CN108587997B - 一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-oh-ad的方法 - Google Patents

一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-oh-ad的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9‑OH‑AD的方法，属于生物工程和生物技术领域。本发明通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮，底物雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮具有效率高，专一性强,能耗低等优点。

Description

一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-OH-AD的方法
技术领域
本发明涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-OH-AD的方法，属于生物工程和生物技术领域。
背景技术
甾体化合物是广泛存在于生物体组织内的一类重要的天然有机化合物，由于甾体类药物具有多种生理功能并发挥独特疗效，故在临床上有广泛的应用。甾体化合物是仅次于抗生素的第二大类药物，年增长率在15％以上。甾类化合物通常具有一系列独特的生理功能，这主要是由于甾体化合物母核上取代基、双键位置或立体构型的不同。甾类化合物拥有类似的结构且结构复杂数目繁多，普遍存在于动、植物组织和某些微生物中，比较常见的有动物组织中的胆固醇、胆酸、性激素、肾上腺皮质激素、孕酮和雄酮等植物中的薯预皂素和谷甾醇等以及酵母细胞中的麦角固醇等。
9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)具有9-羟基结构，可借助常规甾体化学合成手段形成C9，11-双键体系，从而很方便地在C9位引入一个卤素原子形成糖皮质激素必不可缺少的功能羟基。9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体，其9α位作为被羟基化的位点，在进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素(如***、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物)的药效，工艺流程的实现可根本解决目前工业生产中存在的C11α-羟基化转化率低、副产物多的问题，具有极高的商业价值。
3-甾酮9α-羟基化酶(3-ketosteroid-9-alpha-hydroxylase(KSH))是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在，例如红球菌属Rhodococcus，诺卡氏菌属Nocardia，节杆菌属Arthrobacter，分枝杆菌属Mycobacteriu。3-甾酮9α-羟基化酶***是一个双组分酶，由KshA(3-甾酮9α-羟基化酶氧化酶)和KshB(3-甾酮9α-羟基化酶还原酶)组成，由基因kshA和kshB分别编码KshA和KshB，这一点最早在Rhodococcus erythropolisSQ1中获得证实，且对Rhodococcus erythropolis SQ1所进行的基因敲除研究表明，kshA和kshB都是KSH表达所必需的组分。KshB是3-甾酮9α-羟基化酶***的还原组件，它负责将来自NADH的还原力传递给KshA，使其从氧化态重新回到还原态并不断地在甾体的相应位置产生羟基化反应，另外，KshB是一个多功能酶，它不仅仅在3-甾酮9α-羟基化酶***中发挥作用，在生物体内其他需要还原力的地方也发挥着重要的作用。
最初合成9α-OH-AD的方法局限在化学法，以黄姜皂素等为原料进行一系列的化学反应，如hoffmann重排、中和作用和脱脂反应等，但该方法步骤分复杂，并且原料单一，黄姜皂素等已经处于紧缺状态，还会产生大量的副产物及有毒物质，反应条件较为极端，对环境会造成严重的破坏，存在许多弊端。因此，选择微生物法更具可行性，制备通过微生物转化法制备9α-OH-AD的途径一般包括两种，一种是通过分枝杆菌等对植物甾醇等催化底物的侧链进行降解后直接发酵获得9α-OH-AD，另一种则是先通过微生物对甾醇侧链降解产生AD，再利用红球菌等对前体AD进行9α羟基化作用。但由于甾醇降解途径中必然存在限速步骤和限速酶的作用，同时，由于微生物体内的3-甾酮-△1-脱氢酶(Ksdd)可催化AD转化为ADD，其存在也会阻碍9-OH-AD的积累，从而导致较低的转化率更长的发酵周期，大大降低了生产效率。
发明内容
本发明首先提供了一种表达了3-甾酮9α-羟基化酶氧化酶(KshA)和3-甾酮9α-羟基化酶还原酶(KshB)的重组谷氨酸棒杆菌。
具体地，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，利用重叠延伸PCR技术将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基KshA、还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。
本发明还提供构建所述重组谷氨酸棒杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)设计引物，PCR扩增编码3-甾酮9α-羟基化酶的基因
用于扩增编码3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshA的基因的PCR引物为P1和P2：
P1：5’-CGGGATCCATGACGACTGAGCACGCCGG-3’(BamH I)
P2：5’-TTTCCTCCCTTTAGTCAGCTTGATTGAGCGGTTTC-3’(rbsR)；
用于扩增编码3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因的PCR引物P3和P4：
P3：5’-AAAGGAGGGAAATCATGACTGATGAACCGTTAGGTAG-3’(rbsF)
P4：5’-CCCAAGCTTTCACTCGTCGTAGGTCACCTC-3’(Hind III)；
(2)克隆3-甾酮9α-羟基化酶KSH的氧化亚基和还原亚基基因全序列
以合成的DNA为模板，利用上述引物，先利用引物P1/P2和P3/P4通过PCR分别扩增出KshA，KshB全序列，将扩增产物作为互为引物继续进行扩增，最终利用P1/P4扩增出kshA-kshB的串联序列；
PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP 2μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min；
(3)重组表达载体pXMJ19-kshA-kshB的构建
将基因扩增产物按一定比例与pMD18T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamH I/HindⅢ酶切释放出载体和目的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18T-kshA-kshB。
提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18T-kshA-kshB，所有质粒经BamHI/HindⅢ双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜分别连接kshA-kshB和pXMJ19过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性和氨苄抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/HindⅢ双酶切后释放出载体和目的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-kshA-kshB。
(4)重组质粒pMJ19-kshA-kshB转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032
将经验证构建成功的重组质粒pMJ19-kshA-kshB通过电击转化法转化至模式菌株C.glutamicum ATCC13032中；
(5)重组菌株C.glutamicum ATCC13032/pMJ19-kshA-kshB阳性转化子的筛选
挑取在具有氯霉素抗性平板上长出的菌落,摇瓶发酵,提取质粒进行酶切验证。
本发明还提供了应用重组谷氨酸棒杆菌以甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮作为底物，转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。
所述方法是以重组谷氨酸棒杆菌为催化剂，以甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮作为底物构建全细胞催化体系，所述全细胞催化体系中重组菌的菌体浓度为OD600＝1.2-1.4，底物的初始浓度为0.5-2g/L，每小时补加0.5-2g/L底物，使用0.1-0.5M的碳酸盐缓冲液，全细胞转化体系pH控制在6.5-7.5的范围内，反应温度控制在25-40℃。
所述方法的反应温度优选30℃，所述方法的pH优选7.0，所述方法优选以0.3M碳酸盐为缓冲液。
将200mL LBG培养的重组菌菌体重新悬浮于200mL的底物缓冲液中，在最佳的转化条件下进行转化法生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。
所述方法还包括向转化体系中添加Mn，优选Mn添加浓度为0.5mM。
所述方法还包括在反应过程中每隔1.0h补加1g/L底物。
本发明通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19,将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。酶活测定结果表明：原始菌不具有3-甾酮9α-羟基化酶的活性，而重组工程菌的3-甾酮9α-羟基化酶酶活达到34.3U/mg。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，以甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮作为底物同时基于3-甾酮9α-羟基化酶酶学性质，确定了最佳的反应温度为30℃和pH为7.0。将200mL LBG培养的重组菌菌体重新悬浮于200mL的底物缓冲液中，在最佳的转化条件下进行转化法生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。10h后可以得到9.8g/L的9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，底物雄甾-4-烯-3,17-二酮的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮具有效率高，专一性强、能耗低等优点。
具体实施方式
KSH测定体系包括：105μM NADH，200μM底物AD(溶于100％异丙醇)，50m Tris-HCL(200μL，pH7.0)，以及KSH酶。因此其活性定义为，1min内氧化甾体底物AD所需要的酶量，表示为1min内氧化1nmol NADH所需要的酶量，比活力单位为nmol min-1mg-1(U/mg)。
HPLC分析：AD与9-OH-AD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法制定10μL，流速：1.0ml/min。
LBG培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCL10g/L，葡萄糖10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)。
实施例1重组菌C.glutamicum ATCC13032/pMJ19-kshA-kshB的构建
1、3-甾酮9α-羟基化酶引物设计
根据NCBI中Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的全基因组核酸序列中kshA基因序列，设计3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshA的PCR引物P1和P2。
P1：5’-CGGGATCCATGACGACTGAGCACGCCGG-3’(BamH I)
P2：5’-TTTCCTCCCTTTAGTCAGCTTGATTGAGCGGTTTC-3’(rbsR)
根据NCBI中Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的全基因组核酸序列中kshB基因序列，设计3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的PCR引物P3和P4。
P3：5’-AAAGGAGGGAAATC ATGACTGATGAACCGTTAGGTAG-3’(rbsF)
P4：5’-CCCAAGCTTTCACTCGTCGTAGGTCACCTC-3’(Hind III)
2、3-甾酮9α-羟基化酶基因kshA和kshB的克隆
以合成的DNA为模板，利用上述引物，先利用引物P1/P2和P3/P4通过PCR分别扩增出KshA(SEQ ID NO.1)，KshB(SEQ ID NO.2)全序列，将扩增产物作为互为引物继续进行扩增，最终利用P1/P4扩增出kshA-kshB的串联序列，扩增条件为:94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，l min，58℃退火，l min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系:模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10x Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-T Vector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18T-kshA-kshB，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，一70℃冰箱保藏。
3、重组表达载体pMJ19-kshA-kshB的构建
提取保存于E.coli jM109中的质粒pMD18T-kshA-kshB和pMJ19，并分别用BamH I/Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pMJ19酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 1uL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pMJ19-kshA-kshB转化到感受态E.coil JM109，用LB卡那霉素抗性和氨苄抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMJ19-kshA-kshB，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％-20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。
4、重组质粒pMJ19-kshA-kshB转化C.glutamicum ATCC13032
感受态制备：挑取C.glutamicum ATCC13032接种于一支10mL LBG(LB+0.5％葡萄糖)液体培养基，30℃摇床培养过夜，取500μL过夜培养的菌液转接入含3％甘氨酸和0.1％吐温-80的50m1液体LB培养基中，使得初始细胞OD达到0.3于30℃，200r/min培养到细胞OD达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷15min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体4次，最后用0.2ml 10％甘油重悬细胞,用1.5m1管分装，每管80u1直接用于电转化。
电转:1800V电转5ms，电转后加入800u1LB培养基30℃培养2-3h
重组菌获得：涂布于氯霉素抗性LBG培养基，30℃培养挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌C.glutamicum ATCC13032/pMJ19-kshA-kshB
5、3-甾酮9α-羟基化酶活力测定
3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)的酶活测定体系为105μM NADH，200μM溶于100％异丙醇甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物，50mM Tris-HCL(200μL，pH7.0)，以及KSH酶(包括氧化亚基与还原亚基)。酶活测定结果表明，重组工程菌的3-甾酮9α-羟基化酶酶活达到47.8U/mL，而原始菌C.glutamicum ATCC13032并没有检测到KSH的酶活，从而实现了在C.glutamicum ATCC13032中3-甾酮9α-羟基化酶酶活力的从无到有。
实施例2:重组菌C.glutamicum ATCC13032/pMJ19-kshA-kshB全细胞转化法生产9-OH-AD
将实施例1中构建的重组菌C.glutamicum ATCC13032/pMJ19-kshA-kshB接种于200mL LBG培养基中培养8h后加入终浓度为0.7mM的IPTG，30℃诱导8h后，收集获得细胞，以pH 7.0tris-HCl洗涤两次后重悬于200mL底物缓冲液(0.3M碳酸盐缓冲液，1g/L AD，0.5mMMn，pH 7.0)，每小时补加1.0g/L底物AD，30℃转化10h后用高效液相色谱法(HPLC)测定转化液中AD和9-OH-AD的含量。结果表明，转化10h后，转化液中的9-OH-AD的含量的9.8g/L，9-OH-AD的摩尔转化率为99.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-OH-AD的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> Mycobacterium sp. Strain VKM Ac-1817D
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<400> 3
cgggatccat gacgactgag cacgccgg 28
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttcctccct ttagtcagct tgattgagcg gtttc 35
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaggaggga aatcatgact gatgaaccgt taggtag 37
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaagcttt cactcgtcgt aggtcacctc 30

Claims (6)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19表达了3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基和还原亚基；3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基和还原亚基来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D；编码所述3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基和还原亚基的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是以C.glutamicum ATCC13032为宿主。
3.一种构建权利要求1或2所述重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计引物，克隆3-甾酮9α-羟基化酶KSH的氧化亚基和还原亚基基因全序列，
(2)构建重组表达载体pXMJ19-kshA-kshB，
(3)将重组质粒pXMJ19-kshA-kshB转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032，
将经验证构建成功的重组质粒pXMJ19-kshA-kshB通过电击转化法转化至模式菌株C.glutamicum ATCC13032中；获得重组菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-kshA-kshB；
所述3-甾酮9α-羟基化酶KSH的氧化亚基基因全序列如SEQ ID NO.1所示；
所述3-甾酮9α-羟基化酶KSH的还原亚基基因全序列如SEQ ID NO.2所示。
4.应用权利要求1或2所述重组谷氨酸棒杆菌生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，以重组菌全细胞作为生物催化剂，以甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮作为底物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以重组谷氨酸棒杆菌为催化剂，以甾体化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮作为底物、使用0.3M的碳酸盐缓冲液构建全细胞催化体系，所述全细胞催化体系中重组菌的菌体浓度为OD600＝1.2-1.4，底物的初始浓度为1.0g/L，每小时补加1.0g/L底物，全细胞转化体系pH控制在7.0的范围内，反应温度控制在25-40℃。
6.一种培养权利要求1或2所述重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-kshA-kshB接种于10ML LBG培养基中，30℃振荡培养12h后，取2mL转接于200mL含有浓度为10g/L葡萄糖的LB培养基中，在30℃培养8h后，添加终浓度为0.7mM的IPTG对重组菌的3-甾酮9α-羟基化酶进行诱导表达，诱导10h后离心收集重组菌细胞。
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