CN108535494A - 一种il-6elisa检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种IL‑6ELISA检测试剂盒。本发明是利用酶联吸附实验双抗体夹心法的原理，利用包被IL‑6单克隆抗体酶标板，加入样本和HRP酶标记IL‑6单克隆抗体一步法反应，用TMB显色，来定量检测IL‑6的含量，此实验检测方法比起其他方法学操作更简便，通量大，价格低廉，适合大规模筛查。

Description

一种IL-6ELISA检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种IL-6ELISA检测试剂盒及其使用。
背景技术
IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生。它可调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6在多种疾病时有明显改变。IL-6表达失调可引起许多疾病，其临床表现主要为发病时IL-6水平增高。IL-6上升的水平与疾病的活动期、肿瘤的发展变化、排斥反应程度以及治疗效果都密切相关，因此，对病人体液中IL-6水平的检测可反映患者的病情变化。
IL-6已被公认为一种重要的促炎细胞因子，参与机体炎症反应和抗感染作用。研究表明，感染情况下IL-6与多种细胞因子协同参与创伤和多种炎症疾病的病理过程，研究人员和临床医生认为在感染性疾病中IL-6是比C反应蛋白更为敏感的诊断指标。
目前临床上用IL-6检测方法主要是化学发光免疫分析法，方法采用双抗体夹心法，不同之处在于标记物不同：化学发光法为碱性磷酸酶。化学发光法能够准确、快速检测出结果，但是该方法仪器成本相对较高，需要特定的化学发光仪器，并且对实验操作人员的要求相对较高，只有一些相对较大的实验室才能具备相应的条件。
因此，临床需要研发一种敏感性高、特异性强、操作简单便捷、低成本的适合临床推广的IL-6检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种IL-6ELISA检测试剂盒及其使用方法，以便解决现有技术中检测成本高、操作复杂的技术问题，本专利的操作更简便，通量大，价格低廉，适合大规模筛查。
为了解决上述问题，本发明提供了一种IL-6ELISA检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：包被处理后酶标板、HRP标记的IL-6抗体、拟合曲线的标准品、标准品稀释液和A，B显色液。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的包被处理后酶标板中包被的抗体为：IL-6单克隆抗体。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的包被处理后酶标板中的封闭液配方为：0.02MPBS+1％BSA+0.1％l酪蛋白钠盐+0.2％吐温20。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的HRP标记的IL-6抗体为单克隆抗体。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的标准品稀释液为酶稀释液。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的酶稀释液配方为：0.02MPBS+10％小牛血清+0.2％曲拉通100+0.1％proclin300。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的酶稀释液的使用浓度为：1：1000，1：2000，1：4000，1：8000。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的酶稀释液的使用浓度为：1：2000。
本发明还涉及一种优选的试剂盒方案，其特征在于，所述的A、B显色液为TMB显色液。
步骤一：取50微升样品和50微升HRP酶标记的IL-6抗体加入包被处理后的酶标板，并将标准品稀释成0pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml，160pg/ml，320pg/ml，640pg/ml。
步骤二：用常规PBST洗液洗4遍拍干加入TMB显色液；
步骤三：避光显色15分钟后加入终止液终止；
步骤四：用酶标仪读数。
本发明还涉及一种优选的使用试剂盒方法的方案，其特征在于，所述的待测样品选自血浆和血清。
本发明还涉及一种优选的使用试剂盒方法的方案，其特征在于，所述的HRP酶标记的IL-6抗体浓度为1：2000。
本发明还涉及一种优选的使用试剂盒方法的方案，其特征在于，所述的终止液为硫酸。
附图说明
附图1是标准拟合曲线
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
实施例1：酶标板包被以及封闭
取20ugIL-6单克隆抗体(武汉华美生物)加入到10ml0.05M PH值9.6的碳酸盐缓冲液中混合均匀，均匀加入到96孔酶标板中，每孔100ul，37度反应1小时，后放置4度包被16小时，拍干，用常规PBST洗液洗3遍拍干，加入封闭液，反应1小时拍干，37度鼓风干燥箱干燥1小时，密封放置4度冰箱备用。
封闭液配方：0.02MPBS+1％BSA+0.1％l酪蛋白钠盐+0.2％吐温20。
实施例2：HRP酶标记IL-6单克隆抗体：
将HRP酶溶解到超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，取1ml再取500ml10mg/ml，4度反应1小时，再加入500ul1％乙二醇混合均匀，4度反应1小时，在最终产物中取250ul加入5mgIL-6单克隆抗体(武汉华美生物)混合均匀，在0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液中透析16小时，中途换一次液，再加入30ul5mg/ml硼氢化钠终止反应，4度2小时，用G25脱盐柱离心脱盐得到最终产物为HRP-IL-6酶标记物，加入50％甘油放置-20度保存。
显色液配制：
A液：醋酸钠12.6g+柠檬酸1.6g+过氧化脲0.3g定容至500ml；
B液：EDTA-2Na0.2g+柠檬酸0.95g+50ml甘油+四甲基联苯二胺0.2g(溶于1mlDMSO中)定容至500ml。
标准品配制：将IL-6抗原用化学发光赋值后，用酶稀释液稀释成640pg/ml(1ml)做起始浓度。
标准品稀释液：0.02MPBS+10％小牛血清+0.2％曲拉通100+0.1％proclin300。
实施例3：酶稀释液最佳使用浓度的确定
酶稀释液配方：0.02MPBS+10％小牛血清+0.2％曲拉通100+0.1％proclin300。
最佳HRP-IL-6的确定：
将实施例2中的产物用酶稀释液稀分别稀释成1：1000，1：2000，1：4000，1：8000；
将IL-6抗原用酶稀释液稀释成20pg/ml,1000pg/ml，用稀释液分别做上阴性对照并做上平行孔，取50ul加入实施例1做好的成品板，再各分别加入HRP-IL-61：1000，1：2000，1：4000，1：8000，各50ul，37度反应30分钟，用常规PBST洗液洗4遍拍干加入TMB显色液(常规试剂盒)避光显色15分钟后加入终止液(2M硫酸)终止。用450nm波长酶标仪分别读数。
结果如下：
结果说明，在1：2000酶的OD值比较大，背景比较低所以酶最佳使用浓度为1：2000。
实施例4：试剂盒的使用方法
取IL-6抗原(武汉华美生物)用罗氏E610化学发光仪器赋值，分别用酶稀释液稀释成640pg/ml为标准品起始值。并依次将标准品稀释为：0pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml，160pg/ml，320pg/ml，640pg/ml。取用罗氏E610化学发光检测赋值后的标本10个，取样本各加入50ul，再加入1:2000的HRP-IL-6酶50ul，每个样品做复孔，37度反应30分钟，用常规PBST洗液洗4遍拍干加入TMB显色液，避光显色15分钟后加入终止液(2M硫酸)终止，用450nm波长酶标仪分别读数。
利用上述实验数据得到曲线如附图1
四参数Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A＝2.49472
B＝-1.59145
C＝117.22045
D＝0.09187
r^2＝0.99976
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
实验结果表明：10例样本与化学发光赋值偏差都10％以内，说明其准确性，与发光结果高度一致，可以用与临床检测实验。

Claims (10)

1.一种IL-6ELISA检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：包被处理后酶标板、HRP标记的IL-6抗体、拟合曲线的标准品、标准品酶稀释液和A、B显色液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被处理后酶标板中包被的抗体为：IL-6单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被处理后酶标板中的封闭液配方为：0.02MPBS+1％BSA+0.1％酪蛋白钠盐+0.2％吐温20。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的HRP标记的IL-6抗体为单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标准品稀释液为酶稀释液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶稀释液配方为：0.02MPBS+10％小牛血清+0.2％曲拉通100+0.1％proclin300。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶稀释液的使用浓度为：1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，优选1:2000。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的A、B显色液为TMB显色液。
9.一种IL-6ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于：
步骤一：取50微升待测样品和50微升HRP酶标记的IL-6抗体加入包被处理后的酶标板，并将标准品稀释成0pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml，160pg/ml，320pg/ml，640pg/ml,每孔加100微升。
步骤二：用常规PBST洗液洗4遍拍干加入TMB显色液；
步骤三：避光显色15分钟后加入终止液终止；
步骤四：用酶标仪读数。
10.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的待测样品选自血浆和血清；所述的HRP酶标记的IL-6抗体浓度为1:2000；所述的终止液为硫酸。
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