CN108588032A - 杂交瘤细胞株及其制备方法、三环类抗抑郁药单克隆抗体及试剂盒 - Google Patents

杂交瘤细胞株及其制备方法、三环类抗抑郁药单克隆抗体及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其制备方法、三环类抗抑郁药单克隆抗体及试剂盒。所述杂交瘤细胞株能够分泌与三环类抗抑郁药特异性结合的三环类抗抑郁药单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.15493。本发明的有益效果为：在用试剂盒进行检测时，如果尿液中三环类抗抑郁药未达到设定浓度，则试验线会出现***条带。如果尿液中三环类抗抑郁药浓度达到甚至超过设定浓度，则试验线不会出现***条带。

Description

杂交瘤细胞株及其制备方法、三环类抗抑郁药单克隆抗体及 试剂盒
技术领域
本发明涉及药物检测，特别涉及一种杂交瘤细胞株及其制备方法、三环类抗抑郁药单克隆抗体及试剂盒。
背景技术
三环类抗抑郁药自60年代就开始应用于治疗抑郁症，目前尚用于治疗其他精神疾患，如强制性障碍、注意力缺乏性疾病、恐慌、恐惧症、周围神经病、焦虑症、进食障碍等。正常人口服本药后，出现困倦、头晕、口干、视力模糊及血压降低等。相反，抑郁症患者连续服药后，情绪提高，精神振奋，出现明显抗抑郁作用。三环抗抑郁药口服后吸收快而且完全，在血液中90％与血浆蛋白质结合，主要分布于肝、脑、心脏等组织。三环类抗抑郁药由肝脏代谢，最后经肾脏由尿液排出，药物半衰期约为18-48小时。为了避免三环类抗抑郁药的滥用，在戒毒中心、出入境检疫等地方需要对体内三环类抗抑郁药进行检测。
彭安林在《液相色谱-串联质谱法检测人血浆中三环类抗抑郁药的血药浓度》中公开采用液相色谱-串联质谱法检测血浆中的三环类抗抑郁药的方法。但是，该方法适用于对三环类抗抑郁药进行定量测量，而对三环类抗抑郁药进行定性检测时，该方法较为繁琐，有待改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的三环类抗抑郁药单克隆抗体能够与三环类抗抑郁药特异性结合，采用含有该三环类抗抑郁药单克隆抗体的试剂盒能够定性检测三环类抗抑郁药，方法简便。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株能够分泌与三环类抗抑郁药特异性结合的三环类抗抑郁药单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.15493。
本发明另一发明目的在于提供一种上述杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
免疫、测定血清效价、融合、细胞株筛选；
所述细胞株筛选包括如下步骤：
(1)杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检测活性；
(2)根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第一次亚克隆；
(3)待第一次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性；
(4)根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第二次亚克隆，同时扩至24孔板进行增殖；
(5)待第二次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性；
(6)根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至24孔板进行增殖；
(7)待24孔板细胞长至汇合率为80％后，吸取上清液，检测活性；
(8)根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至25cm2细胞培养瓶进行增殖、冻存保种。
本发明进一步设置为：所述免疫步骤包括如下步骤：
(1)取6-8周Balb/c健康小鼠3只；
(2)初次免疫，取抗原与弗氏完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射；
(3)二次免疫，于第14天，取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射；
(4)第三、四次免疫，于第28天、42天，取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射。
本发明进一步设置为：所述测定血清效价步骤包括如下步骤：
(1)提前将预包被好的酶标板取出置于室温下至少半小时；
(2)分别对免疫小鼠进行眼眶采血；
(3)待血液完全凝固后，3000r/min离心5min，取上清液；
(4)将上清液用PBS进行倍比稀释；
(5)加样：在已恢复室温的酶标板的微孔条中，分别加入稀释后上清100μl，以PBS作为空白对照，正常鼠血清对阴性对照，置37℃温育30min；
(6)洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔，反复3次，最后在吸水纸上拍干；
(7)加酶：每孔加入酶标记物100μl，用封板膜覆盖，置37℃孵育30min；
(8)洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔，反复3次，最后在吸水纸上拍干；
(9)显色：每孔加入TMB底物100μl，用封板膜覆盖，置37℃避光孵育15分钟；
(10)终止：每孔加终止液50μl，震荡使孔内液体混合均匀，立即测试结果；(11)读数：用酶标仪双波长读取各孔的吸光度值。
本发明还有一发明目的在于提供一种三环类抗抑郁药单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
本发明进一步设置为：所述三环类抗抑郁药单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)将保存的杂交瘤细胞株腹腔注射入小鼠进行腹水生产；
(2)将腹水用滤纸、玻璃纤维与无纺布各两层进行过滤；
(3)过滤后腹水用A液体积比为1∶1稀释，A液由20mM PB和0.3M NaCl组成，A液的pH＝7.5；
(4)稀释后腹水混匀测OD后上样，上样速度为5ml/min；
(5)上样后用A液平衡完全，平衡速度5ml/min；
(6)A液平衡后，用B液洗脱并接样，洗脱速度10ml/min，B液为0.1M甘氨酸，B液的pH＝4；
(7)接样过程中，吸光值上扬后换管接样，直至OD＜0.2；
(8)接样后立即用2M Tris调pH＝7.5，加入NaN3至NaN3的终浓度为万分之一；
(9)B液洗脱并平衡完全后，用A液平衡完全；
(10)将得到的腹水分别跑电泳、测活性；
(11)纯度符合要求后，进行胶体金筛选。
本发明还有一发明目的在于提供一种试剂盒，包括用上述三环类抗抑郁药单克隆抗体所制成的金标垫。
本发明进一步设置为：所述金标垫的制备方法包括如下步骤：
(1)包被抗原；
(2)烧40nm的胶体金溶液；
(3)将三环类抗抑郁药单克隆抗体稀释至1mg/ml，标记金溶液；
(4)抗体条件：确定K值，固定三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量，连续增加K值；用微量进样器将碳酸钾溶液加入到红溶液中，混匀，五只为一组；然后再加入相同的三环类抗抑郁药单克隆抗体量，混匀；然后每管滴入三滴2M NaCl溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时的碳酸钾的体积为我们所要的K值；
(5)确定Ab值，固定K值，不断改变三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量；先用微量进样器加入碳酸钾溶液至红溶液中，混匀；然后再加入不同体积的三环类抗抑郁药单克隆抗体，混匀；然后每管滴入三滴2M NaCl溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时所需三环类抗抑郁药单克隆抗体最小用量为Ab值；
(6)配置离心小样进行离心：向离心管中加入碳酸钾溶液，混匀；随后加入三环类抗抑郁药单克隆抗体，混匀；再次向离心管中分别加入400μl稳定剂和200μl的终止剂混匀；先以5000r/min离心20min，静置10min；用移液管移取底部沉淀于离心管中；将离心后的上清液再以8000r/min离心20min，静置10min；用移液管移取底部沉淀于离心管中，此时离心后的上清液即为小样；
(7)测小样的OD值，将小样稀释至OD＝20，配置金标垫小样溶液；
(8)做金标垫小样：用移液枪移取配制好的金标垫小样溶液，涂到空白金标垫上直至整个金标垫涂抹均匀。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
在用试剂盒进行检测时，如果尿液中三环类抗抑郁药未达到设定浓度，则试验线会出现***条带。如果尿液中三环类抗抑郁药浓度达到甚至超过设定浓度，则试验线不会出现***条带。
附图说明
图1为11株三环类抗抑郁药单克隆抗体纯化后电泳图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
如无特别说明，以下所涉及的试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1
实施例1用于说明杂交瘤细胞株的制备方法。
杂交瘤细胞株的制备方法具体如下：
免疫
(1)取6-8周Balb/c健康小鼠3只。
(2)初次免疫，取三环类抗抑郁药与弗氏完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射。
(3)二次免疫，在第14天，取三环类抗抑郁药与弗氏不完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射。
(4)第三、四次免疫，于第28天、42天，取三环类抗抑郁药与弗氏不完全佐剂体积比为1∶1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射。
测定血清效价
(1)提前将预包被好的酶标板从冰箱中取出至室温至少半小时。
(2)分别对免疫小鼠进行眼眶采血。
(3)待血液完全凝固后，3000r/min离心5min，取上清液。
(4)将上清液分别用PBS按1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000……体积倍比稀释。
(5)加样：在已恢复室温的酶标板的微孔条中，分别加入稀释后上清100μl，以PBS作为空白对照，正常鼠血清为阴性对照，置37℃温育30分钟。
(6)洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔(约300μl/孔)，反复3次，最后在吸水纸上拍干。
(7)加酶：每孔加入酶标记物100μl，用封板膜覆盖，置37℃孵育30分钟。
(8)洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔(约300μl/孔)，反复3次，最后在吸水纸上拍干。
(9)显色：每孔加入TMB底物100ul，用封板膜覆盖，置37℃避光孵育15分钟。
(10)终止：每孔加终止液50μl，轻轻震荡使孔内液体混合均匀，立即测试结果。
(11)读数：用酶标仪双波长读取各孔的吸光度值。
融合
根据免疫小鼠血清效价检测结果选取效价符合要求的小鼠进行融合。
细胞株筛选
(1)细胞融合后大多数杂交瘤细胞在10-20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检测活性。
(2)根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第一次亚克隆。
(3)待第一次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性。
(4)根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第二次亚克隆，同时扩至24孔板进行增殖。
(5)待第二次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性。
(6)根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至24孔板进行增殖。
(7)待24孔板细胞长至汇合率为80％后，吸取上清液，检测活性。
(8)根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至25cm2细胞培养瓶进行增殖、冻存保种。
细胞株筛选过程中，合适的孔的条件为上清液的OD450/630大于1。
在本发明中，共筛选到11株杂交瘤细胞株。
实施例2
实施例2用于说明三环类抗抑郁药单克隆抗体的制备方法。
腹水纯化(三环类抗抑郁药单克隆抗体的制备)
(1)将保存的杂交瘤细胞株腹腔注射入小鼠进行腹水生产。
(2)将腹水用滤纸、玻璃纤维与无纺布各两层进行过滤。
(3)过滤后腹水用A液(20mM PB+0.3M NaClpH＝7.5M＝mol/L)体积比为1∶1稀释。
(4)稀释后腹水混匀测OD后上样，上样速度为5ml/min(根据柱子的截面积确定)，上样所用树脂为GE proteinA。
(5)上样后用A液平衡完全，平衡速度5ml/min。
(6)A液平衡后，用B液(0.1M甘氨酸pH＝4M＝mol/L)洗脱并接样，洗脱速度10ml/min。
(7)接样过程中，吸光值上扬后换管接样，直至OD＜0.2。
(8)接样后立即用2M Tris(M＝mol/L)调pH＝7.5，加入NaN3至NaN3的终浓度为万分之一。
(9)B液洗脱并平衡完全后，用A液平衡完全。
(10)将得到的腹水分别跑电泳、测活性。
(11)纯度符合要求后，进行胶体金筛选。
11株杂交瘤细胞株分泌的三环类抗抑郁药单克隆抗体纯化后电泳图如图1所示。从图1可知，纯化后的三环类抗抑郁药单克隆抗体纯度符合要求。
实施例3
实施例3用于说明金标垫的制备方法。
胶体金筛选(金标垫的制备)
(1)包被抗原。
(2)烧40nm的胶体金溶液。
(3)将三环类抗抑郁药单克隆抗体稀释至1mg/ml，标记金溶液。
(4)抗体条件：确定K值，固定三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量(一般过量)，连续增加K值(例如碳酸钾的用量为3，5，7，9，11微升)。用微量进样器将碳酸钾溶液加入到红溶液中，混匀，五只为一组。然后再加入相同的三环类抗抑郁药单克隆抗体量，混匀。然后每管滴入三滴2M NaCl(M＝mol/L)溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时的碳酸钾的体积为我们所要的K值。
(5)确定Ab值，固定K值，不断改变三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量(三环类抗抑郁药单克隆抗体量要连续)。先用微量进样器加入碳酸钾溶液至红溶液中，混匀。然后再加入不同体积的三环类抗抑郁药单克隆抗体(例如：5，7，9，11，13微升)，混匀。然后每管滴入三滴2M NaCl(M＝mol/L)溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时所需三环类抗抑郁药单克隆抗体最小用量为Ab值。
(6)配置离心小样进行离心：向离心管中加入碳酸钾溶液，混匀；随后加入三环类抗抑郁药单克隆抗体，混匀；再次向离心管中分别加入400μl稳定剂(R06和R06’)和200μl的R307终止剂混匀；先以5000r/min离心20min，静置10min。用移液管移取底部沉淀于离心管中。将离心后的上清液再以8000r/min离心20min，静置10min(沉淀由侧壁降到底部)。用移液管移取底部沉淀于离心管中，此时离心后的上清液即为小样。
(7)测小样的OD值，将小样稀释至OD＝20，配置金标垫小样溶液。
(8)做金标垫小样：将空白金标垫裁剪成5*10cm的规格。用移液枪移取配制好的金标垫小样溶液，涂到空白金标垫上，戴手套的指肚不断朝金标垫的一个方向涂抹溶液，直至整个金标垫涂抹均匀。
(9)检测结果：
检测方法：
1、直接将检测溶液滴至金标垫加样处，约2-3滴；
2、将金标垫平放1min，等待红色条带出现；
3、3-8分钟内观察结果，将红色条带与比色卡进行比对，记录显色程度10分钟后判读无效。
将11株杂交瘤细胞株分泌的三环类抗抑郁药单克隆抗体均制成金标垫，依次编号为1-11号，参照上述检测方法进行检测，检测结果见表1。
表1
从表1可知，2号三环类抗抑郁药单克隆抗体最好，检测交叉药物，无交叉。
以上所使用的碳酸钾溶液的质量分数为1％。
实施例4
根据表1，将2号三环类抗抑郁药单克隆抗体对应的杂交瘤细胞株进行保藏。该杂交瘤细胞株于2018年03月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15493。
实施例5
一种试剂盒，包括按照实施例3方法制备的2号金标垫。
尿液中三环类抗抑郁药检测
1、取三环类抗抑郁药浓度分别为0、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的尿液滴至金标垫加样处，约2-3滴；
2、将金标垫平放1min，等待红色条出现；
3、3-8分钟内观察结果，10分钟后判读无效。
表2
三环类抗抑郁药浓度/(ng/ml) 0 10 100 1000
显色级别 8 8 5 0
从表2可知，本发明能够定性检测尿液中三环类抗抑郁药，方法简便。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征是：所述杂交瘤细胞株能够分泌与三环类抗抑郁药特异性结合的三环类抗抑郁药单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.15493。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
免疫、测定血清效价、融合、细胞株筛选；
所述细胞株筛选包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检测活性；
（2）根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第一次亚克隆；
（3）待第一次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性；
（4）根据上清液活性检测结果选取合适的孔进行第二次亚克隆，同时扩至24孔板进行增殖；
（5）待第二次亚克隆细胞团长至明显可见时，吸取上清液，检测活性；
（6）根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至24孔板进行增殖；
（7）待24孔板细胞长至汇合率为80%后，吸取上清液，检测活性；
（8）根据上清液活性检测结果选取合适的孔扩至25cm2细胞培养瓶进行增殖、冻存保种。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是：所述免疫步骤包括如下步骤：
（1）取6-8周Balb/c健康小鼠3只；
（2）初次免疫，取抗原与弗氏完全佐剂体积比为1:1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射；
（3）二次免疫，于第14天，取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射；
（4）第三、四次免疫，于第28天、42天，取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1混合后乳化，形成油包水状态，对小鼠进行皮下多点注射。
4.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是：所述测定血清效价步骤包括如下步骤：
（1）提前将预包被好的酶标板取出置于室温下至少半小时；
（2）分别对免疫小鼠进行眼眶采血；
（3）待血液完全凝固后，3000r/min离心5min，取上清液；
（4）将上清液用PBS进行倍比稀释；
（5）加样：在已恢复室温的酶标板的微孔条中，分别加入稀释后上清100μl，以PBS作为空白对照，正常鼠血清对阴性对照，置37℃温育30min；
（6）洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔，反复3次，最后在吸水纸上拍干；
（7）加酶：每孔加入酶标记物100μl，用封板膜覆盖，置37℃孵育30min；
（8）洗板：用洗板机吸去孔内液体，将洗液注满每孔，反复3次，最后在吸水纸上拍干；
（9）显色：每孔加入TMB底物100μl，用封板膜覆盖，置37℃避光孵育15分钟；
（10）终止：每孔加终止液50μl，震荡使孔内液体混合均匀，立即测试结果；
（11）读数：用酶标仪双波长读取各孔的吸光度值。
5.一种三环类抗抑郁药单克隆抗体，其特征是：由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
6.根据权利要求5所述的三环类抗抑郁药单克隆抗体，其特征是：所述三环类抗抑郁药单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
（1）将保存的杂交瘤细胞株腹腔注射入小鼠进行腹水生产；
（2）将腹水用滤纸、玻璃纤维与无纺布各两层进行过滤；
（3）过滤后腹水用A液体积比为1:1稀释，A液由20mM PB和0.3M NaCl组成，A液的pH=7.5；
（4）稀释后腹水混匀测OD后上样，上样速度为5ml/min；
（5）上样后用A液平衡完全，平衡速度5ml/min；
（6）A液平衡后，用B液洗脱并接样，洗脱速度10ml/min，B液为0.1M甘氨酸，B液的pH=4；
（7）接样过程中，吸光值上扬后换管接样，直至OD<0.2；
（8）接样后立即用2M Tris调pH=7.5，加入NaN3至NaN3的终浓度为万分之一；
（9）B液洗脱并平衡完全后，用A液平衡完全；
（10）将得到的腹水分别跑电泳、测活性；
（11）纯度符合要求后，进行胶体金筛选。
7.一种试剂盒，其特征是：包括用如权利要求6所述的三环类抗抑郁药单克隆抗体所制成的金标垫。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征是：所述金标垫的制备方法包括如下步骤：
（1）包被抗原；
（2）烧40nm的胶体金溶液；
（3）将三环类抗抑郁药单克隆抗体稀释至1mg/ml，标记金溶液；
（4）抗体条件：确定K值，固定三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量，连续增加K值；用微量进样器将碳酸钾溶液加入到红溶液中，混匀，五只为一组；然后再加入相同的三环类抗抑郁药单克隆抗体量，混匀；然后每管滴入三滴2M NaCl溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时的碳酸钾的体积为我们所要的K值；
（5）确定Ab值，固定K值，不断改变三环类抗抑郁药单克隆抗体的用量；先用微量进样器加入碳酸钾溶液至红溶液中，混匀；然后再加入不同体积的三环类抗抑郁药单克隆抗体，混匀；然后每管滴入三滴2M NaCl溶液，混匀观察有无聚沉现象，直至出现溶液颜色不再变化，此时所需三环类抗抑郁药单克隆抗体最小用量为Ab值；
（6）配置离心小样进行离心：向离心管中加入碳酸钾溶液，混匀；随后加入三环类抗抑郁药单克隆抗体，混匀；再次向离心管中分别加入400μl稳定剂和200μl的终止剂混匀；先以5000r/min离心20min，静置10min；用移液管移取底部沉淀于离心管中；将离心后的上清液再以8000r/min离心20min，静置10min；用移液管移取底部沉淀于离心管中，此时离心后的上清液即为小样；
（7）测小样的OD值，将小样稀释至OD=20，配置金标垫小样溶液；
（8）做金标垫小样：用移液枪移取配制好的金标垫小样溶液，涂到空白金标垫上直至整个金标垫涂抹均匀。
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