CN108578461B - 紫荆提取物及其提取方法和在制备抗血栓药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种紫荆提取物的提取方法，其特征在于，将紫荆叶用乙醇加热提取，提取液经减压浓缩、干燥得总提取物；总提取物过D101大孔树脂，用0―95%的乙醇‑水混合液梯度洗脱，20%部位拌样后过减压柱，用二氯甲烷‑甲醇混合液梯度洗脱，过Sephadex LH‑20柱，即得紫荆提取物。本发明经试验发现：紫荆提取物具有较好的抗凝血作用，且疗效显著，可用于制备抗血栓药物。

Description

紫荆提取物及其提取方法和在制备抗血栓药物方面的应用
技术领域
本发明属于医药或/和保健品技术领域，具体涉及一种紫荆提取物及其提取方法和在制备治疗抗血栓药物方面的应用。
背景技术
血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性碎死、深静脉血栓等的基本病理过程，它严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附，内源性和外源性凝血***以及纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血***，最后导致血栓形成。一旦堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊状态下，需要辅助使用抗血栓药物，才能达到更好的抗血栓效果。
紫荆（Cercis chinensis）为豆科紫荆属植物，在亚洲东部、欧洲南部和北美等均有分布，在中国，紫荆主要分布在东南部，主要为观赏植物。《中药大辞典》记载，紫荆具有活血行气、清热解毒、消肿止痛等功效；紫荆花可用于治疗风湿骨痛、鼻中疳疮；紫荆果可治疗咳嗽。国内外对紫荆叶化学及生物活性的研究报道极少。目前，尚没有紫荆叶对大鼠血栓治疗的相关报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于治疗功能血栓的紫荆提取物，其治疗效果显著。
本发明还提供了上述紫荆提取物的提取方法及其在制备治疗血栓药物方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种紫荆提取物的提取方法，其将紫荆叶用乙醇加热提取，提取液经减压浓缩、干燥得总提取物；总提取物过D101大孔树脂，用0―95%的乙醇-水混合液梯度洗脱，20%部位拌样后过减压柱，用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，过Sephadex LH-20柱，即得紫荆提取物。
进一步优选的，上述紫荆提取物的提取方法，具体为：将干燥紫荆叶用65―75%乙醇于45―55℃加热提取2―4次，每次提取2―4h，合并提取液并经减压浓缩、干燥得总提取物；总提取物过D101大孔树脂，用0―95%的乙醇-水混合液梯度洗脱，20%部位拌样后过减压柱，用体积比为10:1―3:1的二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，5:1部位过Sephadex LH-20柱，即得紫荆提取物。
本发明提供了采用上述提取方法制备得到的紫荆提取物。
本发明还提供了上述紫荆提取物在制备抗血栓药物方面的应用。紫荆提取物的具体用量可以是：2.5mg/kg、5 mg/kg。
紫荆（Cercis chinensis）为豆科紫荆属植物，在中国，紫荆主要分布在东南部，主要为观赏植物。《中药大辞典》记载，紫荆具有活血行气、清热解毒、消肿止痛等功效；紫荆花可用于治疗风湿骨痛、鼻中疳疮；紫荆果可治疗咳嗽。国内外对紫荆叶化学及生物活性的研究报道极少。目前，尚无紫荆提取物对大鼠血栓治疗的报道。本发明通过测定紫荆提取物对大鼠抗血栓的各项生化指标，考察其治疗抗血栓的效果。体外实验表明，与模型组相比， 活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）均显著延长，纤维蛋白原（FIB）显著缩短；大鼠体内试验表明，紫荆提取物中（5 mg/mL）、低（2.5 mg/mL）剂量组可以延长活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT），升高6酮***素F1α6-Keto-PGF1α、一氧化氮合酶（eNOS），降低纤维蛋白原（FIB）、血栓烷B2（TXB2）、内皮素-1（ET-1）、血沉（ESR）、红细胞比积（PCV）、全血粘度（WBV）和血浆粘度（PV）。说明紫荆提取物具有较好的抗凝血作用，且疗效显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。下述实施例中，所用乙醇浓度无特殊说明，均指的是体积浓度。
实施例1
一种紫荆提取物的提取方法，具体为：将干燥紫荆叶4.5k g用45 L浓度70%的乙醇于50℃加热提取3次，每次提取3h，提取结束后，合并提取液并经减压浓缩、干燥得总提取物。总提取物用水溶解过D101大孔树脂，用0、20%、40%、60%、95%的乙醇-水混合液梯度洗脱，20%部位用硅胶拌样后过减压柱，用体积比为10:1、8:1、5:1、3:1的二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，5:1部位用甲醇溶解，过Sephadex LH-20柱纯化，得紫荆提取物0.9g。
应用试验。
一、试验动物。
SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重200-220 g。动物购买于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK（豫）2015-0004。
二、仪器和材料
HF6000-4半自动凝血分析仪、HT-100C血流变粘度测试仪、TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；香丹注射液（吉林省集安益盛药业股份有限公司，批号:15062503）；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒(105262)；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒(1121781);凝血酶时间（TT）测定试剂盒(121151)；纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒(132079)均由上海太阳生物技术有限公司生产；大鼠 6-酮***素 F1α（6-KETO-PGF1α）酶联免疫分析试剂盒（201707）；大鼠血栓素 B2（TXB2）酶联免疫分析试剂盒（201707）；大鼠内皮型一氧化氮合成酶（e NOS）酶联免疫分析试剂盒（201707）；大鼠内皮素 1（ET-1）酶联免疫分析试剂盒（201707），均由南京建成生物工程研究所提供。
三、 统计学处理。
采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)对数据进行统计处理。
四、大鼠急性血瘀模型的建立。
雌雄各半的SD大鼠，随机分为6组，每组8只。分别为空白对照组、模型组、阳性对照组（香丹注射液）和紫荆提取物高（10 mg/kg）、中（5 mg/kg）、低（2.5 mg/kg）3个给药组。连续尾静脉给药7天，每天1次。空白对照组和模型组给予相应的空白溶剂（DMSO：聚山梨酯80：生理盐水=5%：3%：92%），阳性对照组给予香丹注射液（3.6 mL/kg），给药组分别给予相应的药物，第6天开始造模，方法如下：
大鼠皮下注射盐酸肾上腺素注射液（0.8mg/kg）2h后，将大鼠置于0~2℃冰水中游泳5 min，造成大鼠急性血瘀模型。4 h后，进行第二次皮下注射盐酸肾上腺素，然后大鼠开始禁食不禁水饲养，在相应的时间第6次给药。最后一次注射盐酸肾上腺素16 h 进行最后一次给药，30 min后用10 %水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，于腹主动脉取血，其中1 mL的血液于道夫管中，室温下自然凝固20 min，3000 r/min离心20 min，收集上清液，用于测量eNOS， ET，6-keto-PGF1α，TXB2，2 mL的血液收集于肝素钠真空管中，用于测量WBV和PV，3mL的血液收集于柠檬酸钠真空管中，3000 r/min 离心15分钟，收集上清液用于测量APTT、PT、TT和FIB。2 mL的血液用柠檬酸钠抗凝(9:1)用于测量 ESR和PCV。
五、 紫荆提取物给药治疗。
表1紫荆提取物体内凝血四项的实验结果（数据代表平均值±SD. n=8.）
Figure 810155DEST_PATH_IMAGE001
与空白对照组对比: *** p<0.001, or, 0.001< ** p<0.01,
与模型组相比: ### P<0.001, 0.001< ## P<0.01, # P<0.05,
与香丹注射液相比: &&& P<0.001, 0.001< && P<0.01, & P<0.05.
体内凝血四项实验研究表明，与空白对照组相比，模型组APTT、PT、TT均显著的缩短（0.001<p<0.01, p<0.001, p<0.001），FIB浓度升高（0.001<p<0.01），表明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，香丹注射液、紫荆提取物（10 mg/kg）和紫荆提取物（5 mg/kg）均能极显著（P<0.001）的延长APTT、PT、TT以及极显著（P<0.001）的升高FIB浓度。但是紫荆提取物（10 mg/kg）和紫荆提取物（5 mg/kg）的效果不如香丹注射液。
表2 紫荆提取物对 TXB2 和 6-Keto-PGF1α 的作用（数据代表平均值± SD. n=8）
Figure 18414DEST_PATH_IMAGE002
与空白相比: *** p<0.001, or, 0.001< ** p<0.01,
与模型组相比: ### p<0.001, or, # p<0.05.
表2表明，与空白对照组相比，模型组大鼠的TXB2水平极显著（p<0.001）的升高，6-Keto-PGF1α极显著（p<0.001）的降低，TXB2/6-Keto-PGF1α的比值极显著（p<0.001）的升高，表明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，紫荆提取物（5 mg/kg）和紫荆提取物（2.5mg/kg）可以极显著（p<0.001）的降低TXB2，TXB2/6-Keto-PGF1α的比值和极显著（p< 0.001）的升高6-Keto-PGF1α，而紫荆提取物（10mg/kg）与模型组相比无显著性差异，表明紫荆提取物（5 mg/kg）和紫荆提取物（2.5mg/kg）具有较好的抗凝血效果，其效果与阳性对照香丹注射液相当。
表3紫荆提取物对ET-1 和eNOS 的作用（数据代表平均值± SD. n=8）
Figure 832786DEST_PATH_IMAGE003
与空白相比: *** p<0.001, or, 0.001< ** p<0.01，or, * p<0.05,
与模型组相比： ### p<0.001, # p<0.05, 与阳性对照相比: $ p<0.05.
表3表明，与空白对照组相比，模型组大鼠ET-1极显著（p<0.001）的升高，eNOS极显著（p<0.001）的降低，表明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，除了紫荆提取物（10mg/kg）对ET-1与模型组无显著性差异外，其余均能极显著的降低(p<0.001) ET-1水平和极显著(p<0.001)的升高eNOS。紫荆提取物（5mg/kg）和紫荆提取物（2.5mg/kg）的效果好于香丹注射液。
表4 紫荆提取物对ESR 和 PCV的作用（数据代表平均值± SD. n=8）
Figure 655249DEST_PATH_IMAGE004
与空白对照相比: *** p<0.001, or, 0.001< ** p<0.01，or, * p<0.05,
与模型组相比: ### p<0.001, or, 0.001< ## p<0.01，or , # p<0.05.
表4表明，与空白对照组相比，模型组的ESR和PCV均显著的升高（0.001<p<0.01, p <0.05），表明造模成功。紫荆提取物（10 mg/kg）对ESR和PCV 的作用与模型组相比无显著性差异，紫荆提取物（5 mg/kg）和紫荆提取物（2.5 mg/kg）与模型组相比均能显著的降低ESR（P<0.05）和PCV（0.001<p<0.01, p<0.001），其效果与阳性对照相当。
表5紫荆提取物对 WBV 和PV的作用（数据代表平均值± SD, n=8）
Figure 922282DEST_PATH_IMAGE005
与空白对照相比: *** p<0.001, or, 0.001< ** p<0.01，or, * p<0.05,
与模型组相比: ### p<0.001, or, 0.001< ## p<0.01， # p<0.05,
与阳性对照相比: 0.001<$$ p<0.01, $ p<0.05.
表5显示，与空白对照组相比，模型组大鼠的WBV的各个切变频率和PV均极显著（p< 0.001）的升高，表明大鼠急性血瘀模型造模成功。紫荆提取物（10 mg/kg）对WBV和PV的影响与模型组无显著性差异（P>0.05）；紫荆提取物（5 mg/kg）和紫荆提取物（2.5 mg/kg）与模型组相比使全血粘度在各切变频率下均显著（p<0.001, 0.001<p<0.01）地降低和显著降低PV（(p<0.05），但效果不如阳性对照。
结论：紫荆提取物中、低剂量组对血栓具有治疗作用，具备开发成药物的潜在价值。

Claims (1)

1.一种紫荆提取物在制备抗血栓药物方面的应用，其特征在于，所述紫荆提取物经下述方法提取获得：将干燥紫荆叶用70%乙醇于45―55℃加热提取2―4次，每次提取2―4h，合并提取液并经减压浓缩、干燥得总提取物；总提取物过D101大孔树脂，用0―95%的乙醇-水混合液梯度洗脱，20%部位拌样后过减压柱，用体积比为10:1―3:1的二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，5:1部位过Sephadex LH-20柱，即得紫荆提取物。
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