CN105238768A - 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌和应用 - Google Patents

一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种来自短稳杆菌<i>Empedobacter？brevis</i>短链脱氢酶，及其基因，重组短链脱氢酶，含有该基因的重组表达载体，和基因工程菌，该重组酶的制备方法，以及该短链脱氢酶或含有该酶的基因工程菌在不对称还原潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。本发明中所述短链脱氢酶不对称还原制备手性醇具有显著优点，能够合成高光学纯度手性醇(ee>99%)。催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，且其重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化潜手性酮的不对称还原，具有很好的工业化应用开发前景。

Description

一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该短链脱氢酶或含有该酶的重组细胞在不对称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。
背景技术
手性药物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此，单一对映体的合成越来越受关注。作为最重要的手性砌块之一，光学活性手性醇被广泛应用于手性药物和精细化学品的合成之中。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将100％底物酮转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。
与化学法不对称还原相比，生物法催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化学反应过程中化合物的异构化、差向异构化、消旋和重排等现象的发生。因此，生物催化法合成光学活性手性醇已成为最受瞩目的医药及精细化学品的绿色合成技术之一。
在具有催化不对称还原潜手性酮活性的酶中，短链脱氢酶由于其催化底物谱广、热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而倍受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。Peng等利用源于SerratiamarcescensBCRC10948的短链脱氢酶不对称还原1-(3-羟基苯基)-2-(甲氨基)乙酮得到ee值达99％的(R)-苯肾上腺素(JournalofBiotechnology，2014，170：6-9)。Pennacchio等将源于SulfolobusacidocaldariusDSM639的短链脱氢酶用于苯偶酰的不对称还原，转化率和产物的ee值均达到98％(ApplMicrobiolBiotechnol，2013，97(9)：3949-3964)。然而，大多数生物催化剂催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，遵循anti-Prelog规则催化潜手性酮还原的生物催化剂相对较少。这将限制作为手性药物合成重要中间体anti-Prelog手性醇的制备及生物催化绿色合成技术的推广。因此，发掘新的遵循anti-Prelog规则的生物催化剂十分必要与迫切。
发明内容
本发明一个目的在于提供一种短稳杆菌Empedobacterbrevis短链脱氢酶，以达到能够高效合成高光学纯度手性醇(ee>99％)的目的。
为了实现上述目的，本发明的提供一种短链脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
本发明的短链脱氢酶来源于短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)。该菌株由本实验室从土壤中筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2014520，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏时间是2014年10月29日。
任何对SEQIDNO：2所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、***或替换一个或几个氨基酸且具有短链脱氢酶活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种短链脱氢酶基因，其(1)核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；或(2)编码氨基酸序列如SEQIDNO：2中所示的蛋白质。
该基因是通过PCR技术从短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)基因组中克隆获得。具体制备方法为：根据Genbank中收录的短链脱氢酶的基因序列设计合成引物，较佳的，上游引物为：GCTGAGGATCCATGTCAATATTAAAAGATAAGGTAGC，(SEQIDNo：3)；下游引物为：
GCATCCTCGAGTTAAACTGCTGTATATCCTCCATC，(SEQIDNo：4)；然后以EmpedobacterbrevisZJUY-1401基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得全长753bp的短链脱氢酶基因序列。该短链脱氢酶基因核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。
如本领域技术人员所知，本发明的短链脱氢酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQIDNo：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对SEQIDNO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或***处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供一种包含本发明的短链脱氢酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的短链脱氢酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的短链脱氢酶基因产物Ebsdr8与载体pET-30a连接构建本发明的短链脱氢酶基因重组表达质粒pET30a-Ebsdr8。
本发明的第四个目的是提供一种表达重组短链脱氢酶的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的短链脱氢酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。将重组质粒pET30a-Ebsdr8转化至E.coliBL21(DE3)中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ebsdr8。
本发明的第五个目的是提供一种重组短链脱氢酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的短链脱氢酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ebsdr8接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组短链脱氢酶。
本发明的第六个目的提供所述短链脱氢酶或其重组细胞在不对称催化潜手性酮制备光学活性手性醇中的应用。
具体的，所述的应用为：以潜手性酮(I)为底物，所述短链脱氢酶或其重组细胞，以NADH或NADPH为辅酶，20～50℃下，于pH5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系a中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。
其中，R1和R2为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。
具体的R1和R2可以为-H，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2X，-CX3，-X，-OCH3，-OCH2CH3；X代表F，Cl，Br，OH，NO2。
所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。
进一步，所述转化体系a中底物初始浓度为5～100mmol/L。
进一步，所述转化体系a中重组短链脱氢酶纯酶在反应液中较佳的浓度为0.1～2.0mg/mL。所述转化体系a中菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。
进一步，所述转化体系a还包括有机溶剂。
由底物、催化剂、有机溶剂与pH5.5～10.5的缓冲液构成转化体系b，有机溶剂占转化体系b总体积1～20％，转化体系b中底物初始浓度为5～100mmol/L，菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。
进一步，所述反应在pH6.5～10.5的缓冲液中进行。
进一步，反应体系还可添加醇或糖作为辅底物，可以显著提高反应的活力和立体选择性。所述辅底物包括但不限于下列之一：①乙醇、②异丙醇、③葡萄糖、④蔗糖等。
其中辅底物醇或糖的质量分数为反应体系总质量的1～15％。
进一步，反应体系中的辅底物为异丙醇。
进一步，反应体系中异丙醇的质量分数为反应体系总质量的5％。
进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。
本发明所述转化体系a和转化体系b均为转化体系，为便于区分不同步骤转化体系的组成不同而命名，字母本身没有含义。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于EmpedobacterbrevisCCTCCNO:M2014520的短链脱氢酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，通过该短链脱氢酶或含有该酶的基因工程菌，即重组细胞，可以不对称还原可制备高光学纯度的手性醇。
本发明中短链脱氢酶或含有该酶的重组细胞不对称还原制备手性醇具有显著优点，能够合成高光学纯度手性醇(ee>99％)。催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，且其重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化潜手性酮的不对称还原，具有很好的工业化应用开发前景。
附图说明
图1为实施例1中短链脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例1中pET30a-Ebsdr8重组质粒物理图谱。
图3为实施例3中短链脱氢酶分离纯化SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：EmpedobacterbrevisZJUY-1401短链脱氢酶基因的获得、重组质粒构建及转化大肠杆菌
用DNA提取试剂盒提取EmpedobacterbrevisZJUY-1401菌体的全基因组DNA，以该DNA为模板，上游引物(GCTGAGGATCCATGTCAATATTAAAAGATAAGGTAGC)和下游引物(GCATCCTCGAGTTAAACTGCTGTATATCCTCCATC)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：5×PrimeSTARTMHSDNApolymeraseBuffer10μL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μL，浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，基因组DNA1μL，PrimeSTARTMHSDNApolymerase0.5μL，无核酸水32.5μL。PCR反应条件为：预变性98℃1min，然后进入温度循环98℃10s，56℃15s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。短链脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见附图1。其中，通道1为Maker；通道2为Ebsdr8基因PCR扩增产物。测序分析结果表明，经上述过程扩增得到的核苷酸序列长度为753bp(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。利用软件对该基因序列进行分析，推知所述短链脱氢酶基因编码SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。
PCR产物由BamHI/XhoI进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用T4连接酶(Promega)将该片段同用相同限制性内切酶处理的商业化载体pET-30a(Novagen)连接，构建重组表达质粒pET30a-Ebsdr8。图2为pET30a-Ebsdr8重组质粒物理图谱。
将上述构建的重组表达载体pET30a-Ebsdr8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ebsdr8，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pET30a-Ebsdr8成功转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)中，且短链脱氢酶基因已成功克隆至pET-30a的BamHI和XhoI位点。
实施例2：重组短链脱氢酶的诱导表达
实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ebsdr8接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的50mLLB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，于-80℃贮存备用。
实施例3：重组短链脱氢酶的分离纯化
实施例2收集的菌体细胞悬浮于10mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(100mM，pH8.0)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间8min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后续的分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mMNaCl和20mM咪唑，pH7.4)平衡Ni-NTA柱，以5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mMT磷酸钠，500mMNaCl和500mM咪唑，pH7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为Na2HPO4-NaH2PO4(100mM,pH7.5)缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图3，其中通道1为蛋白Maker；通道2为EbSDR8纯酶。结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的重组短链脱氢酶EbSDR8。
实施例4：重组短链脱氢酶不对称还原苯乙酮
取实施例3中所得到的纯酶液1mL，再分别加入10mM苯乙酮和5mMNADH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应3h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度99.1％，转化率72.2％。
实施例5：重组短链脱氢酶不对称还原苯乙酮
取实施例3中所得到的纯酶液1mL，再分别加入10mM苯乙酮和5mMNADPH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应3h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度90.1％，转化率37.4％。
实施例6：重组短链脱氢酶不对称还原苯乙酮
取实施例3中所得到的纯酶液900μL，加入100μL异丙醇，再分别加入10mM苯乙酮和2.5mMNADPH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应3h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度99.4％，转化率94.4％。
实施例7：重组短链脱氢酶不对称还原苯乙酮
取实施例3中所得到的纯酶液900μL，加入100μL乙醇，再分别加入10mM苯乙酮和2.5mMNADPH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应3h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度98.3％，转化率38.8％。
实施例8：重组大肠杆菌不对称还原苯乙酮
在900μL、100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH7.0)，加入100μL异丙醇，加入0.05g实施例2中所得到的湿菌体细胞；再分别加入10mM苯乙酮和2.5mMNADH作为底物和辅酶。于35℃恒温摇床振荡(200rpm)反应1.5h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度大于99.6％，转化率69.7％。
实施例8：重组大肠杆菌不对称还原苯乙酮
在950μL、100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH7.5)，加入50μL异丙醇，加入0.05g实施例2中所得到的湿菌体细胞；再分别加入15mM苯乙酮作为底物。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应2h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度大于99.7％，转化率77.1％。
实施例9-26：重组大肠杆菌不对称还原潜手性酮
在950μL、100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH7.5)，加入50μL异丙醇，加入0.05g实施例2中所得到的湿菌体细胞；再分别加入15mM潜手性酮作为底物。于35℃恒温摇床振荡(200rpm)反应4h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。所用气相色谱仪为福立GC9790，色谱条件为：进样量1.0μl，进样口、检测器的温度均为240℃；载气为氮气。对硝基苯乙酮和间硝基苯乙酮用手性毛细管气相色谱柱Cyclodex-B检测，程序升温条件为：初始温度为60℃，以5℃/min的速度升到180℃，保持20min。其余潜手性酮及其相应手性醇用手性毛细管气相色谱柱Hydrodexβ-TBDAc分析，均采用恒温程序。产物光学纯度、转化率及检测温度如表1所示。如表1所示，本发明的重组大肠杆菌不对称还原不同潜手性酮，产物的纯度几乎都达到99％以上，转化率也较高，实施例11-13,16,18-21,23-24中转化率均达到90％以上，特别是实施例16，转化率达到99％以上，产物纯度达到99.9％。可见本发明的重组大肠杆菌能够实现不对称还原潜手性酮，且转化率高，产物纯度高。
表1实施例9-26中产物光学纯度、转化率及检测温度
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种短链脱氢酶，其特征在于，所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.一种编码权利要求1所述短链脱氢酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示或编码氨基酸序列SEQIDNO：2中所示蛋白质或核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的基因的制备方法，其特征在于，首先，设计引物，上游引物为：GCTGAGGATCCATGTCAATATTAAAAGATAAGGTAGC，下游引物为：GCATCCTCGAGTTAAACTGCTGTATATCCTCCATC；然后以短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得短链脱氢酶基因序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的短链脱氢酶/还原酶基因的核苷酸序列。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求4所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。
6.一种如权利要求1所述的短链脱氢酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述基因工程菌接种至LB培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达重组短链脱氢酶。
7.如权利要求1所述的短链脱氢酶或如权利要求5所述的基因工程菌在不对称催化潜手性酮制备光学活性手性醇中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以潜手性酮(I)为底物，短链脱氢酶或其基因工程菌，以NADH或NADPH为辅酶，20～50℃下，于pH5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系a中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到产物，
其中R1和R2为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，转化体系a中重组短链脱氢酶在反应液中较佳的浓度为0.1～2.0mg/mL，或所述转化体系a中菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，反应体系还可添加醇或糖作为辅底物。
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