CN104232722A

CN104232722A - 微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法

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Publication number: CN104232722A
Application number: CN201410414923.1A
Authority: CN
Inventors: 宋浩雷; 张敏然; 张耀勋; 周利坤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-08-21
Also published as: CN104232722B

Abstract

本发明提出了一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：重组表达载体pMV261-ksh的构建；重组菌株的构建；菌种繁殖及发酵转化。本发明通过基因工程手段获得3-甾酮-9α-羟基化酶基因(ksh)过表达的基因工程菌株，该菌株经过120h发酵可以使植物甾醇的转化率高达95％以上，具有产率高、副产物少、发酵时间短，且提取简单、污染小、环保压力小等特点，极具工业生产的优势。

Description

微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，特别是微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法。

背景技术

9α-羟基雄烯二酮(9α-hydroxy androstenedione)简称9α-OH AD(结构式如下所示)，最早是由诺卡氏菌发酵液中分离得到的一种甾体物质。9α-OH AD可用于合成皮质激素、抗雄性激素、抗***及避孕功能药物，是一种非常重要的甾体激素中间体。

目前用于微生物发酵生产9α-OH AD的底物主要有两种方法：第一种方法是采用诺卡氏菌(Nocardia)、红球菌(Rhodococcus)、棒杆菌(Corynebacterium)及Cylindrocarpon radicicola对底物雄烯二酮(AD)进行9α-羟基化，生成9α-羟基雄烯二酮(9α-OH AD)。如专利“利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法”(公开号CN 103361394A，申请号201310342583.1)公开了一种利用红平红球菌发酵转化4-雄烯二酮生产9α-OH AD的方法，但是该法存在转化率低、产物浓度低、生产成本高等缺陷，使得其不具备工业化生产的优势；另一种方法是利用分枝杆菌或偶发分支杆菌对单一或多种植物甾醇底物进行侧链降解以及9α-羟基化等一系列生化反应生成9α-OH AD。如专利“一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法”(公开号CN 103343155A，申请号201310259697.X)提出了一种利用偶发分枝杆菌ATCC35855为生产菌种，以植物甾醇为底物生产9α-OH AD 的方法，植物甾醇的转化率为60％左右，专利“发酵生产9-OH-AD的耻垢分枝杆菌、菌剂、制备方法和应用”(申请号201310628652.5，公开号CN 103667126A)中诱变得到一株的耻垢分枝杆菌(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013544)，此菌株有效抑制了9α-OH AD的1,2位脱氢，最终9α-OH AD质量收率可达到50-55％。

无论是从发酵工艺对环境的污染，还是从产物收率和纯度来讲，目前已经公开的方法都不适合工业化生产9α-OH AD。

3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体代谢降解途径中的关键酶，其具有两项重要作用：一是KSH能在甾体母核9α为导入羟基；二是作为甾醇微生物降解侧链制备雄甾酮类化合物的关键酶，KSH与3-甾酮-△¹-脱氢酶共同作用使母核开环，最终降解为水和二氧化碳。通过为该基因进行改造可获得生产4-雄烯二酮、1,4-雄烯二酮或9α-羟雄烯二酮等重要甾体药物中间体的基因工程菌。范书玥，魏巍等将分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01中的3-甾酮-9α-羟基化酶基因ksh连接于载体pET32a上，成功构建pET32a-ksh质粒，将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30％以上。其研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。

发明内容

本发明提出了一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，用于解决背景技术中的上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：第一步，重组表达载体pMV261-ksh的构建；第二步，重组菌株的构建；第三步，菌种繁殖及发酵转化。

优选的，第一步中：首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc²155且带有酶切位点的ksh基因；其次，将其与克隆载体pMD-18T连接，以获得该基因的大量克隆；再次，进行双酶切、片段纯化，之后与耻垢分支杆菌表达载体pMV261连接；最后，将得到的连接体系转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到重组质粒。

优选的，酶切位点分别为EcoRI和HindIII。

采用PCR技术，以GENBANK网站上公布的耻垢分枝杆菌mc²155染色体基因组DNA为模板，扩增出带有酶切位点的ksh全序列，以耻垢分枝杆菌mc²155的ksh序列及pMV261质粒上的酶切位点设计引物；

以胶回收方式获得上述PCR产物，并将胶回收产物与pMD18-T质粒连接过夜，之后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组质粒，重组质粒要经过酶切验证，并将正确的质粒命名为pMD18-T-ksh；提取上一步获得重组质粒pMD18-T-ksh及pMV261质粒经EcoRI和HindIII双酶切，胶回收纯化，以T4DNA连接酶过夜连接两片段，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；提取转化子质粒，经酶切验证，命名为pMV261-ksh。

优选的，第二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的重组质粒电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。

优选的，耻垢分枝杆菌感受态细胞的制作方法：

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态；

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mL EP管内、-70℃保藏备用。

将重组质粒电转化于上述方法制备的感受态细胞中，转化条件为：2.5kV、1000Ω、25μF，使用0.2cm电转杯，电转时间为19-21ms。以卡那霉素抗性平板筛选转化子，将挑选出的转化子经PCR验证进一步验证，最终提取转化子中的质粒进行酶切验证导入是否成功，为方便表述，将重组菌株命名为ZS3-9α。

优选的，第三步中，先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀为15-20时，以20-50％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化。

优选的，第三步中发酵转化的条件为：温度25-32℃、发酵初始PH 6.0-8.0、溶氧量20-40％、培养转速150-200rpm、培养周期80-120h。

优选的，种子培养基的组分为：葡萄糖8-15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O 0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，种子培养基的PH为6.0-8.0。

优选的，发酵培养基的组分为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，发酵培养基的PH为6.0-8.0。

优选的，植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1.5-3.0％。

本发明通过基因工程手段获得3-甾酮-9α-羟基化酶基因(ksh)过表达的基因工程菌株，该菌株经过120h发酵可以使植物甾醇的转化率高达95％以上。本方法利用价格低廉的植物甾醇作为底物生产9α-OH AD，产率高、副产物少、发酵时间短，且提取简单、污染小、环保压力小，极具工业生产的优势。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的以下实施例中，为方便表述，将3-甾酮-9α-羟基化酶基因(ksh)过表达的基因工程菌株定义为ZS3-9α；植物甾醇购自西安海斯夫生物科技有限公司，其余各培养基的各组分及各种酶均可商购获得。

以下实施例中的ZS3-9α的制备方法如说明书部分所述：先构建重组表达载体pMV261-ksh，再构建重组菌株。

构建重组表达载体pMV261-ksh的技术方案为：

以胶回收方式获得上述PCR产物，并将胶回收产物与pMD18-T质粒以摩尔比1:10连接过夜，之后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组质粒，重组质粒要经过酶切验证，并将正确的质粒命名为pMD18-T-ksh；提取上一步获得重组质粒pMD18-T-ksh及pMV261质粒经EcoRI和HindIII双酶切，胶回收纯化，以T4DNA连接酶过夜连接两片段，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；提取重组质粒，经酶切验证后命名为pMV261-ksh。

构建重组菌株的技术方案为：

先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的重组质粒电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中，耻垢分枝杆菌感受态细胞的制作方法：

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态细胞；

将重组质粒电转化于上述方法制备的感受态细胞中，转化条件为：2.5kV、1000Ω、25μF，使用0.2cm电转杯，电转时间为19-21ms。以卡那霉素抗性平板筛选转化子，将挑选出的转化子经PCR验证进一步验证，最终提取转化子中的质粒进行酶切验证导入是否成功，为重组菌株ZS3-9α进入如下的应用中。

实施例1

菌种繁殖：将ZS3-9α制备成菌浓度10⁷-10⁹个/ml的菌悬液，之后以5％-10％的接种量接入种子培养基的种子罐中进行培养，种子培养基包括：葡萄糖8g/L、MgSO₄·7H₂O 0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O 0.02g/L、CaCO₃5.5g/L和柠檬酸1.0g/L，种子培养基的pH为7.0；

发酵转化：待种子罐中种子液OD₆₀₀为15-20时，以20％的接种量接入转化培养基中进行培养，发酵培养基包括：葡萄糖30g/L，蛋白胨15g/L，豆饼粉25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.06g/L，CaCO₃4.5g/L，柠檬酸3.0g/L，发酵培养基的pH为7.0；其中，底物植物甾醇添加于配制完毕的基础发酵培养基中，质量分数为2.0％。转化培养条件为：温度25℃、罐压0.05MPa、搅拌150-200rpm、溶氧量40％、周期90h。

测试结果为：最终9α-OH AD的转化率为86.5％。

上述培养基中组分的浓度处于下述范围比较合适，组分浓度与培养基的PH在下述范围内的改变对实验结果的影响不是很大，种子培养基中：葡萄糖8-15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O 0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，种子培养基的PH为6.0-8.0；发酵培养基中：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，发酵培养基的PH为6.0-8.0。

实施例2

将实施例1中发酵转化时菌种的接种量更改为30％，转化培养条件更改为：温度32℃、罐压0.05MPa、搅拌150-200rpm、溶氧量30％、周期100h。

测试结果为：最终9α-OH AD的转化率为93.2％。

实施例3

将实施例1中发酵转化时菌种的接种量更改为50％，植物甾醇的质量分数更改为3.0％，转化培养条件更改为：温度32℃、罐压0.05MPa、搅拌150-200rpm、周期120h。

测试结果为：最终9α-OH AD的转化率为95.8％。

实施例4

将实施例1中植物甾醇的质量分数更改为1.5％，转化培养条件更改为：温度28℃、罐压0.05MPa、搅拌150-200rpm、溶氧量20％、周期80h。

测试结果为：最终9α-OH AD的转化率为90.3％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：

第一步，重组表达载体pMV261-ksh的构建；

第二步，重组菌株的构建；

第三步，菌种繁殖及发酵转化。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第一步中：

首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc²155且带有酶切位点的ksh基因；

其次，将其与克隆载体pMD-18T连接，以获得该基因的大量克隆；

再次，进行双酶切、片段纯化，之后与耻垢分支杆菌表达载体pMV261连接；

最后，将得到的连接体系转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到重组质粒。

3.根据权利要求2所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述酶切位点分别为EcoRI和HindIII。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的重组质粒电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。

5.根据权利要求4所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述耻垢分枝杆菌感受态细胞的制作方法：

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mL EP管内-70℃保藏备用。

6.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中，先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀为15-20时，以20-50％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化。

7.根据权利要求6所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中发酵转化的条件为：温度25-32℃、发酵初始PH 6.0-8.0、溶氧量20-40％、培养转速150-200rpm、培养周期80-120h。

8.根据权利要求6所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：葡萄糖8-15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O 0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，所述种子培养基的PH为6.0-8.0。

9.根据权利要求6所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，所述发酵培养基的PH为6.0-8.0。

10.根据权利要求6所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1.5-3.0％。