种补体蛋白质组分识别靶细胞上结合的抗体，之后导致靶细胞的裂解。
本文中使用的术语“效应子功能”包括由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用导致的生物化学事件。效应子功能包括FcγR介导的效应子功能，例如ADCC和ADCP，和补体介导的效应子功能，例如CDC。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指：包含能够结合抗原的胞外域、跨膜域和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)，胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，包含初级信号域，还可以包括源自下文定义的刺激分子的功能信号传导结构域(即共刺激信号域)。胞内信号域产生可以促进CAR的细胞(例如CAR T细胞)的免疫效应子功能的信号，免疫效应子功能的例子，例如在CART细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
术语“初级信号域”以刺激性方式调节TCR复合物的初始活化。一方面，初级信号域由例如TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合而引发，由此介导T细胞反应(包括但不限于，增殖、活化、分化等)。以刺激性方式起作用的初级信号域可以包含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中尤其有用的包含ITAM的初级信号域的例子包括但不限于，源自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d的序列，在特例的本发明CAR中，在任何一个或多个本发明CAR中胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如CD3ξ的初级信号域。
术语“共刺激信号域”指“共刺激分子”，为T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于，增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
在本发明中，一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自刺激分子的功能信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基酸(ND端)包含可选的前导序列。一方面，CAR在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。
本文中术语“CD3ξ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ξ结构域”定义为来自ξ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，ξ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、其功能性直向同源物—来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
本文中术语“4-1BB”指TNFR超家族的成员，其具有GenBank Acc.No.AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank ACC.No.AAA62478.2的氨基酸序列214-255，或来自非分类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO：35中提供的序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
本文中的术语“干扰素”是指全长干扰素，或者基本保持全长野生型干扰素的生物活性(例如保持全长至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、98％或99％)的干扰素片段(截断的干扰素)或干扰素突变体。干扰素包括I型干扰素(例如，干扰素α和干扰素β)和II型干扰素(例如，干扰素γ)。
本发明的抗体或其变体可以被应用于制备各种靶向性抗肿瘤药物以及诊断肿瘤的药物，特别是应用于制备靶向CD19的免疫效应细胞。
抗CD19的人源化抗体
本发明涉及的人源化抗体母本抗体是HD37，是鼠IgG1(Leukocyte Typing II，pp391-402)。
考虑到这些重链和轻链可变区序列各自可以结合人CD19，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列来产生本发明的抗人CD19的结合分子。例如，本发明的结合人CD19的人源化抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:1或7所示，重链可变区如SEQ ID NO:3或5所示。在具体的实施方式中，本发明的结合人CD19的人源化抗体可以是：具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:3所示的重链可变区的抗体；或具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区的抗体；或具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ IDNO:3所示的重链可变区的抗体；或具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区的抗体。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的抗体或其片段的变体。因而本发明提供了抗体或其片段，具有与重链或轻链的可变区序列至少80％相同的重链和/或轻链可变区。优选的，重链和/或轻链可变区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸序列同一性。本文中关于氨基酸序列的同一性或序列中与结合人CD19的人源化抗体或其片段相同的氨基酸残基的百分比。因而，可以通过通常用于比较两条多肽的氨基酸位置相似性的标准方法，来确定序列同一性。使用计算机程序例如BLAST或FASTA，比对两条多肽各自氨基酸的最佳匹配(沿一条或两条序列的全长或者沿一条或两条序列预定的部分)。程序提供了默认的开放罚分和默认的空位罚分，评分矩阵例如PAM250(标准评分矩阵；参见Dayhoff等，in Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，第三期增补(1978))可与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性可计算为：相同匹配的总数乘以100，再除以匹配跨度中较长序列的总长度和为了比对两条序列向较长序列中倒入的空位数。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体片段，所述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fd、dAb、F(ab’)2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三链抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选的片段是scFv、双特异性单链Fv二聚体和双抗体。本发明还提供了结合人CD19的全长人源化抗体。
抗人CD19的人源化抗体特性
评估抗体例如人CD19的人源化抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例中。为了评估结合，可以使用稳定转染了CD19的K562细胞并应用流式细胞分析测定EC50。在具体的实施方式中，本发明的人源化抗体与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力(EC50)小于100nM，优选小于10nM，更优选在1-10nM之间。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码结合人CD19的人源化抗体和其片段分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。
优选的本发明核酸分子是编码选自SEQ ID NO：2、8的轻链可变区，和/或选自SEQID NO：4、6的重链可变区的那些。为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外***中表达的那些。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的。可用于本发明中来表达抗体。
含有抗CD19抗体的嵌合抗原受体T细胞
一方面，本发明提供多种嵌合抗原受体(CAR)，其中包含经工程化而增强结合CD19蛋白的抗体或抗体片段。一方面，本发明提供经工程化而表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。一方面，用CAR转化细胞，CAR在细胞表面表达。一些实施案例中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞)。在一些实施案例中，病毒载体是慢病毒载体。一些实施方案中，细胞可以稳定地表达CAR。
一方面，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。一方面，该抗体片段是功能性的，由此，与其所来自的IgG抗体相比，其保持等价的亲和结合力，例如其以相当的功效结合相同抗原。一方面，该抗体片段是功能性的，由此其提供生物化学反应，所述反应可以包括但不限于激活免疫反应、抑制从其靶抗原的信号传导起始、抑制激酶活性等。一方面，CAR的抗CD19抗原结合结构域是，相对于其所源自的鼠序列scFv被人源化的scFv抗体片段。
一方面，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和胞内信号传导分子组合在一起。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3ξ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。一方面，本发明提供经工程化而表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。一方面，CAR的抗原结合结构域包含人源化的抗CD19抗体片段，其包含scFV。因此，本发明提供，经工程化导入T细胞中的，包含人源化抗CD19结合结构域的CD19-CAR，以及将其用于过继免疫治疗的方法。
一方面，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其选择CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ξ信号结构域，及其任何组合。一方面，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其来自一个或多个非CD137(4-1BB)或CD28的共刺激分子。
一方面，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和胞内信号传导分子组合在一起的同时增加了IFNβ表达元件。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3ξ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。一方面，本发明提供经工程化而表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。一方面，CAR的抗原结合结构域包含人源化的抗CD19抗体片段，其包含scFV。另一方面，在CAR终止信号末端反向添加了IFNβ表达元件，包括6个重复的NFAT-AP-1转录调控结合片段NFAT、IL-2minipromoter、IFNb cDNA序列以及终止信号PA2因此，本发明提供，经工程化导入T细胞中的，包含人源化抗CD19结合结构域的CD19-CAR和IFNβ，以及将其用于过继免疫治疗的方法。
本发明的优点：
1.本发明的抗体与鼠抗相比，不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)；
2.本发明的抗体不会因被抗抗体中和而被快速清除，并且具有免疫效应功能，如ADCC和CDC作用；
3.与鼠抗相比，本发明的抗体的亲和力不仅没有降低，还略优于鼠抗；和
4.本发明的抗体聚集度高、产率好、易于生产和纯化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.抗CD19抗体HD37的人源化抗体huHD37的制备
本实施例采用鼠抗HD37(J Immunol.1987May 1；138(9):2793-9)为母本抗体，鼠抗HD37具有SEQ ID NO:19所示的轻链可变区及SEQ ID NO:20所示的重链可变区，综合Kabat、Chothia以及IMGT三种抗体CDR区的命名方案，确定抗体轻链与重链的六个CDR区序列：
轻链可变区(SEQ ID NO:19)，CDR区以下划线标出。
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKR
重链可变区(SEQ ID NO:20)CDR区以下划线标出
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS
a.抗体模板的选择
选取来自IMGT数据库的germline序列IGHV1-69*01(SEQ ID NO:43)+IGHJ6*01(SEQ ID NO:44)作为HD37重链的抗体模板，选取来自IMGT数据库的germline序列IGKV7-3*01(SEQ ID NO:45)+IGKJ1*01(SEQ ID NO:46)作为HD37轻链的抗体模板
b.CDR移植
将HD37抗体的轻链CDR区替换掉抗体模板IGKV7-3*01+IGKJ1*01的CDR区，构成人源化抗体huHD37的轻链可变区(氨基酸序列见SEQ ID NO:1)。将HD37抗体的重链CDR区替换掉抗体模板IGHV1-69*01+IGHJ6*01的CDR区，并将IGHV1-69*01(SEQ ID NO:43)中的第27位甘氨酸突变成酪氨酸，构成人源化抗体huHD37的重链可变区(氨基酸序列见SEQ ID NO:3)。
huHD37轻链可变区与HD37、VK7-3*01、VK7-3*01/J1*01的序列比对，以及huHD37重链可变区与HD37、VH1_69*01、VH1_69*01/J1*01的序列比对如图1所示。
c.表达和纯化人源化的抗体scFv_Fc形式
根据人源化的抗体huHD37的轻链可变区(SEQ ID NO：1)，重链可变区(SEQ ID NO：3)，设计并合成轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和重链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO：4)。
分别针对轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和重链核苷酸序列(SEQ ID NO：4)设计引物，引入由15个柔性氨基酸GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：42)组成的linker连接组成scFv(SEQ ID NO：21)，其中，1-124位为重链可变区，140-251位为轻链可变区；在VH上游引入合适的酶切位点和保护碱基，在VL的下游引入合适的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并纯化回收。酶切后连接入含有人Fc段的真核表达载体V152中(购自上海锐劲生物技术有限公司)。
d.通过293Fectin瞬时转染至293F细胞中并表达
1)转染前一天，接种6-7×105/ml 293F细胞于125ml培养瓶中；转染当天，调整3×107细胞于28ml FreeStyleTM 293expression medium；
2)用Opti-MEM I稀释30ug DNA，终体积1ml,充分混匀；用Opti-MEM I稀释60ul293fectinTM,终体积1ml，充分混匀；室温孵育5分钟，将稀释好的DNA与293fectinTM混合；室温孵育20分钟，将2ml DNA-293fectin复合物加入28ml细胞中，37度，8％CO2，125rpm培养5～7天，收取上清，得到lipid-DNA复合物。
3)离心收集293F培养上清，通过0.45um滤器过滤，通过rProtein A柱亲和层析，得到人源化的抗体huHD37。
4)通过SEC分析抗体的聚集情况，结果如图2所示，单体形式的抗体占比为94.3％，单体形式的抗体占比显著优于常规人源化抗体，与鼠抗HD37相比，聚集度也显著降低。
5)经超滤浓缩后，通过SDS PAGE对得到的抗体进行定量和定性分析。如图3所示，在还原条件下，50Kd大小处有一单一条带即为目的蛋白，产率为66ug/ml(产率＝最终产物质量/转染体积)，远高于CN102209556A的人源化抗体的产率5-25mg/L。
e.人源化抗体huHD37的结合特性
使用稳定表达人CD19的K562细胞(K562-CD19)和K562，收集细胞，用完全生长培养基洗涤细胞，并以约1-5×105个细胞/孔将细胞铺到U型底微量滴定板中。在冰上将梯度稀释的huHD37的scFv_Fc融合抗体与K562-CD19/K562孵育30分钟,其后与FITC标记的抗人Fc做为第二抗体孵育。两次洗涤步骤之后，使用Guava easyCyteTM HT System仪器分析，使用GraphPad Prism处理实验数据，得到EC50。图4显示了HD37与huHD37与K562-CD19以及K562细胞的结合情况。结果表明人源化的huHD37与母本抗体HD37特异性的结合稳定转染了CD19的K562细胞而不结合K562细胞。图5显示了HD37以及人源化的huHD37的ScFv与人IgG1Fc部分嵌合以后与稳定转染了人CD19的HEK293细胞的结合相对亲和力(EC50)。与母本HD37相比，人源化的抗体huHD37亲和力有所提高。
实施例2.huHD37的改造
本实施例以huHD37为亲本抗体，采用噬菌体展示的方法来对huHD37进行改造。基于人源化抗体huHD37的噬菌体文库的构建保留了轻链以及重链的CDR3区域，通过简并引物，分别随机化轻链的CDR1和CDR2或者重链的CDR1和CDR2构建了两个噬菌体文库。引物信息如下表所示。
No. Name Sequence Length
1 LMF CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 26
2 C37H1R CACTCCAGGCCCTGGCCGGGGGCCTGCCGCACCCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNGAAGGTGTAGCCGCTGGCCT 73
3 C37H2F ccggccagggcctggagtggatgggcNNKATCNNKCCCNNKNNKGGCNNKACCNNKtacaacggcaagttcaagggc 77
4 FdR GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG 30
5 C37L1R CTGGCCGGGCTTCTGCTGGTACCAMNNMNNGTAMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNGCTMNNGCTGGCCTTGCAGG 80
6 C37L2F accagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacNNKNNKAGCNNKCTGNNKagcggcgtgcccgcccggttc 80
2.1huHD37突变体的构建：
首先基于抗体huHD37(scFv)(氨基酸序列见SEQ ID NO:21，核苷酸序列见SEQ IDNO:22)构建模板质粒。对于轻链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF和C37L1R，PCR扩增片段1；使用引物C37L2F和FdR，PCR扩增片段2；然后通过搭桥PCR连接片段1和片段2得到还有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为1.76E+9。对于重链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF和C37H1R，PCR扩增片段3；使用引物C37H2F和FdR，PCR扩增片段4；然后通过搭桥PCR连接片段3和片段4得到还有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为1.9E+9。
噬菌体文库的筛选。收集K562-CD19细胞，PBS清洗细胞两次，将1E+7个细胞重悬于2ml 4％MPBS(4g脱脂奶粉溶于100ml PBS中)，加入1ml(1013个噬菌体)噬菌体文库于细胞中，放在一个旋转仪上，缓慢旋转1个半小时，然后静置半个小时。随后将非特异性的噬菌体洗掉，将结合的噬菌体洗脱下来并感染对数生长期的大肠杆菌TG1。扩大培养洗脱下来得噬菌体并使用PEG/NaCl沉淀纯化扩大后的噬菌体文库用于下一轮的筛选。将淘选进行2个循环以富集与K562-CD19特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过实施例1所示的流式细胞术确定阳性克隆。得到多个克隆表现和亲本抗体huHD37一致。图6比较了6B3、8E5及人源化抗体huHD37的氨基酸序列，其中克隆6B3与亲本抗体huHD37相比重链上有2个点突变(SEQ IDNO:5)，其中CDR1上有1个，第34位甲硫氨酸变成异亮氨酸，CDR2上有一个，第57位天冬氨酸变成谷氨酸。克隆8E3与亲本抗体huHD37相比轻链上有三个点突变(SEQ ID NO:7)位于CDR1区，第27位谷氨酰胺变成组氨酸，第29位缬氨酸变成亮氨酸，第35位丝氨酸变成天冬酰氨。
2.2克隆6B3，8E3(scFv_Fc)的表达纯化
如实施例1所示，在VH上游引入合适的酶切位点和保护碱基，在VL的下游引入合适的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并纯化回收。酶切后连接入含有人Fc段的真核表达载体V152中(购自上海锐劲生物技术有限公司)。通过293Fectin瞬时转染至293F细胞中并表达。通过rProtein A柱亲和层析。通过SEC分析抗体的聚集情况，如图7和8所示，单体形式的抗体分别占比为97％、98％。与亲本抗体huHD37相比分别提高了3％和4％，聚集度进一步降低。经超滤浓缩后，通过SDS PAGE对得到的抗体进行定量和定性分析。产率分别为12.8ug/ml和69ug/ml(产率＝最终产物质量/转染体积)。
2.3 6B3、8E3的结合特性
使用稳定表达人CD19的K562细胞(K562-CD19)和K562，收集细胞，用完全生长培养基洗涤细胞，并以约1-5×105个细胞/孔将细胞铺到U型底微量滴定板中。在冰上将梯度稀释的scFv_Fc融合抗体与K562-CD19/K562孵育30分钟，其后与FITC标记的抗人Fc作为第二抗体孵育。两次洗涤步骤之后，使用Guava easyCyteTM HT System仪器分析，使用GraphPadPrism处理实验数据，得到EC50。图9显示了6B3与8E3与K562-CD19以及K562细胞的结合情况。结果表明稳定型提高，聚集程度降低的两个克隆6A3、8E3与K562-CD19的结合能力与huHD37基本一致，甚至还有所提高。
实施例3.抗CD19嵌合抗原受体质粒(CAR)的构建
3.1人源化抗体嵌合抗原受体质粒(CAR)的构建
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达人源化抗体huHD37的二代、四代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，包括PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-28Z、PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-BBZ、PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-28Z&IFNb以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-BBZ&IFNb(图10)。huHD37-28Z序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、huHD37scFV、CD8hinge(SEQ ID NO：25)、CD28跨膜域(SEQID NO：27)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：29)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成；huHD37-BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、huHD37scFV、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜域(SEQ ID NO：33)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成；huHD37-28BBZ序列由CD8α信号肽(SEQID NO：23)、huHD37-scFV、CD8hinge(SEQ ID NO：25)、CD28跨膜域(SEQID NO：27)和胞内段(SEQ ID NO：29)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及CD3ξ组成(SEQ ID NO：31)。PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-28Z&IFNb以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-huHD37-BBZ&IFNb则是在huHD37-28Z和huHD37-BBZ CAR终止信号末端反向添加了6个重复的NFAT-AP-1转录调控结合片段NFAT(SEQ ID NO：37)、IL-2mini promoter(SEQ ID NO：38)、IFNb cDNA序列(SEQ ID NO：39)以及终止信号PA2(SEQ ID NO：41)。
3.2慢病毒转导T淋巴细胞-CAR阳性的T淋巴细胞的制备
1)T淋巴细胞活化：以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养基液培养，并按照磁珠:细胞比例为2:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen)和终浓度500U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)刺激培养48h；
2)Retronectin包被24孔板：每孔加入380μl 5μg/ml的retronectin溶液(PBS)，4度孵育过夜；
3)弃去24孔板中的retronectin溶液(PBS)，1ml PBS洗两次；
4)将细胞接种于包被了retronectin的24孔板内，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μl；
5)按照MOI＝10在PBMC细胞中加入浓缩后的慢病毒，32度，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中；
6)扩增培养：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度500U/mL的重组人IL-2。
3.3T淋巴细胞嵌合抗原受体表达
1)慢病毒感染的T淋巴细胞在培养第7天，取1×106的T细胞，二等分于2ml离心管内；
2)4度，5000rpm，离心5min，弃上清，PBS洗两次；
3)对照组细胞加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min，PBS(2％NBS)洗两次，重悬后作为对照；
4)检测组细胞+50μl 1:50稀释的biotin-Goat anti human IgG，F(ab’)2抗体，冰上孵育45min；PBS(2％NBS)洗两次；加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min；
5)加入2ml PBS(2％NBS)重悬细胞，4℃，5000rpm/min，离心5分钟弃上清，重复两次；
6)加入500μl PBS(2％NBS)，转移至流式管中。流式细胞仪检测PE通道，确定CAR阳性的T细胞比例。
7)流式检测结果慢病毒感染后CAR+T细胞的阳性率分比为(图11)：
huHD37-28Z+T细胞阳性率：80.8％
huHD37-BBZ+T细胞阳性率：73.1％
huHD37-28Z&IFNb+T细胞阳性率：56.4％
huHD37-BBZ&IFNb+T细胞阳性率：53％
此外，对照组Mock+T细胞阳性率为90％。
3.4CD19抗原表位在肿瘤细胞系上的暴露情况分析
1)用10cm平皿培养如下的肿瘤细胞：K562、K562-CD19、Daudi和Raji细胞；
2)取1×106上述细胞，二等分，4℃，5000rpm/min，离心5分钟；
3)一组细胞直接加入500μl PBS(1％NBS)重悬后作为对照；
4)一组+50μl 1:20稀释的PerCP-CD19抗体，冰上孵育45min；
5)加入2ml PBS(1％NBS)重悬细胞，4℃，5000rpm/min，离心5分钟弃上清，重复两次；
6)入500μl PBS(1％NBS)重悬细胞，将细胞转移至流式管中；
7)流式细胞仪检测PerCP通道；
8)流式结果显示K562细胞不表达CD19蛋白，K562-CD19、Daudi和Raji均为CD19阳性细胞(图12)。
3.5靶向huHD37CAR T细胞的细胞毒性测定
1)靶细胞：分别接种75μL 2×105/mL的K562、K562-CD19、Daudi和Raji细胞于96well板；
2)效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3加T-Mock及表达不同嵌合抗原受体的CAR T细胞；
3)各组均设4个复孔，取4个复孔的平均值。检测时间为第18h；
4)其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CAR T；
①效应细胞自发LDH释放：校正效应细胞自发释放出来的LDH；
②靶细胞自发LDH释放：校正靶细胞自发释放出来的LDH；
③靶细胞最大LDH释放：计算时需要该对照确定100％的LDH释放；
④体积校正对照：校正由于加入裂解液(10×)引起的体积变化；
⑤培养基背景对照：校正由培养基中血清产生的LDH活性以及酚红造成的背景吸收。
5)检测方法：采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
6)细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。
在计算前，效应细胞对照，靶细胞对照，实验组减掉培养基对照；靶细胞最大裂解量减掉体积对照。
7)实验结果显示各表达不同嵌合抗原受体的CAR T细胞对CD19阳性的细胞均有显著的体外杀伤活性，对CD19阴性的K562细胞没有明显的非特异杀伤。(图13)。
实施例4.抗CD19嵌合抗原受体质粒(CAR)的构建
申请人利用实施例2得到的克隆6B3、8E3重复了实施例3，结果显示6B3和8E3与huHD37产生了相似的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
<120> 抗CD19的人源化抗体以及靶向CD19的免疫效应细胞
<130> P2017-2425
<150> CN201611148447.9
<151> 2016-12-13
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 2
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gacatcgtgc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gccccggcca gcgggccacc 60
atcacctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180
ggcgtgcccg cccggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aagcgg 336
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
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115 120
<210> 4
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
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agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc agctactgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggccag atctggcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggcgggag 300
accaccaccg tgggccggta ctactacgca atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360
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<400> 6
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc agctattgga taaactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggccag atctggcccg gtgacggcga aacccactac 180
aacggcaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggcgggag 300
accaccaccg tgggccggta ctactacgca atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Ser Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gacatcgtgc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gccccggcca gcgggccacc 60
atcacctgca aggccagcca tagcttggac tacgacggag acaactacct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180
ggcgtgcccg cccggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aagcgg 336
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Glu Thr His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Lys Ala Ser His Ser Leu Asp Tyr Asp Gly Asp Asn Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 18
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485 490 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500 505 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515 520 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 20
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu
165 170 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn
210 215 220
Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250
<210> 22
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc agctactgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggccag atctggcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggcgggag 300
accaccaccg tgggccggta ctactacgca atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360
accgtgagca gcggtggagg cggttcaggc ggaggtggtt ctggcggtgg cggatcggac 420
atcgtgctga cccagagccc cgccagcctg gccgtgagcc ccggccagcg ggccaccatc 480
acctgcaagg ccagccagag cgtggactac gacggcgaca gctacctgaa ctggtaccag 540
cagaagcccg gccagccccc caagctgctg atctacgacg ccagcaacct ggtgagcggc 600
gtgcccgccc ggttcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgac catcaacccc 660
gtggaggcca acgacaccgc caactactac tgccagcaga gcaccgagga cccctggacc 720
ttcggccagg gcaccaaggt ggagatcaag cgg 753
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 25
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 28
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 29
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 30
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 32
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
acc 63
<210> 35
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 36
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 37
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc 60
acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc gtcgaggaca attgacgcct tctgtatgaa 120
acagtttttc ctccacgcct tctgtatgaa acagtttttc ctccacgcct tctgtatgaa 180
acagtttttc ctcc 194
<210> 38
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
caggagttga ggttactgtg agtagtgatt aaagagagtg atagggaact cttgaacaag 60
agatgcaatt tatactgtta attctggaaa aatattatgg gggtgtcaaa atgt 114
<210> 39
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
Leu Val Ser Glu Val Thr Cys Lys Ser Val Asn Glu Val Lys Val Pro
1 5 10 15
Asp Phe His Ser Asp Tyr Gly Pro Gly Thr Val Thr Val Leu Leu Gly
20 25 30
Leu Gln Val Met Gln Asn Pro Pro Ile Ile Ser Phe Gln Val Gln Thr
35 40 45
Ala His Glu Phe Ser Pro Gly Glu Ile Phe Phe Leu Gln Phe Phe Phe
50 55 60
Gln Asp Cys Leu Gln Met Val Tyr Leu Met Ile Asp Ile Ser Gln Glu
65 70 75 80
Val Leu Asn Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ser Ala Arg Ile Leu Ser Glu
85 90 95
Asn Ser Lys Asp Val Leu Glu His Leu Ile Asp Gly Gln Cys Gly Val
100 105 110
Leu Leu Leu Glu Leu Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Arg Asp Val Lys
115 120 125
Val His Pro Val Leu Glu Ala Val Phe Lys Pro Pro Ile Gln Leu Pro
130 135 140
Gln Glu Leu Leu Thr Leu Lys Ile Ala Ala Ser Leu Glu Ser Lys Gln
145 150 155 160
Val Val Ala His Gly Lys Ser Cys Ser Gly Glu Ala Gln Gln Glu Ser
165 170 175
Asn Leu Glu Glu Thr Leu Val Gly His
180 185
<210> 40
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
ttagtttcgg aggtaacctg taagtctgtt aatgaagtaa aagttcctta ggatttccac 60
tctgactatg gtccaggcac agtgactgta ctccttggcc ttcaggtaat gcagaatcct 120
cccataatat cttttcaggt gcagactgct catgagtttt cccctggtga aatcttcttt 180
ctccagtttt tcttccagga ctgtcttcag atggtttatc tgatgataga cattagccag 240
gaggttctca acaatagtct cattccagcc agtgctagat gaatcttgtc tgaaaatagc 300
aaagatgttc tggagcatct catagatggt caatgcggcg tcctccttct ggaactgctg 360
cagctgctta atctcctcag ggatgtcaaa gttcatcctg tccttgaggc agtattcaag 420
cctcccattc aattgccaca ggagcttctg acactgaaaa ttgctgcttc tttgtaggaa 480
tccaagcaag ttgtagctca tggaaagagc tgtagtggag aagcacaaca ggagagcaat 540
ttggaggaga cacttgttgg tcat 564
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
ctcacacaaa aaaccaacac acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat t 51
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
ggggsggggs ggggs 15

Claims (33)

1.一种针对人CD19的人源化抗体，所述人源化抗体与稳定转染了人CD19的K562细胞的结合相对亲和力(EC50)小于10nM。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的轻链可变区的框架区如SEQ ID NO:1的1-23、39-53、61-92和102-111所示；和/或所述人源化抗体的重链可变区的框架区如SEQ ID NO:3的1-30、36-49、67-98和114-124所示。
3.如权利要求1或2所述的人源化抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：
(a)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区或其变体；
(b)一种抗体，具有SEQ ID NO:3所示的重链可变区或其变体；
(c)一种抗体，具有(a)所述抗体的轻链可变区和(b)抗体所述的重链可变区；和
(d)一种抗体，与(a)～(c)中任一项所述的抗体竞争结合人CD19的人源化抗体。
4.如权利要求3所述的人源化抗体，其特征在于，(a)所述的变体具有SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2、和SEQ ID NO:14所示的LCDR3。
5.如权利要求4所述的人源化抗体，其特征在于，(a)所述的变体具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区。
6.如权利要求3所述的人源化抗体，其特征在于，(b)所述的变体具有SEQ ID NO:15所示的HCDR1、SEQ ID NO:16所示的HCDR2、SEQ ID NO:11所示的HCDR3。
7.如权利要求6所述的人源化抗体，其特征在于，(b)所述抗体的变体具有SEQ ID NO:5所示的重链可变区。
8.如权利要求1-7中任一项所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体选自：
(a)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:3所示的重链可变区；
(b)一种抗体，具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区；
(c)一种抗体，具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ ID NO:3所示的重链可变区；和
(d)一种抗体，具有SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和SEQ ID NO:5所示的重链可变区。
9.编码权利要求1-8任一所述的抗体的核苷酸序列。
10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的核苷酸序列。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求10所述的表达载体或基因组中整合有权利要求9所述的核苷酸序列。
12.权利要求1-8任一所述的人源化抗体的用途，用于制备特异性靶向表达CD19的肿瘤细胞的靶向性药物、抗体药物偶联物或多功能抗体；或
用于制备诊断表达CD19的肿瘤的试剂；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
13.一种嵌合抗原受体，包含胞外域、跨膜域及胞内信号域，其特征在于，所述胞外域包含权利要求1-8任一所述的抗体，该抗体优选单链抗体或结构域抗体。
14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和初级信号域。
15.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括铰链域。
16.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述的跨膜域选自TCR的alpha、beta、zeta链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5,CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；和/或
所述共刺激信号域选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和/或
所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d，和CD3ζ，
更佳的，
所述的跨膜域选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；和/或
所述共刺激信号域选自CD137，CD134，CD28和OX40；和/或
所述初级信号域选自CD3ζ，
最优的，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。
17.如权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区：
权利要求1-8任一所述的抗体、CD8和CD3ζ；
权利要求1-8任一所述的抗体、CD8、CD137和CD3ζ；
权利要求1-8任一所述的抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或
权利要求1-8任一所述的抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
18.如权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述胞外域具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
所述跨膜域选自SEQID NO：27所示的CD28跨膜域、SEQ ID NO：33所示的CD8跨膜域；
所述共刺激信号域选自SEQ ID NO：29所示的CD28胞内域和SEQ ID NO：35所示的CD137的胞内域或其混合。
19.如权利要求18所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体选自：
嵌合抗原受体一，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQID NO：27所示的跨膜域、SEQ ID NO：29所示的共刺激信号域、以及SEQ ID NO：31所示的初级信号域(huHD37-28Z)；
嵌合抗原受体二，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQID NO：33所示的跨膜域、SEQ ID NO：35所示的共刺激信号域、以及SEQ ID NO：31所示的初级信号域(huHD37-BBZ)；或
嵌合抗原受体三，具有SEQ ID NO:21所示的胞外域、SEQ ID NO：25所示的铰链域、SEQID NO：27所示的跨膜域、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：35所示的共刺激信号域、以及SEQ IDNO：31所示的初级信号域(huHD37-28BBZ)。
20.编码权利要求13-19任一所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
21.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求20所述的核苷酸序列。
22.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求21所述的表达载体。
23.权利要求13-19任一所述的嵌合抗原受体、或权利要求20所述的核苷酸序列、或权利要求21所述的表达载体、或权利要求22所述的病毒的用途，用于制备靶向表达CD19的肿瘤细胞的基因修饰的免疫细胞。
24.一种基因修饰的免疫细胞，其特征在于，其转导有权利要求20所述的核苷酸序列，或权利要求21所述的表达载体或权利要求22所述的病毒；或其表达权利要求13-19任一所述的嵌合抗原受体。
25.如权利要求24所述的基因修饰的免疫细胞，其特征在于，还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；
较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；
较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；
较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。
26.权利要求24或25所述的基因修饰的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制表达CD19的肿瘤的药物。
27.一种多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的多功能免疫辍合物包括：
权利要求1-8任一所述的抗体；以及
与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：靶向除CD19以外的其他肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。
28.如权利要求27所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或
所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素；较佳地，所述的细胞因子包括：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。
29.如权利要求27所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体，其与权利要求1-8任一所述的抗体形成T细胞参与的双功能抗体，优选的，所述结合T细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体。
30.如权利要求27所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，其是融合多肽，权利要求1-8任一所述的抗体以及与之连接的功能性分子之间还包括连接肽。
31.编码权利要求27-30任一所述的多功能免疫辍合物的核苷酸序列。
32.权利要求27-30任一所述的多功能免疫辍合物的用途，用于制备抗肿瘤药物，或
用于制备诊断表达CD19的肿瘤的试剂；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
33.一种药物组合物，其特征在于，其包括：
权利要求1-8任一所述的抗体或编码该抗体的核苷酸序列；或
权利要求13-19任一所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列；或
权利要求24或25所述的基因修饰的免疫细胞；或
权利要求27-30任一所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核苷酸序列。
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