CN108546690B - 一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种野生型短链脱氢酶LfSDR1与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建、重组表达转化体的制备，重组酶及重组酶的制备方法。通过将野生型短链脱氢酶LfSDR1突变获得具有两种立体选择性(R或者S立体选择性)的突变体酶，并利用突变体酶用于前手性酮的催化不对称还原，例如催化1‑苯基乙酮类化合物的不对称还原。本发明中的突变体相对于野生型，立体选择性得到了提高或者逆转，催化上述底物可以获取两种构型(R或者S型)的手性醇，例如光学纯的(R)‑或者(S)‑2‑氯‑1‑苯基乙醇，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及短链脱氢酶LfSDH1突变体及其编码基因，含有所述短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以不同突变体为催化剂催化不对称还原苯乙酮类化合物获取具有不同构型(S和R构型)的相应的光学纯手性苯乙醇类产物中的应用。
背景技术
光学纯的1-苯基乙醇类化合物，尤其是α卤素取代的1-苯基乙醇类化合物是药物及其他精细化学品合成过程中的重要手性中间体。目前多种获取光学纯的手性纯的方法被开发出来，包括动力学拆分与不对称合成两大类。利用前手性羰基化合物不对称合成方法的理论收率可达100％，是获取光学纯的1-苯基乙醇类化合物的重要途径。科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。
自然界中存在的酮还原酶或醇脱氢酶大多是以符合Prelog规则的立体选择性来催化不对称还原产生一种构型的手性醇，然而在药物及化工合成中，两种构型的醇均是重要的合成中间体，因而限制了酮还原酶或醇脱氢酶在工业中的应用。例如符合Prelog规则的R-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇是合成胆固醇吸收抑制剂的手性中间体；符合反Prelog规则的R-1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙醇是合成抗肿瘤辅助用药阿瑞匹坦的手性中间体。
为改善酮还原酶或醇脱氢酶在不对称催化合成光学纯的1-苯基乙醇类化合物过程中的实用性，通过蛋白质理性设计及定向进化方法改变酶催化性质的方法被越来越多的研究人员用来改造酮还原酶或醇脱氢酶的立体选择性。于洪伟等通过同源酶的结构指导，将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC 12633)的短链脱氢酶(PpYSDR)立体选择性改造为符合反Prelog规则，针对底物2,2,2-三氟-1-苯基乙酮突变体PpYSDR-M85T/W182V立体选择性由野生型的56.8(R)改变为99.5(S)(Chem.Commun.,2016,52,6284)；游松等通过蛋白质结构及计算机模拟辅助的方法将来源于光滑假丝酵母(Candida glabrataCGMCC2.234)的酮还原酶(CgKR1)改造为符合反Prelog规则的催化性质，针对底物2-氯-1-苯基乙酮突变体CgKR1-F92A立体选择性由野生型的23.1(R)改变为99.1(S)(ACSCatalysis,2016,6(9):6135-6140.)。
本实验室通过基因挖掘获取的来源于发酵乳酸杆菌的短链脱氢酶LfSDR1，野生状态下对苯乙酮表现出较差的立体选择性，例如催化还原底物2-氯-1-苯基乙酮得到相应醇的对映体过量值(ee)仅64.4(S)。通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现不同构型的光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。
发明内容：
本发明目的在于解决现有发酵乳酸杆菌短链脱氢酶(LfSDR1)立体选择性低及立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体，重组突变体酶催化1-苯基乙酮类不对称还原，制备相应相反构型(R和S构型)光学纯的手性醇中的应用。
为解决上述问题，本发明首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白。
为了提高野生型的立体选择性，对序列表中具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)分别突变为具有较大空间位阻的氨基酸，所述的较大空间位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)，从而获取具有羰基还原活性的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白、分别命名为LfSDR1-V186F(SEQ IDNo.4)与LfSDR1-V186W(SEQ ID No.6)，以催化还原2-氯-1苯基乙酮为例，立体选择性由野生型的64.4％(ee，S)分别提高到99.9％(ee，S)与90.4％(ee，S)。
进一步地，将94位脯氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸；
更进一步地，将192位异亮氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸。
为了逆转野生型的立体选择性，对序列表中具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)分别突变为具有较小空间位阻的氨基酸，将141位谷氨酸突变为非极性氨基酸，将92位甘氨酸突变为具有较大位阻的氨基酸或极性氨基酸；
所述较小空间位阻的氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸，优选为丙氨酸(A)，所述的非极性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为亮氨酸(L)，所述的较大位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸(F)，所述的极性氨基酸为：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺，优选为谷氨酸(E)。
优选地，将186位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，将141位谷氨酸突变为亮氨酸(L)，将92位甘氨酸突变为苯丙氨酸(F)，获取突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92F(SEQ IDNo.8)，
更优选地，
将186位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，将141位谷氨酸突变为亮氨酸(L)，将92位甘氨酸突变为谷氨酸(E)，获得突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92E(SEQ ID No.10)。
以催化还原2-氯-1苯基乙酮为例，突变体的立体选择性由野生型的64.4％(ee，S)分别逆转为97.2％(ee，R)与99.9％(ee，R)。
所述突变体获得方法具体过程如下：
为获取立体选择性提高的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQ IDNo.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-V186F与LfSDR1-V186W基因。
为获取立体选择性逆转的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQ IDNo.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92F与LfSDR1-V186A-E141L-G92E基因。
进一步，将突变体基因及载体质粒pET22b以内切酶NdeⅠ与XhoⅠ进行双酶切(37℃反应4-8h)，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-V186F、pET22b-LfSDR1-V186W、pET22b-LfSDR1-V186A-E141L-G92F与pET22b-LfSDR1-V186A-E141L-G92E；将重组质粒转化入E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，较佳的转化方法为热激法：具体过程为45℃热激90S。将构建的重组转化体细胞经过培养表达突变体短链脱氢酶。
本发明中所述的野生型短链脱氢酶LfSDR1与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原1-苯基乙酮类化合物获取具有不同构型(S和R构型)的相应的光学纯手性苯乙醇类产物。所述的1-苯基乙酮类化合物较佳的结构如结构式1所示：
其中：
n＝1,2；
R1为卤素、卤代C1-C4烷基；
R2为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷基；
R3为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、ArCH2O、卤代C1-C4烷基；
R4为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷基；
R5为卤素、卤代C1-C4烷基；
X为C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基；
进一步地，
n＝1,2；
R1为F、Cl、Br与CF3；
R2为F、Cl、Br、NO2、CH3、CH3O与CF3；
R3为F、Cl、Br、NO2、CH3、CH3O、ArCH2O与CF3；
R4为F、Cl、Br、NO2、CH3、CH3O与CF3；
R5为F、Cl、Br与CF3；
X为CH2Cl、CH3与CF3。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明进行具体说明。
某些术语的定义
对映体过量值(ee)定义为对映体混合物中一个异构体A比另一个异构体B多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。
20种氨基酸缩写如下：
Asp D 天冬氨酸 Ile I 异亮氨酸
Thr T 苏氨酸 Leu L 亮氨酸
Ser S 丝氨酸 Tyr Y 酪氨酸
Glu E 谷氨酸 Phe F 苯丙氨酸
Pro P 脯氨酸 His H 组氨酸
Gly G 甘氨酸 Lys K 赖氨酸
Ala A 丙氨酸 Arg R 精氨酸
Cys C 半胱氨酸 Trp W 色氨酸
Val V 缬氨酸 Gln Q 谷氨酰胺
Met M 甲硫氨酸 Asn N 天冬酰胺
实施例涉及的培养基配方。
a).LB液体培养基：称取10gNaCl，10g胰蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(YeastExtract)溶于900mL蒸馏水，定溶至1000mL后用NaOH调pH至7.5，分装后，115℃高压灭菌30min。
b).LB固体培养基：LB培养基+1.5％琼脂(g/l)。
实施例1定点突变构建在野生型基础上立体选择性提高的突变体基因
以含有短链脱氢酶LfSDR1基因的质粒pET22b-LfSDR1为模板，通过重叠延伸PCR方法获取突变体基因。
首先LfSDR1基因上下游引物如下：
LfSDR1-NdeI-F：GGAATTCCATATGGGACAGTTTG
LfSDR1-XhoI-R：CCGCTCGAGTTGTGCCGTGTAGC
然后设计突变位点引物分别如下：
突变体LfSDR1-V186F
LfSDR1-V186F-F：TACCCTGGGTTTATTGCCACG
LfSDR1-V186F-R：CGTGGCAATAAACCCAGGGTA
突变体LfSDR1-V186W
LfSDR1-V186W-F：TACCCTGGGTGGATTGCCACG
LfSDR1-V186W-R：CGTGGCAATCCACCCAGGGTA
以构建突变体LfSDR1-V186F为例：
第一步PCR反应体系如下：
PCR-a
PCR-b
扩增程序：94℃：10Min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。两组PCR分别得到PCR片段a与PCR片段b，以普通DNA产物胶回收试剂盒回收两种片段，作为第二步PCR的模板。
第二步PCR反应体系如下：
PCR-c
扩增程序与第一步PCR相同，所得PCR片段c即为LfSDR1-V186F突变体基因，经普通DNA产物纯化试剂盒纯化后用于后续操作。
按照相同的操作，将引物LfSDR1-V186F-F与LfSDR1-V186F-R分别替换为LfSDR1-V186W-F与LfSDR1-V186W-R即可获得LfSDR1-V186W突变体基因。
实施例2定点突变构建在野生型基础上立体选择性逆转的突变体基因
以含有短链脱氢酶LfSDR1基因的质粒pET22b-LfSDR1为模板，通过重叠延伸PCR方法获取突变体基因。
LfSDR1基因上下游引物与实施例1中相同。
设计突变位点引物分别如下：
LfSDR1-V186A-F：TACCCTGGGGCAATTGCCACG
LfSDR1-V186A-R：CGTGGCAATTGCCCCAGGGTA
LfSDR1-E141L-F：AGTTCGATCCTGGGGATGATC
LfSDR1-E141L-R：GATCATCCCCAGGATCGAACT
LfSDR1-G92F-F：GCCGGAATTTTTACTCCGCTG
LfSDR1-G92F-R：CAGCGGAGTAAAAATTCCGGC
LfSDR1-G92E-F：GCCGGAATTGAAACTCCGCTG
LfSDR1-G92E-R：CAGCGGAGTTTCAATTCCGGC
以构建LfSDR1-V186A-E141L-G92F突变体为例：
第一步PCR如下：
PCR-d
PCR-e
PCR-f
PCR-g
扩增程序与实施例1中第一步PCR相同，四组PCR分别得到PCR片段d、e、f与g，以普通DNA产物胶回收试剂盒回收四种片段，作为第二步PCR模板。
第二步PCR如下：
PCR-h
扩增程序与实施例1中第一步PCR相同，所得PCR片段h即为LfSDR1-V186A-E141L-G92F突变体基因，经普通DNA产物纯化试剂盒纯化后用于后续操作。
按照相同的操作，将引物LfSDR1-G92F-F与LfSDR1-G92F-R分别替换为LfSDR1-G92E-F与LfSDR1-G92E-R即可获得LfSDR1-V186A-E141L-G92E突变体基因。
实施例3构建突变体基因重组质粒
将重叠延伸PCR获得的突变体基因与载体质粒进行双酶切，反应体系如下：
37℃反应4-8h后，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切，具有粘性末端的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-V186F、pET22b-LfSDR1-V186W、pET22b-LfSDR1-V186A-E141L-G92F与pET22b-LfSDR1-V186A-E141L-G92E。
实施例4 E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞的制备及转化
a)从种子培养基中取1mL E.coli Rosseta(DE3)接种于100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养3h；
b)3000r/min，5min富集菌体，弃上清；
c)加入400μl预冷0.1M CaCl2溶液，重新悬浮菌体，等分分装到4个EP管中，冰浴30min获得E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞悬浮液；
d)向感受态细胞悬浮液中加入20μL重组质粒连接液轻轻混匀，冰浴30min；
e)42℃热休克90s，冰水浴3min，加入800μL LB液体培养基，37℃，150r/min振荡培养1-2h；
f)分别取150μL培养液涂布于带有氨苄西林抗性的LB固体培养基，37℃培养10-20h后挑去阳性转化子，获得突变体重组转化子。
实施例5突变体的表达
a)取突变体转化子接种于4ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；
b)取1ml种子液接种于100ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.1mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；
c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH6.0磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体(菌体湿重浓度为0.1g/ml)，冰水浴环境下超声破碎菌体，4℃环境下，10000rpm离心收集上清获得突变体粗酶液。
实施例6葡萄糖脱氢酶(GDH)的表达
将含有pET22b-GDH质粒的E.coli Rosetta(DE3)按照实施例5所述表达获得葡萄糖脱氢酶(GDH)粗酶液。
实施例6粗酶液催化还原
本实施例中涉及的典型底物如下所示：
反应体系：如实施例5、6中所述的上清各450μl混匀，终浓度0.1mM NADP+，8mg葡萄糖，4mg底物(100μl甲醇助溶)，30℃反应6-12h；用等体积乙酸乙酯萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后旋蒸出去乙酸乙酯留用。
实施例7高效液相色谱法分析底物和产物
检测Sub1及其还原产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃,。
检测Sub2、6、7、9与12及各自还原产物的条件为：色谱柱：OB-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub3及其还原产物的条件为：色谱柱：AD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub4及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub5及其还原产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝98:2，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub8、10与11及其还原产物的条件为：色谱柱OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
野生型短链脱氢酶及其突变体催化上述底物的检测结果如表1所示：
表1：短链脱氢酶LfSDR1野生型及其突变体催化还原1-苯基乙酮类化合物检测结果；a)转化率[％]；b)还原产物醇对映体过量值(ee％)；c)还原产物醇的绝对构型。
序列表
<110> 沈阳药科大学
<120> 一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用
<130> 2018.3.18
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 1
atgggacagt ttgacaataa ggttgccttg gttaccgggg gaacgaaggg gattggctta 60
gccatcgccg agctgttttt gaaggaaggc gccaaggggg tggccttcac cggtcgtcac 120
gaagacgaag gaaaagcggt tcaagaacgc ctcggtgaac ggtctttgtt catcacccaa 180
gacgtttcca aggaagaaga ttggcaaaac gccaccaaag ccgttgttga aaaatttggg 240
cagcttgatg cgattgtcaa caacgccgga attgggactc cgctggggat cgaggaaatg 300
acgctcgatc actggaaccg cgaaatcgcc atcgatttaa cagggacgat gttaggttgc 360
aagtacgggg ttaaagcgat gaaggaacat ggtggcgcga tcgtcaacat tagttcgatc 420
gaagggatga tcggtgaccc aaccgttccg gcctacaacg ctgctaaggg gggcgtccgt 480
ctcctcacca agtcggtagc gcttgagtgt gccgaaaagg gttacgccat ccgcgtaaac 540
tcgatttacc ctggggtaat tgccacgccg ctgatcgatc acctcgatga tgcgaccaag 600
caattctaca tcgacaaaca cccaatgggc cggctgggaa agccggaaga agtggctaag 660
atggctgtct ttgttgcttc cgatggggcc tcctttagca ccggctccga gtttgttgtc 720
gatgggggct acacggcaca ataa 744
<210> 2
<211> 247
<212> PRT
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 2
Met Gly Gln Phe Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Thr Lys
1 5 10 15
Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Glu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Gly Val Ala Phe Thr Gly Arg His Glu Asp Glu Gly Lys Ala Val Gln
35 40 45
Glu Arg Leu Gly Glu Arg Ser Leu Phe Ile Thr Gln Asp Val Ser Lys
50 55 60
Glu Glu Asp Trp Gln Asn Ala Thr Lys Ala Val Val Glu Lys Phe Gly
65 70 75 80
Gln Leu Asp Ala Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Thr Pro Leu Gly
85 90 95
Ile Glu Glu Met Thr Leu Asp His Trp Asn Arg Glu Ile Ala Ile Asp
100 105 110
Leu Thr Gly Thr Met Leu Gly Cys Lys Tyr Gly Val Lys Ala Met Lys
115 120 125
Glu His Gly Gly Ala Ile Val Asn Ile Ser Ser Ile Glu Gly Met Ile
130 135 140
Gly Asp Pro Thr Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Gly Gly Val Arg
145 150 155 160
Leu Leu Thr Lys Ser Val Ala Leu Glu Cys Ala Glu Lys Gly Tyr Ala
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Ile Tyr Pro Gly Val Ile Ala Thr Pro Leu Ile
180 185 190
Asp His Leu Asp Asp Ala Thr Lys Gln Phe Tyr Ile Asp Lys His Pro
195 200 205
Met Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Val Ala Lys Met Ala Val Phe
210 215 220
Val Ala Ser Asp Gly Ala Ser Phe Ser Thr Gly Ser Glu Phe Val Val
225 230 235 240
Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245
<210> 3
<211> 744
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
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Claims (9)
1. 一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQ ID No.2基础上将186位缬氨酸突变为具有较大空间位阻的氨基酸，所述的较大空间位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、色氨酸。
2.如权利要求1所述的一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQ ID No.2基础上将186位缬氨酸突变为具有较小空间位阻的氨基酸，将141位谷氨酸突变为非极性氨基酸，将92位甘氨酸突变为具有较大空间位阻的氨基酸或极性氨基酸；所述的较小空间位阻的氨基酸为：丙氨酸，所述的非极性氨基酸为：亮氨酸，所述的具有较大空间位阻的氨基酸为苯丙氨酸，所述的极性氨基酸为：谷氨酸。
3.如权利要求1或2所述的短链脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4，6，8，10所示。
4.一种核酸，其特征在于，能够编码权利要求1-3任何一项所述的氨基酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求4中所述的核酸。
6.一种包含权利要求5所述的表达载体的重组表达转化体细胞。
7.一种短链脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述的重组表达转化体细胞，从而获取短链脱氢酶突变体。
8.权利要求1-3任何一项所述的短链脱氢酶突变体或权利要求6所述重组表达转化体细胞作为催化剂催化不对称还原前体酮类化合物，制备光学纯的手性醇的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述不对称还原前体酮结构如结构式1所示：
n = 1, 2；
R1为卤素、卤代C1-C4烷基；
R2为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷基；
R3为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、ArCH2O、卤代C1-C4烷基；
R4 为卤素、NO2、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷基；
R5为卤素、卤代C1-C4烷基；
X为C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基。
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