CN108586576A - 一种多肽oa-ff10及其提纯方法与应用 - Google Patents

一种多肽oa-ff10及其提纯方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促皮肤创伤愈合的修复多肽OA‑FF10，所述多肽OA‑FF10包含的氨基酸序列如SEQ No.1所示。本发明还公开了所述多肽OA‑FF10的提纯方法和应用。本发明所述皮肤创伤修复肽OA‑FF10可加速体表皮肤的创口愈合，减少疤痕产生，具有广阔的应用前景。

Description

一种多肽OA-FF10及其提纯方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽OA-FF10及其提纯方法与应用。
背景技术
作为人体最大的器官，皮肤可以调节体温并感知周围环境。它能保护体内组织和器官免受物理和化学伤害，以及来自致病微生物的侵害。皮肤的伤口修复过程是复杂和费时的，且任何修复过程的干扰都可能加重病情，并延迟伤口愈合。难治性的伤口也会导致病原体的入侵，导致继发感染、水和电解质紊乱、传染性休克、器官衰竭甚至死亡。为了改善康复过程，并减少在伤口愈合过程中出现的并发症，有效且快速地促进伤口愈合是至关重要的。目前，已知的几种创伤修复药物都存在一定的缺陷，包括稳定性差、活性低、存储成本高、疤痕增生等。因此，功能多样、活性高、稳定性高、特性专一的生物活性肽具有很高的探索价值。
两栖动物作为一种皮肤裸露且栖息地复杂的物种，很容易受到外部伤害，因而，它们形成了一种保护性的皮肤防御***。之前关于两栖动物分泌物的研究已经确定了多种功能多样的生物活性肽，包括抗菌肽、抗氧化肽、伤口愈合肽、细胞因子、神经调节肽和神经毒素等。值得注意的是，两栖动物的皮肤在受损后可以迅速愈合，而且很少留疤，这表明了两栖动物皮肤分泌物中存在某种可以缩短伤口愈合的过程物质。
我们在研究中发现臭蛙可以分泌多种生物活性肽。因此，本发明提供了一种来源于云南臭蛙(Odorrana andersonii)皮肤分泌物的具有促皮肤创伤修复的活性多肽OA-FF10及其提纯方法和应用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种多肽OA-FF10，所述多肽OA-FF10包含的氨基酸序列如SEQ No.1所示。
本发明的第二目的在于提供一种所述多肽OA-FF10的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用电刺激法取云南臭蛙活体皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥，获得皮肤分泌物冻干粉-80℃保存备用；
（2）将所述冻干粉用Sephadex G75排阻层析进行分离；
（3）将步骤（2）的分离产物进行第一次高效液相色谱反相层析，并收集具促创伤修复功能的活性组分；
（4）将所述活性组分进行第二次高效液相色谱反相层析，得到纯化的修复肽OA-FF10。
本发明的第三目的在于提供所述多肽OA-FF10的应用，所述多肽OA-FF10可促进体表皮肤创伤愈合，减少疤痕产生。
本发明的第四目的在于提供一种含有所述多肽OA-FF10的促皮肤创伤愈合的药品。
本发明的第五目的在于提供一种含有所述多肽OA-FF10的护肤品。
附图说明
图1为的第一次HPLC反相C18柱层析图；
图2为多肽OA-FF10的第二次HPLC反相C18柱层析图；
图3 为多肽OA-FF10的动物模型促创伤修复活性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述种皮肤创伤修复肽OA-FF10，来源于云南臭蛙（Odorrana andersonii），所述修复肽OA-FF10包含的氨基酸序列如SEQ No.1所示。
由于所述皮肤创伤修复肽OA-FF10来源于云南臭蛙，本发明提供一种从云南臭蛙活体提纯所述多肽OA-FF10的提纯方法，包括以下步骤：
（1）用电刺激法取云南臭蛙活体皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥，获得皮肤分泌物冻干粉-80℃保存备用；
（2）将所述冻干粉过Sephadex G75分子筛：将皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，配置成100 mg/mL的溶液，取1 mL该溶液上预先用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.8，含0.1 mol/L NaCl）平衡24h的Sephadex G75 (GE Healthcare，超细) 柱子（长度40 cm，内径宽度1.5 cm），用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5 mL/10min，每10 min收集1次，测定其在280 nm下的吸光度；
（3）将过分子筛的产物进行第一次高效液相色谱反相层析，并收集具促创伤修复活性区段产物：将过筛产物上样于预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的Hypersil ODS25mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6 mm ×300 mm），实验仪器为Waters 1525高压液相***，在流速为1 mL/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0-100% in 100min）条件下进行洗脱，监测波长为215 nm。
（4）将所述具促创伤修复活性区段产物进行第二次高效液相色谱反相层析，得到纯化的修复肽OA-FF10：将第一次收集的具有促创伤修复活性峰，真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第一次HPLC过程，得到提纯产物。
除了从云南臭蛙活体上直接提取外，本发明所述的修复肽OA-FF10还可通过人工合成的方法得到。目前生物活性肽的制备方法有很多种，包括保护化学合成法、水解法、重组DNA技术等，这些方法均适用于制备本发明所述的修复肽OA-FF10。
由于本发明所述多肽OA-FF10具有来源天然、活性高、促修复能力强等特点，可用于加速体表皮肤的创口愈合，减少疤痕产生。生产含有所述皮肤创伤修复肽OA-FF10的外用药品、外用护肤品等产品，具有广阔的应用前景。
下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。
实施例1：修复肽OA-FF10的提纯和分子鉴定
1、提纯
云南臭蛙活体采自云南保山，用电刺激法取其皮肤分泌物（溶解于PBS），真空冷冻干燥，-80°保存备用。
将获得将皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，配置成100 mg/mL的溶液，取1mL（蛋白含量为100 mg）上预先用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.8，含0.1 mol/L NaCl）平衡24h的Sephadex G75 (GE Healthcare，超细)柱子（长度40 cm，内径宽度1.5 cm），用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5mLl/10min，每10 min收集1次，测定其在280 nm下的吸光度。
将第一步所得样品上样于预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的HypersilODS2 5mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6 mm ×300 mm），实验仪器为Waters 1525高压液相***，在流速为1 mL/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0-100% in100 min）条件下进行洗脱，监测波长为215nm，所得的分离纯化图谱如图1所示，箭头所指为具有促创伤修复活性峰（OA-FF10存在所示峰）。
收集第一次具有促创伤修复活性峰，真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第一次HPLC过程，所得的分离纯化图谱如图2所示，箭头所指为纯化的OA-FF10所在峰。
2、分子鉴定
纯化得到的修复肽OA-FF10在全自动蛋白质序列测定仪（岛津PPSQ-31A）上经Edman 降解法测定氨基酸全序列，结果如SEQ No.1所示。
实施例2：在动物模型中测定多肽OA-FF10的修复活性
选体重22-25 g的SPF级昆明种小白鼠进行实验，将小鼠随机分成两组，每组10只。首先给小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠（0.1 mL/20g）麻醉小鼠，然后将小鼠背部毛剃除干净，并用75%的酒精消毒，最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小对称的孔,约8mm×8mm大小。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室正常饲养。每天2次上样，每孔每次上样约20 μl，第1组小鼠背部一侧涂生理盐水(Saline)，另一侧涂OA-FF10（100 μM）；第2组小鼠背部一侧涂生理盐水(Saline)，另一侧涂康复新（KFX，10 mg/mL，内蒙古京新药业有限公司，Z15020805）。每2天给小鼠背部创伤拍照，最后通过Image J 软件计算创伤修复率。新型促皮肤创伤修复肽OA-FF10的促创伤修复活性如图3所示。
动物模型试验（图3）结果均表明：本发明所述的皮肤创伤修复肽OA-FF10具有较强的促创伤修复活性。
序列表
<110> 昆明医科大学
<120> 一种多肽OA-FF10及其提纯方法与应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 云南臭蛙（Odorrana andersonii）
<400> 1
Phe Phe Thr Thr Ser Cys Arg Ser Gly Cys
1 5 10

Claims (5)

1.一种多肽OA-FF10，其特征在于，所述多肽OA-FF10包含的氨基酸序列如SEQ No.1所示。
2.一种权利要求1所述多肽OA-FF10的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用电刺激法取云南臭蛙活体皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥，获得皮肤分泌物冻干粉-80℃保存备用；
（2）将所述冻干粉用Sephadex G75排阻层析进行分离；
（3）将步骤（2）的分离产物进行第一次高效液相色谱反相层析，并收集具促创伤修复功能的活性组分；
（4）将所述活性组分进行第二次高效液相色谱反相层析，得到纯化的修复肽OA-FF10。
3.一种权利要求1所述多肽OA-FF10的应用，其特征在于，所述多肽OA-FF10可促进体表皮肤创伤愈合，减少疤痕产生。
4.一种含有权利要求1所述多肽OA-FF10的促皮肤创伤愈合的药品。
5.一种含有权利要求1所述多肽OA-FF10的护肤品。
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