CN109828006B - 一种检测甲基化rna的光电化学传感器及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测甲基化RNA的光电化学传感器及其检测方法，所述光电化学生物传感器，包括：电极，依次修饰在电极表面的硫化钨、纳米金、巯基苯硼酸、m6A抗体、甲基化RNA，混合了UTP的poly(U)聚合酶和Ru(NH3)6 3+。本发明利用WS2良好的光电活性和生物兼容性，纳米金良好的生物兼容性和导电性，抗体对抗原的特异性识别性能，以及用Poly(U)聚合酶延长RNA序列和Ru(NH3)6 3+作为信号扩大单元，实现对甲基化RNA的高灵敏性和高特异性检测。本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，即可实现对甲基化RNA的检测。
Description
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，特别是涉及一种检测甲基化RNA的光电化学传感器及其检测方法。
背景技术
在表观遗传领域中，RNA甲基化是非常重要的一个部分。在众多RNA甲基化的修饰中，N6-甲基腺苷(m6A)是信使RNA(mRNA)中最常见的修饰。许多证据表明，m6A的动态调节可能对基因表达调控产生深远的影响。根据最近的发现，m6A甲基化在发育、生育、致癌、减数***和昼夜周期等多种生理过程中也发挥着重要和广泛的作用，并与肥胖、癌症等人类疾病有关。尽管m6A的重要性已得到明确证实，但由于缺乏稳健的分析方法，在评估m6A含量方面的进展受到很大影响。因此，需要尽快开发有效且快速的m6A检测方法。
到目前为止，已经有人陆续研究出了一些m6A的检测方法，例如薄层色谱、气相色谱、柱液相色谱、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等。然而上述检测技术基本都需要32P标记或其他放射性元素标记，还需要精密复杂的仪器，样品前处理繁琐，需要专业的操作人员，检测灵敏性较低和特异性不强等缺点。因此，建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的方法，用于m6A的检测，是至关重要的。
光电化学传感器是一种以光活性材料的光与电之间转化特性为基础而建立起来的新颖的分析检测技术。待检测物质与光电化学活性物质之间的直接或者间接的相互作用，或者生物识别过程前后所产生的光电流(或光电压)的变化与待检测物质浓度之间的关系，是光电化学传感定量的基础。传感器是用光信号作为激发源，检测的是电信号，具有检测速度快、易于微型化、操作简单、仪器简单和背景信号低等优点。光活性材料是光电化学传感器中最重要的一部分，如何建立光活性材料与待检测物质之间的作用关系，以提高光活性材料的光电活性的灵敏度是光电化学检测的难点所在。目前还未见有基于WS2和Poly(U)聚合酶的光电化学传感器检测甲基化RNA的报道。
发明内容
针对上述现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种检测甲基化RNA的光电化学传感器及其检测方法，实现了对甲基化RNA的高特异性和高灵敏性检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种光电化学传感器，所述光电化学传感器以经多重修饰的Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极为工作电极；所述工作电极由如下方法制备而成：
以ITO电极为基础电极，对基础电极进行预处理，然后在预处理后的基础电极表面依次修饰硫化钨、纳米金、对巯基苯硼酸、m6A抗体、甲基化RNA，混合了UTP的poly(U)聚合酶和Ru(NH3)6 3+。
优选的，基础电极的预处理方法为：将基础电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗30分钟，再去离子水清洗，然后用丙酮超声清洗30分钟，最后用去离子水清洗，晾干。
未经预处理的电极上一般会有较大的过电势，从而导致反应迟钝、能耗升高。为了发挥电极的优势，提高电极的活性，需要对电极表面进行预处理。采用本发明的电极预处理方法可以降低的电极过电势，从而有效提高电极的活性。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰硫化钨的方法为：将硫化钨用去离子水制成硫化钨分散液，将硫化钨分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干。
更优选的，所述硫化钨分散液的浓度为0.1-5mg/ml。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰纳米金的方法为：将纳米金溶液滴加到修饰有硫化钨的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干。
本发明主要利用的是纳米金良好的生物兼容性和导电性，对纳米金溶液的来源不做特别的限定。所述纳米金溶液可以为现有的市售产品(例如：吉仓纳米生产的纳米金溶液，采用粒径15nm以下的纳米金粒子分散到水溶液中，形成色着稳定均匀的中性溶液)；也可以以HAuCl4为原料采用现有的方法制备纳米金，再将其分散到水溶液中。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰对巯基苯硼酸的方法为：将对巯基苯硼酸溶液滴加到修饰有纳米金的电极表面，在室温和潮湿条件下反应1.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰m6A抗体的方法为：将m6A抗体溶液滴加到修饰有对巯基苯硼酸的电极表面，在室温和潮湿条件下反应9-19h，然后清洗3-6次。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰甲基化RNA的方法为：将甲基化RNA溶液滴加到修饰有m6A抗体的电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰混合了UTP的poly(U)聚合酶的方法为：将含有10-40U/mL poly(U)聚合酶and 1-5mM UTP的缓冲液滴加到修饰有甲基化RNA的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
优选的，在预处理后的基础电极表面修饰Ru(NH3)6 3+的方法为：将含有0.5-2mg/mL的[Ru(NH3)6]3+缓冲液滴加到修饰有混合了UTP的poly(U)聚合酶的电极表面，25-55℃和潮湿条件下反应0.5-3.5h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
本发明的第二方面，提供上述光电化学传感器在检测甲基化RNA中的应用。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学传感器检测甲基化RNA的方法，包括以下步骤：
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源，以光电化学传感器的Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有0.1M KCl的10mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，建立电流与甲基化RNA浓度之间的关系，对甲基化RNA含量进行检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测方法简单，仅在ITO电极表面进行6次简单的修饰，即可进行甲基化RNA的检测。
(2)本发明的光电化学传感器实现了仪器小型化，且易于操作，检测费用低。
(3)本发明的检测非常高的检测灵敏性，检测限可达2.67pM；而且，本发明是基于甲基化RNA和其抗体的特异性识别作用，具有很高的检测选择性。
附图说明
图1：本发明的光电化学传感器组装示意图。
图2：光电流与甲基化RNA浓度的线性拟合曲线。
图3：不同核苷酸条件下的光电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中涉及的甲基化RNA序列如下：
5'-P-UUG CAA UGA AGG GUG CUC AGG AmCU-3'；(SEQ ID NO.1)
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。
本发明中所使用的清洗液的成分为：3-15mMTris-HCl和20-60mMKCl，pH 7.4。
本发明中所使用的m6A抗体缓冲液的成分为：5-30mMPBS，pH 6.0-8.5。
本发明中所使用的含有poly(U)聚合酶和UTP的缓冲液的成分为：4-18mMTris-HCl，8-60mMNaCl，8-20mM MgCl2，0.5-3mM DTT，pH 6.0-8.5。
本发明中所使用的检测液为：5-40mMTris-HCl、0.05-0.28M KCl和0.05-0.2M抗坏血酸(AA)，pH为5.4-8.5。
正如背景技术部分所介绍的，RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA的寿命和降解等方面可能扮演重要角色，其甲基化机理、位点预测和差异表达研究，有助于进一步揭示细胞发育、疾病等生物学现象，帮助药物研发者设计出调节基因表达、杀死或控制疾病细胞的小分子，但是由于DNA以及RNA的甲基化并不影响碱基的互补配对，因此在甲基化RNA检测中并不适合用常规的测序方法。
本申请发明人在前期研究中基于g-C3N4-CdS QDs、酶催化、Ru@SiO2、辣根过氧化物模拟酶催化以及BiVO4@TiO2等材料制备了5种PEC生物传感器，实现了对DNA甲基转移酶、m6A以及HENMTI快速灵敏的检测。光活性材料是光电化学传感器中最重要的一部分，如何建立光活性材料与待检测物质之间的作用关系，以提高光活性材料的光电活性的灵敏度是光电化学检测的难点所在。因此，开发新的光活性材料以及建立新的光活性材料与待检测物质之间的作用关系具有十分重要的意义。
本发明首次提出了一种基于WS2和Poly(U)聚合酶的光电化学传感器检测甲基化RNA的方法，实现了对甲基化RNA的高特异性和高灵敏性检测。
本发明的检测甲基化RNA的光电化学传感器的构建及检测原理如图1所示，以ITO电极为基体电极，利用ITO电极表面的含氧集团与硫化钨之间的静电吸附力，将硫化钨修饰到电极表面。再利用硫化钨与纳米金之间的物理吸附作用，将纳米金修饰到电极表面。然后，通过对巯基苯硼酸的巯基与纳米金之间的Au-S键合作用，将巯基苯硼酸修饰到电极表面。接着利用硼酸基团与m6A抗体中的糖苷反应连接抗体。通过抗原与抗体的特异性识别作用识别甲基化RNA。利用poly(U)聚合酶将UTP延长到甲基化RNA的序列上。最后，利用甲基化RNA延长后的序列上的负电荷与Ru(NH3)6 3+的正电荷之间的静电相互作用，将Ru(NH3)6 3+修饰到电极表面，得到制备的传感器。Ru(NH3)6 3+可明显提高传感器的光电响应，从而提高检测灵敏度。因此，利用甲基化RNA的浓度与光电流的线性关系，可实现对甲基化RNA的检测。
在本发明的一种实施方案中，给出的光电化学传感器的构建方法如下：
(1)硫化钨分散液的制备：称取10-20mg硫化钨，加入到去离子水中，超声分散1-3小时，制成浓度为0.4-5mg/ml的硫化钨分散液。
(2)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(体积比例为1:1-1:6)超声清洗30-60分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30-60分钟，并在室温下晾干，待用。
(5)硫化钨的固定：将25-76μL硫化钨分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为WS2/ITO。
(4)纳米金的修饰：将16-55μL纳米金溶液滴加到WS2/ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为AuNPs/WS2/ITO。
(5)对巯基苯硼酸固定：将23-54μL浓度为2.3-6.8mM对巯基苯硼酸溶液滴加到AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(6)m6A抗体的固定：将5-25μL含有5μg/mL m6A抗体的缓冲液滴加到MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应9-19小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(8)甲基化RNA的修饰：将12-47μL含有不同浓度的甲基化RNA溶液滴加到Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(9)甲基化RNA序列的延长：将20-60μL含有10-40U/mL poly(U)聚合酶and 1-5mMUTP的缓冲液滴加到RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(10)[Ru(NH3)6]3+的固定：将15-62μL含有0.5-2mg/mL的[Ru(NH3)6]3+溶液滴加到U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，25-55℃和潮湿条件下反应0.5-3.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
上述光电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败，各步骤间具有协同促进作用。本发明利用WS2良好的光电活性和生物兼容性，纳米金良好的生物兼容性和导电性，抗体对抗原的特异性识别性能，以及用Poly(U)聚合酶延长RNA序列和Ru(NH3)6 3+作为信号扩大单元，实现对甲基化RNA的高灵敏性和高特异性检测。
在本发明的另一种实施方案中，给出了利用上述光电化学传感器检测甲基化RNA的方法，包括以下步骤：
(1)将不同浓度的甲基化RNA滴加到m6A抗体/对巯基苯硼酸/纳米金/WS2修饰的ITO电极表面，孵育，利用抗原与抗体的特异性识别作用识别甲基化的RNA，再利用poly(U)聚合酶延长后的甲基化RNA的序列的负电荷与Ru(NH3)6 3+的正电荷之间的静电相互作用，进行信号放大；
(2)通过建立光电流和甲基化RNA浓度的关系曲线对甲基化RNA进行检测。
需要说明的是，上述检测方法为非疾病诊断方法。在非疾病诊断方面，可以通过检测甲基化RNA的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：检测甲基化RNA的光电化学传感器的构建
(1)硫化钨分散液的制备：称取硫化钨加入到去离子水中，超声分散2小时，制成浓度为2.5mg/ml的硫化钨分散液。
(2)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(体积比例为1:3)超声清洗60分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30分钟，并在室温下晾干，待用。
(5)硫化钨的固定：将50μL硫化钨分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为WS2/ITO。
(4)纳米金的修饰：将16-55μL纳米金溶液滴加到WS2/ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为AuNPs/WS2/ITO。
(5)对巯基苯硼酸固定：将30μL浓度为5.0mM对巯基苯硼酸溶液滴加到AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应2.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(6)m6A抗体的固定：将15μL含有5μg/mL的抗体溶液滴加到MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应12小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(8)甲基化RNA的修饰：将30μL含有不同浓度的甲基化RNA溶液滴加到Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，35℃和潮湿条件下反应2.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(9)甲基化RNA序列的延长：将40μL含有25U/mL poly(U)聚合酶和3mM UTP的缓冲液滴加到RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
(10)[Ru(NH3)6]3+的固定：将45μL含有0.1mg/mL的[Ru(NH3)6]3+溶液滴加到U-richRNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极表面，45℃和潮湿条件下反应2.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO。
实施例2：光电化学检测
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有0.1M KCl的10mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流与甲基化RNA浓度之间的关系，线性范围为0.008-30nM，校正曲线为I(nA)＝-243.898logc-646.944(R＝0.9954)，检出限为2.67pM(图2)。
实施例3：检测选择性实验
为了研究构建的传感器的特异性，选择5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲基胞嘧啶(5mC)和mRNA作为对比试剂。并对不同对比试剂参与构建的传感器的光电流变化值(ΔI＝I1-I2，I1是Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO经过不同核苷酸处理后的电极继续经poly(U)聚合酶和[Ru(NH3)6]3+处理后的电极的光电流流值，I2是Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO的电流值，对比试剂和甲基化RNA的浓度均为1nM)进行了对比。结果表明(图3)，对比试剂参与构建传感器电流值变化明显低于甲基化RNA参与反应构建传感器的电流值大小，表明构建的传感器具有很好的特异性。
实施例4：稳定性实验
采用相同的方法制备7支Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极(甲基化RNA浓度为1nM)，在检测液中检测光电流。得到光电流的标准相对偏差很为1.68％，说明该方法有很好的重现性。将Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO传感器在4℃下存放2周，在检测液中检测光电化学信号，得到光电流响应为原始响应的93.55％，说明该方法有很好的稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种检测甲基化RNA的光电化学传感器及其检测方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 甲基化RNA
<400> 1
uugcaaugaa gggugcucag gamcu 25
Claims (10)
1.一种光电化学传感器，其特征在于，所述光电化学传感器以经多重修饰的Ru/U-richRNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极为工作电极；所述工作电极由如下方法制备而成：
以ITO电极为基础电极，对基础电极进行预处理，然后在预处理后的基础电极表面依次修饰硫化钨、纳米金、对巯基苯硼酸、m6A抗体、甲基化RNA、混合了UTP的poly(U)聚合酶和Ru(NH3)6 3+。
2.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰硫化钨的方法为：将硫化钨用去离子水制成硫化钨分散液，将硫化钨分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干；
所述硫化钨分散液的浓度为0.1-5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰纳米金的方法为：将纳米金溶液滴加到修饰有硫化钨的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干。
4.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰对巯基苯硼酸的方法为：将对巯基苯硼酸溶液滴加到修饰有纳米金的电极表面，在室温和潮湿条件下反应1.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰m6A抗体的方法为：将m6A抗体溶液滴加到修饰有对巯基苯硼酸的电极表面，在室温和潮湿条件下反应9-19h，然后清洗3-6次。
6.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰甲基化RNA的方法为：将甲基化RNA溶液滴加到修饰有m6A抗体的电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
7.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰混合了UTP的poly(U)聚合酶的方法为：将含有10-40U/mL poly(U)聚合酶和1-5mM UTP的缓冲液滴加到修饰有甲基化RNA的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
8.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，在预处理后的基础电极表面修饰Ru(NH3)6 3+的方法为：将含有0.5-2mg/mL的[Ru(NH3)6]3+缓冲液滴加到修饰有混合了UTP的poly(U)聚合酶的电极表面，25-55℃和潮湿条件下反应0.5-3.5h，然后清洗3-5次，氮气吹干。
9.权利要求1-8任一项所述的光电化学传感器在检测甲基化RNA中的应用。
10.一种利用权利要求1-8任一项所述的光电化学传感器检测甲基化RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源，以光电化学传感器的Ru/U-rich RNA/Ab/MPBA/AuNPs/WS2/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有0.1M KCl的10mMTris-HCl缓冲液为检测液，pH 7.4，建立电流与甲基化RNA浓度之间的关系，对甲基化RNA含量进行检测。
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