CN108562633B - 一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法，所述光电化学传感器包括：电极，修饰在电极表面的WS2纳米片和DNA适配体；所述DNA适配体和WS2纳米片紧密接触。本发明利用DNA核酸适配体与磺胺地索辛的特异性识别作用，以DNase I催化的信号等温扩增，实现了对目标化合物磺胺地索辛的特异性和灵敏性检测，为环境监测、食品安全等领域提供了新的方法。

Description

一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法。
背景技术
磺胺地索辛属于磺胺类抗生素，有很强的抗细菌及原虫感染的作用，可用于上呼吸道及***，目前广泛用于畜禽疾病的治疗和预防；此外，它对畜禽生长有促进作用，又作为饲料添加剂被广泛应用。由于存在滥用和不遵守休药期的使用，造成了磺胺地索辛在动物性食品中有一定的残留，对食品卫生和人体健康具有潜在危害性。
磺胺地索辛目前的检测方法主要是超高效液相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、荧光免疫分析法等。但是，这些方法有检测灵敏性低、检测特异性不强，检测成本高，仪器昂贵且操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的方法，用于磺胺地索辛的临床诊断和食品安全分析，是至关重要的。
光电化学过程是指具有光电活性的物质吸收光子，使电子处于激发态而产生的电荷传递过程。光电化学适配体分析是建立在光电化学传感与适配体对靶分子的特异识别技术基础上的一种新型分析方法。目前还未见有采用光电化学分析方法对磺胺地索辛进行检测的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法，实现了对磺胺地索辛的高特异性和高灵敏性检测，为环境监测、食品安全等领域提供了新的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器，包括：电极，修饰在电极表面的WS2纳米片和DNA适配体；
所述DNA适配体和WS2纳米片紧密接触。
优选的，所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供上述光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对电极进行预处理；
(2)将WS2纳米片修饰到电极表面；
(3)将DNA适配体滴加到WS2纳米片修饰的电极表面，湿润条件下静置反应1-小时，即得。
优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗，再用丙酮和二次水清洗，晾干。
优选的，步骤(1)中，所述电极为ITO电极。
优选的，步骤(2)中，将WS2纳米片修饰到电极表面的操作为：将WS2纳米片加入到去离子水中，制成WS2纳米片水分散液，滴涂于电极表面，红外灯照射干燥。
优选的，步骤(3)中，所述湿润条件是指湿度为99％。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学传感器检测磺胺地索辛的方法，包括以下步骤：
(1)将不同浓度的磺胺地索辛和DNase I滴加到光电化学传感器表面，孵育，进行磺胺地索辛和DNA适配体的结合，以及DNase I催化水解DNA适配体，释放磺胺地索辛，进行循环的结合-水解反应；
(2)通过建立光电流和磺胺地索辛浓度的关系曲线对磺胺地索辛进行检测。
优选的，步骤(1)中，孵育条件为：37℃和99％湿度条件下静置反应2小时。
优选的，步骤(2)中，光电流和磺胺地索辛浓度的关系曲线为：I＝89.49logc+380，其中，I为光电流，单位nA；c为磺胺地索辛浓度，单位nmol/L；R＝0.9962，线性范围为10nmol/L–1pmol/L。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测方法简单，仅在ITO电极表面进行三次修饰，即可进行磺胺地索辛的检测。
(2)本发明的光电化学传感器实现了仪器小型化，且易于操作，检测费用低。
(3)本发明的检测非常高的检测灵敏性，检测限可达pmol/L；而且，本发明是基于磺胺地索辛和其DNA适配体的特异性的结合作用，具有很高的检测选择性。
附图说明
图1：本发明检测方法的原理示意图。
图2：WS2剥离前后的透射电镜对比图谱；(A)剥离前；(B)剥离后。
图3：不同修饰电极的电化学阻抗谱图；(a)ITO，(b)WS2/ITO，(c)DNA/WS2/ITO，(d)DNA-C/WS2/ITO。
图4：不同修饰电极的光电响应曲线；(a)ITO，(b)WS2/ITO，(c)DNA/WS2/ITO，(d)DNA-C/WS2/ITO。
图5：不同磺胺地索辛浓度下的光电响应曲线；曲线a-i代表的浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10nmol/L的磺胺地索辛。
图6：光电流与磺胺地索辛浓度的线性拟合曲线。
图7：不同抗生素条件下的光电响应的柱状图，抗生素浓度均为1nmol/L；ΔI＝I2-I1。I2为DNA-C/WS2/ITO的光电流(DNA-C/WS2/ITO在此处是指滴加有不同种类抗生素的DNA/WS2/ITO电极)，I1为DNA/WS2/ITO的光电流。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，目前磺胺地索辛的检测方法普遍存在检测灵敏性低、检测特异性不强，检测成本高，仪器昂贵且操作复杂，需要专业操作人员等缺点。基于此，本发明的目的是提供一种简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的磺胺地索辛检测方法。
本发明是基于DNA核酸适配体、WS2纳米片和DNA酶催化的等温循环扩增的光电化学方法，实现对磺胺地索辛的灵敏检测。本发明的检测原理为：先将硫化钨纳米片滴涂于玻碳电极表面，再将DNA核酸适配体吸附于电极表面。由于DNA适配体与WS2纳米片紧密接触，阻碍了DNase I对DNA的水解，而DNA对WS2纳米片的光电化学活性具有抑制作用，使得电极的光电流降低。但是，当存在核酸适配体的靶分子磺胺地索辛时，磺胺地索辛与DNA适配体结合，使DNA适配体从WS2纳米片表面解吸附，使得DNA适配体可以被DNase I水解，从而释放磺胺地索辛。而释放的磺胺地索辛又可以与电极表面的DNA适配体结合，从而触发一系列的解吸-水解-解吸-水解过程，使电极表面的DNA适配体数量显著减少，光电流明显增强。本发明利用DNA核酸适配体与磺胺地索辛的特异性识别作用，以DNase I催化的信号等温扩增，实现了对目标化合物磺胺地索辛的特异性和灵敏性检测(图1)。
本发明首先设计了一个用于磺胺地索辛检测的光电化学传感器，所述光电化学传感器是在ITO电极表面修饰有WS2纳米片和DNA适配体；其中，DNA适配体为磺胺地索辛的核酸适配体，能够与磺胺地索辛特异性的结合，其碱基序列如下：
5′-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3′；(SEQ ID NO.1)
利用本发明设计的光电化学传感器可以对磺胺地索辛进行检测，检测方法如下：
(1)将不同浓度的磺胺地索辛溶液和DNase I等体积混合均匀，滴加到修饰电极(修饰有WS2纳米片和DNA适配体)表面，孵育，进行磺胺地索辛和DNA适配体的结合，以及DNase I催化水解DNA适配体，释放磺胺地索辛，进行循环的结合-水解反应。
(2)进行光电化学检测，建立光电流与磺胺地索辛浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中磺胺地索辛的含量进行检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中，WS2纳米片采用超声辅助化学剥离法制备。前驱体WS2粉体材料和磺胺地索辛购自美国Sigma-Aldrich公司。化学剥离试剂胆酸钠以及其他抗生素均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
实施例1：用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器的制备
1.电极预处理：
首先将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，并用乙醇/NaOH混合液(1:1)超声清洗30分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30min，并在室温下晾干，待用。
2.WS2纳米片的制备：
采用超声辅助化学剥离法制备WS2纳米片。称取1克WS2粉体材料，加入到200mL去离子水中，超声分散30分钟，得到WS2水分散液。然后将2克胆酸钠加入到WS2水分散液中，搅拌30分钟。随后，将该分散液超声波处理24小时。3000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集溶液。将收集的溶液在12000转/分钟条件下离心，收集沉淀。将沉淀用去离子水洗涤三次，于60℃真空干燥。WS2剥离前后的透射电镜对比图谱如图2所示。
3.WS2纳米片水分散液制备：
称取40mg WS2纳米片，加入到10mL去离子水中，超声分散30分钟，得到浓度为4mg/mL的WS2纳米片的分散液。
4.WS2修饰电极的制备：
将10微升4mg/mL的WS2纳米片的分散液滴加到预处理好的ITO电极表面于红外等灯下干燥。用10mmol/L的Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液洗涤后，得到WS2纳米片修饰的ITO电极，标记为：WS2/ITO。
5.DNA适配体固定：
利用WS2具有吸附DNA的性质，将10微升1μmol/L的DNA适配体滴到WS2/ITO表面，在37℃的温度下于湿润环境(湿度99％)中静置反应2小时。用10mmol/L的Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液洗涤后，将得到的适配体修饰的电极标记为：DNA/WS2/ITO。即制备得到用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器。
实施例2：磺胺地索辛的检测
1.磺胺地索辛与适配体结合反应，以及DNase I催化的等温扩增反应：
将不同浓度的磺胺地索辛溶液与100unit/mL的DNase I溶液等体积混合均匀。然后，将10微升该混合溶液滴加到DNA/WS2/ITO电极表面，在37℃的温度下于湿润环境(湿度99％)中静置反应2小时。用10mmol/L的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液洗涤后，将得到的电极标记为：DNA-C/WS2/ITO。
2.光电化学检测：
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流与磺胺地索辛浓度之间的关系，线性范围为10nmol/L–1pmol/L，校正曲线为I＝89.49logc+380(nA，nmol/L，R＝0.9962)，检出限为0.31pmol/L。
3.稳定性实验：
采用相同的方法以及检测条件，以DNA-C/WS2/ITO为工作电极检测1nmol/L的磺胺地索辛，得到的相对便准偏差为4.38％，说明该方法有很好的重现性。用一支DNA-C/WS2/ITO电极连续进行10次检测，得到的相对标准偏差为3.28％，说明该方法具有很好的重现性。将DNA-C/WS2/ITO传感器在4℃下存放2周，得到电流响应为原始相应的94.38％，意味着该方法有很好的稳定性。
4.检测选择性实验：
分别将不同种类的抗生素溶液(浓度均为1nmol/L)与100unit/mL的DNase I溶液等体积混合均匀。然后，将10微升该混合溶液滴加到DNA/WS2/ITO电极表面，在37℃的温度下于湿润环境中静置反应2小时。用10mmol/L的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液洗涤后，即制得修饰有不同种类抗生素的电极(DNA-C/WS2/ITO)。进行光电化学检测，测试不同抗生素条件下的光电响应情况，结果如图7所示。
由图7可以看出，本发明能特异性的检测磺胺地索辛，具有很好的检测选择性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器及其检测方法
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA适配体
<400> 1
gagggcaacg agtgtttata ga 22

Claims (7)

1.一种用于检测磺胺地索辛的光电化学传感器，其特征在于，包括：电极，修饰在电极表面的WS2纳米片和DNA适配体；
所述DNA适配体和WS2纳米片紧密接触；
所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述光电化学传感器由以下步骤制备而成：
(1)对电极进行预处理；
(2)将WS2纳米片修饰到电极表面：将WS2纳米片加入到去离子水中，制成WS2纳米片水分散液，滴涂于电极表面，红外灯照射干燥；
(3)将DNA适配体滴加到WS2纳米片修饰的电极表面，湿润条件下静置反应1-3h，即得；
所述WS2纳米片由如下方法制备而成：
称取WS2粉体材料，加入到去离子水中，超声分散，得到WS2水分散液；然后将胆酸钠加入到WS2水分散液中，搅拌；随后，将该分散液超声波处理，离心，弃去沉淀，收集溶液；将收集的溶液离心，收集沉淀，将沉淀用去离子水洗涤，真空干燥。
2.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗，再用丙酮和二次水清洗，晾干。
3.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于步骤(1)中，所述电极为ITO电极。
4.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，步骤(3)中，所述湿润条件是指湿度为99％。
5.利用权利要求1-4任一项所述的光电化学传感器检测磺胺地索辛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将不同浓度的磺胺地索辛和DNase I滴加到光电化学传感器表面，孵育，进行磺胺地索辛和DNA适配体的结合，以及DNase I催化水解DNA适配体，释放磺胺地索辛，进行循环的结合-水解反应；
(2)通过建立光电流和磺胺地索辛浓度的关系曲线对磺胺地索辛进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，孵育条件为：37℃和99％湿度条件下静置反应2h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，光电流和磺胺地索辛浓度的关系曲线为：I＝89.49logc+380，其中，I为光电流，单位nA；c为磺胺地索辛浓度，单位nmol/L；R＝0.9962，线性范围为10nmol/L–1pmol/L。
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