CN108531583B - 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。所述引物组合包括核苷酸序列如Seq ID No.1‑40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异。其中每一对引物用于扩增MITF基因中的一个区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不同。本发明的检测方法，采用所述20对引物特异性扩增样品中MITF基因的不同区域，利用UMI对扩增产物的二代测序数据进行降噪，从而准确检测出低拷贝数变异。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。
背景技术
基因突变的检测对于许多种肿瘤检测，胎儿遗传状态检测都具有重要的价值。目前针对胎儿的基因突变筛查，主要基于SNP array等多个平台***，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析，成本昂贵；而常规依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，发生的碱基错误造成测序噪声，因此常规文库捕获和高通量测序不能解决由扩增和测序造成的变异检测偏差；而较新的循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)受其环化文库效率和背靠背引物位点的设计的影响。
孕妇外周血中胎儿来源的游离DNA的发现，为无创性检测胎儿遗传状态提供了可能。孕妇外周血cfDNA源于母亲和胎儿，胎儿游离DNA(cffDNA)来源于胎盘滋养层细胞，约占总cfDNA的10-20％，片段长度为140-180bp左右。将cffDNA从母亲来源的DNA中鉴别出来仍然是目前的技术难点，特别是如何检测母血血浆中cffDNA所导致的等位基因比例不平衡。目前国际上对cffDNA的研究主要通过位点特异性PCR，MALDI-TOF质谱法，数字PCR和高通量测序等方法进行。
目前主流的无创产前检测方法均基于胎儿变异位点检测和单体型检测：通过对母血血浆中cfDNA进行位点检测，然后利用相对变异剂量(RMD)和相对单体型剂量(RHDO)分析孕妇血浆中胎儿变异位点和单体型的相对含量。通过仅存在父亲中的SNP推导了父源部分的胎儿基因组，母亲来源的胎儿基因组部分则使用父亲纯合但母亲杂合的SNP进行推导。Papasavva等利用该方法对母血cfDNA进行分析，成功对其cffDNA基因型和变异位点进行分析。因此利用对cffDNA中变异位点和单体型的检测，可有效地提高胎儿致病基因的诊断准确度。
MITF(Microphthalmia-associtated transcription factor)基因(NCBI：mRNA序列号为NM_00248)全长4490bp，其中ORF编码序列为1260bp，共有9个外显子。其编码蛋白是小眼畸形相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用，同时还参与了肥大细胞、破骨细胞和眼色素上皮细胞的发育和分化。MITF基因突变在临床上会导致综合征性耳聋，主要表现为感音神经性聋及色素异常，后者包括虹膜异色、白额发、早白发、皮肤色素减退或雀斑沉着；其他表现还有内眦异位、高宽鼻根、多毛症、一字眉或眉毛中部潮红等。利用基因检测早期发现，早期干预，从而达到防残减残，提高人口素质的目的，对减轻患者家庭和社会的负担意义重大。
因此，有必要针对MITF基因开发一种更加便捷和可靠的适合无创检测低拷贝数基因突变的技术。
发明内容
根据上述领域存在的需求，发明人研发了一种无创检测MITF基因突变的方法，在常规的多重扩增基础上，向扩增引物中引入UMI(Unique Molecular Identifier)分子标签，利用UMI对二代测序数据进行降噪，从而准确地检测低拷贝数变异。
本发明请求保护的技术方案如下：
用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。
优选地，所述引物组合还包括核苷酸序列如Seq ID No.41-44所示的2对引物。
一种无创检测MITF基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以受试者血浆DNA为模板；
(2)进行PCR预扩增；
(3)对预扩增产物进行Index PCR扩增；
(4)对Index PCR扩增产物进行文库质控后，在Illumina NextSeq测序仪上进行150bp双端测序；
(5)将测序的序列信息去除连接接头，拼接为一条原始模板序列，将原始模板序列与MITF基因的参照序列比对，并通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性，通过计算突变序列与参照序列的比例统计出体细胞MITF基因突变率；
所述预扩增中，采用核苷酸序列如Seq ID No.1-40所示的20对引物的混合物同时特异性扩增MITF基因的不同区域，从而检测MITF基因的变异及其临近SNP位点；
每一对引物扩增MITF基因中的一个区域；引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，而来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不相同；
所述Index PCR扩增中，采用核苷酸序列如Seq ID No.45和46所示的正反向引物。
优选地，所述预扩增中，采用核苷酸序列如Seq ID No.1-44所示的22对引物的混合物进行扩增。
优选地，在进行所述Index PCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA进行磁珠纯化。
优选地，在进行所述Index PCR扩增之后，对Index PCR扩增所得DNA进行磁珠纯化。
用于检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如Seq IDNo.47-86所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。
优选地，所述引物组合还包括核苷酸序列如Seq ID No.87-90所示的2对引物。
临床研究中，迫切需要一种快速、高效的检测MITF基因突变和基因型的方法。发明人在研究片段DNA的检测时，发现了一种新的DNA片段的检测方法，即：在扩增引物中添加UMI(Unique Molecular Identifier)分子标签序列，然后对DNA片段进行PCR扩增并通过第二代高通量测序技术测序，利用UMI分子标签序列对二代测序数据进行降噪，从而检测出低拷贝数变异。
本发明根据MITF基因序列设计和筛选出核苷酸序列如Seq ID No.47-86所示的20对特异性引物，用于扩增MITF基因的不同区域，具有特异性强，灵敏度高的优点。
进一步地，为满足高通量检测的需要，在所设计的特异性引物序列的5’端加上UMI分子标签序列和接头序列，得到核苷酸序列如Seq ID No.1-40所示的20对预扩增引物。所述预扩增引物中，所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和MITF基因不同区域的特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和MITF基因不同区域的特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同，接头序列A与接头序列B彼此不相同；同一引物对中的引物带有相同的UMI分子标签序列，不同引物对的引物带有不同的UMI分子标签序列。所述UMI分子标签序列为随机设计的核苷酸序列。用于Index PCR扩增的正反向引物的3’端序列分别为接头序列A和接头序列B的5’端序列。
此外，本发明还提供Seq ID No.87-90所示的2对引物。其中，Seq ID No.87和88所示的正反向引物(MITF mutation-F/R)用于检测MITF基因c.627C>A位点的变异，临床研究发现，此位点的变异可能导致耳聋，因此，对于该位点的检测，有助于分析胎儿罹患耳聋的概率。Seq ID No.89和90所示的正反向引物(Amelo-F/R)用于检测胎儿的性染色体，通过研究胎儿游离DNA在母血中游离DNA比例，辅助判断胎儿游离DNA的比例。同样地，为满足高通量检测的需要，在引物的5’端加上UMI分子标签序列和接头序列，得到了Seq ID No.41-44所示的2对预扩增引物。
本发明提供的无创检测MITF基因突变的方法，采用本发明设计的20对预扩增引物扩增MITF基因的不同区域，能够准确检测出待测DNA样品的MITF基因型，既可以用于MITF基因相关疾病的基础研究，也可以用于临床疾病诊断。通过生物信息分析将带有相同UMI分子标签序列的扩增片段进行合并，极大地降低了由DNA聚合酶扩增过程和二代测序过程所引入的错误，实现对样品中低拷贝数变异的准确检测。实施例2的验证结果表明，本发明的方法能够灵敏、准确地检测出样品中的MITF基因突变位点。
在一些实施例中，利用本发明的方法检测MITF基因型，然后与父母和先证者的基因型进行比对，从而判断致病突变的基因型。在一些实施例中，以孕妇外周血cfDNA为模板，利用本发明的方法检测胎儿的遗传状态。
附图说明
图1.本发明的检测原理示意图：
首先对血浆DNA进行PCR预扩增，目的是扩增所需位点产物；
然后将预扩增产物DNA纯化，目的是去除体系中的酶和离子；
针对预扩增产物进行Index PCR扩增，制作成可用于高通量测序的文库；
最后对文库进行生物信息学分析，得出基因突变数据。
图2.生物信息学分析过程示例：
将带有相同分子标签的序列组装成唯一的模板序列。
图3.本发明的一个实施例中针对rs9862357的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)或制造厂商提供的说明书。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过本领域常规方法制备得到或从商业途径购买得到。
实施例1.用于检测MITF突变位点和基因型的引物设计
1、特异性引物设计
从dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)中筛选MITF基因及其上下游临近SNP位点(最小等位基因频率MAF>10％)。基于人MITF基因的mRNA序列(NCBI数据库中的序列号为NM_00248)，针对每个SNP位点设计引物，筛选到20对特异性引物，其核苷酸序列如Seq ID No.47-86所示。
表1.用于扩增MITF基因SNP位点的特异性引物
本发明还提供用于检测MITF基因c.627C>A位点变异的特异性引物MITFmutation-F/R，其核苷酸序列如Seq ID No.87-88所示。
| 编号 | 突变位点 | 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| 87 | c.627C>A | MITF mutation-F | AAGAGCACTGGCCAAAGAGA |
| 88 | c.627C>A | MITF mutation-R | AAACATTTTTGATATATGGGGAACA |
本发明还提供用于判断胎儿性别的特异性引物Amelo-F/R，其核苷酸序列如SeqIDNo.89-90。
| 编号 | 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| 89 | Amelo-F | TCAACTTCAGCTATGAGGTAATTTTTC |
| 90 | Amelo-R | CCAACCATCAGAGCTTAAACTGG |
如果扩增出来的序列为：
TCAACTTCAGCTATGAGGTAATTTTTCtctttactaattttgatcactgtttgcattagcagtcccctgggctctgtaaagaatagtgggtggattcttcatcccaaataaagtggtttctcaagtggtcccaattttacagttcctaccatcagcttcCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGG，则胎儿为男性；
如果扩增出来的序列为：
TCAACTTCAGCTATGAGGTAATTTTTCtctttactaattttgaccattgtttgcgttaacaatgccctgggctctgtaaagaatagtgtgttgattctttatcccagatgtttctcaagtggtcctgattttacagttcctaccaccagcttcCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGG，则胎儿为女性。
2、预扩增引物设计
基于步骤1中的特异性引物设计预扩增引物，得到核苷酸序列如Seq ID No.1-44所示的22对预扩增引物。
如表2所示，预扩增引物中，所有的正向引物从5’端到3’端依次为接头序列A、UMI分子标签序列、特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为接头序列B、UMI分子标签序列、特异性引物序列。
每条引物中的“NNNNNN”是一种合成的A/G/C/T随机序列，也就是UMI(uniquemolecular identifier)标签序列，在引物合成时随机生成。每对引物中的UMI标签序列彼此不同。正向引物中的5’端序列“CCTACACGACGCTCTTCCGATCT”为接头序列A；反向引物5’端序列“TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT”为接头序列B。
表2.预扩增引物组
3、引物特异性验证
DNA提取：采用Biobase公司的Upure游离DNA提取试剂盒提取正常人血浆DNA。
目的片段扩增：以正常人血浆DNA为模板，采用表2所列的每一对引物，按照如下反应体系和反应程序分别进行PCR反应，检测每对引物的扩增特异性。
PCR反应体系：
| DNA | 24.8μ1 |
| Buffer 10X | 3μ1 |
| dNTP(2.5mM) | 1μ1 |
| 正向引物(10mM) | 0.5μ1 |
| 反向引物(10mM) | 0.5μ1 |
| Taq polymerase | 0.2μ1 |
| 30μ1 |
PCR反应程序：
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后回收PCR产物并测序，将测序结果与引物对应的目的片段进行比对。结果表明，表2所列的22对引物中，每对引物的扩增产物中未出现非特异性扩增条带，并且测序结果正确。
实施例2.利用本发明的引物组检测已知MITF突变位点和基因型
1.细胞系DNA：将含有杂合MITF基因变异的DNA样本(均来源于陆军军医大学第一附属医院DNA样本库)超声破碎，回收166±10bp片断，按预设比例混入正常人血浆DNA，得到突变比例已知的待测样品，用于测试本发明方法的灵敏性、特异性及稳定性。
根据阳性DNA浓度计算，待测样品的MITF基因热点突变比例预期如下：
| 突变位点 | 预期突变比例 |
| c.627C>A | 5％ |
| rs9862357 | 4％ |
| rs1564756 | 45％ |
| rs9847421 | 41％ |
| rs66686363 | 17％ |
| rs56336456 | 12％ |
| rs1967033 | 46％ |
| rs6549245 | 36％ |
| rs12495615 | 50％ |
| rs1491694 | 50％ |
| rs7631644 | 25％ |
| rs7616256 | 40％ |
| rs4547664 | 0％(阴性对照) |
2.预扩增引物MIX：将表2中Seq ID No.1-44所示的引物构成的22对引物混合，得到预扩增引物混合液，加入1.5ml EP管中。
3.PCR预扩增
制备如下的反应混合液：
| DNA | 24.8μ1 |
| Buffer 10X | 3μ1 |
| dNTP(2.5mM) | 1μ1 |
| 预扩增引物混合液(10mM) | 1μ1 |
| Taq polymerase | 0.2μ1 |
| 30μ1 |
PCR仪上反应：
使用Beckman Coulter公司的Agencourt AMPure XP 450mL Kit试剂盒，按照试剂盒说明书中记载的操作方法纯化回收DNA样品，并在25μ1的无菌dH20或洗脱缓冲液中洗脱，得到预扩增产物。
4.Index PCR扩增
Index PCR引物
| Primer For | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGC |
| Index Primer Rev | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTTAATTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT |
其中，Primer For中5’端和Index Primer Rev 5’端序列为Illumina公司的公开通用测序接头；Primer For的3’端序列“CCTACACGACGC”，Index Primer Rev的3’端序列“TCAGACGTGTGCT”分别是表2中正向引物的接头序列A和反向引物的接头序列B的5’端序列；反向引物Index Primer Rev 5’中“CTCTTAAT”为Index序列，用于区分不同样本。
按照如下反应体系和反应程序进行PCR：
PCR反应体系：
PCR反应程序：
使用Beckman Coulter公司的Agencourt AMPure XP 450mL Kit试剂盒，按照试剂盒说明书中记载的操作方法纯化回收DNA样品，并在25μ1的无菌dH20或洗脱缓冲液中洗脱得到文库。
将制作好的文库通过QubitTM4Fluorometer检测浓度质控后(依据Invitrogen公司操作指南进行操作)，在Illumina NextSeq测序仪上进行150bp双端测序(操作步骤依据Illumina公司操作说明进行操作)。
将高通量测序的序列依据重复区域拼接为一条序列，去除连接接头，将序列还原回原始模板序列，将原始模板序列与MITF基因的参照序列进行比对，通过比较模板序列的分子标签序列，统计出唯一的模板序列。如图2所示，将带有相同分子标签的序列组装成唯一的模板序列。利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性，通过计算突变序列与参照序列的比例统计检测区域体细胞突变率。
传统不带分子标签的引物扩增后，测序并不能区分其相同来源的不同序列。我们通过引入UMI分子标签，通过生物信息分析将带有相同来源UMI的序列进行合并，极大地降低了由DNA聚合酶扩增过程和二代测序过程所引入的错误，通过降噪可实现对低拷贝数的变异进行准确检测。
针对MITF基因热点突变位点检测结果如下：
图3示出了针对rs9862357的检测结果。针对同样的样本，使用ddPCR法对该位点突变比例进行了检测，结果与本发明方法检测结果一致。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120> 用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法
<130> P1830403CN-CN-DYF-CQ-LSH
<160> 92
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-rs9847421-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng catcttagtt ccctgccata 50
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-rs9847421-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-rs1564756-F
<220>
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<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng agcacatcca actccgttt 49
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-rs1564756-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng cagaacccaa cttgcaga 48
<210> 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<222> (24)..(29)
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc caccacactg gcctacatt 49
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tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng caggtggaat aaacaagaag g 51
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<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ggtttcctat cttcctcctg 50
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<223> n is a, c, g, or t
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ttcttgggaa ataaaccttg c 51
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<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna tgcaggtctc aggcaaaat 49
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> n is a, c, g, or t
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ttcaaagcaa gacccaagc 49
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<211> 49
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng gggaaaaaca gtacgcttc 49
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tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt gagaaggtgt gttagggtgt g 51
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng ccttgtgtta gtgctttagc c 51
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<223> n is a, c, g, or t
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tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc aaaaaccaat agaaagtgtg tgtg 54
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tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna agggtggttc cagaggatt 49
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<223> n is a, c, g, or t
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ggtggacaga caaccaaca 49
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gcagctctcc tgccttaac 49
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<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
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<220>
<223> N-MITF mutation-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna agagcactgg ccaaagaga 49
<210> 42
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-MITF mutation-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna aacatttttg atatatgggg aaca 54
<210> 43
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-Amelo-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt caacttcagc tatgaggtaa tttttc 56
<210> 44
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-Amelo-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc caaccatcag agcttaaact gg 52
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer For
<400> 45
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg c 51
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Index Primer Rev
<400> 46
caagcagaag acggcatacg agatctctta attgactgga gttcagacgt gtgct 55
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9847421-F
<400> 47
gcatcttagt tccctgccat a 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9847421-R
<400> 48
aaaggagaga aaatttgggt ga 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1564756-F
<400> 49
gagcacatcc aactccgttt 20
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1564756-R
<400> 50
gcagaaccca acttgcaga 19
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9862357-F
<400> 51
ccaccacact ggcctacatt 20
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9862357-R
<400> 52
gcaggtggaa taaacaagaa gg 22
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2315310-F
<400> 53
ttgatgccat ggtaaatgaa a 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2315310-R
<400> 54
tcagcaagat tgcaggatac a 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7610438-F
<400> 55
tggtttccta tcttcctcct g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7610438-R
<400> 56
tccactctca ctgcctcact t 21
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7633580-F
<400> 57
tttcttggga aataaacctt gc 22
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7633580-R
<400> 58
atgcaggtct caggcaaaat 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs6549245-F
<400> 59
tttcaaagca agacccaagc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs6549245-R
<400> 60
acattttgcc aggaaacagc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs12492592-F
<400> 61
ggggaaaaac agtacgcttc 20
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs12492592-R
<400> 62
tgagaaggtg tgttagggtg tg 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs55921103-F
<400> 63
gccttgtgtt agtgctttag cc 22
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs55921103-R
<400> 64
cataggtacc ttccttaact ccag 24
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs12495615-F
<400> 65
catacatata aagcatttgg caca 24
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs12495615-R
<400> 66
catgtactgg cctcctttgc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1491694-F
<400> 67
ttgcaatcgt gtgatccaat 20
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1491694-R
<400> 68
caaaaaccaa tagaaagtgt gtgtg 25
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7631644-F
<400> 69
tgcgtgaaca agagttttgc 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7631644-R
<400> 70
aagggtggtt ccagaggatt 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs4547664-F
<400> 71
gaaccccaaa tcttctgtgc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs4547664-R
<400> 72
gcaactgggg taagagaagg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7616256-F
<400> 73
gctcttgcca atgtctcctc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7616256-R
<400> 74
gccaaaggat taagccaaaa 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs6800927-F
<400> 75
gagcctggtt tcatttgtcc 20
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs6800927-R
<400> 76
ggatttcttt gtgagatctc ctg 23
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9834236-F
<400> 77
caatgtgact tgcctgagtg a 21
<210> 78
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs9834236-R
<400> 78
ccatacatct aaatgctctg agtttg 26
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs66686363-F
<400> 79
tagggacagg cctcagaaga 20
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs66686363-R
<400> 80
gacgggccac acctacag 18
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs56336456-F
<400> 81
acccccgaat agcctaacag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs56336456-R
<400> 82
gttgctgcct gatcgtttct 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1967033-F
<400> 83
tggtggacag acaaccaaca 20
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1967033-R
<400> 84
ttcctcaccc taaaacagtt cc 22
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7652451-F
<400> 85
tgcagctctc ctgccttaac 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7652451-R
<400> 86
agcctgggca tcatagtgag 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MITF mutation-F
<400> 87
aagagcactg gccaaagaga 20
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MITF mutation-R
<400> 88
aaacattttt gatatatggg gaaca 25
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amelo-F
<400> 89
tcaacttcag ctatgaggta atttttc 27
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amelo-R
<400> 90
ccaaccatca gagcttaaac tgg 23
<210> 91
<211> 182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amelo male
<400> 91
tcaacttcag ctatgaggta atttttctct ttactaattt tgatcactgt ttgcattagc 60
agtcccctgg gctctgtaaa gaatagtggg tggattcttc atcccaaata aagtggtttc 120
tcaagtggtc ccaattttac agttcctacc atcagcttcc cagtttaagc tctgatggtt 180
gg 182
<210> 92
<211> 176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amelo female
<400> 92
tcaacttcag ctatgaggta atttttctct ttactaattt tgaccattgt ttgcgttaac 60
aatgccctgg gctctgtaaa gaatagtgtg ttgattcttt atcccagatg tttctcaagt 120
ggtcctgatt ttacagttcc taccaccagc ttcccagttt aagctctgat ggttgg 176
Claims (2)
1.用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如Seq IDNo.1-40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点；每一对引物扩增MITF基因中的一个区域；引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，而来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不相同。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：还包括核苷酸序列如Seq ID No.41-44所示的2对引物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201810480505.0A CN108531583B (zh) | 2018-05-18 | 2018-05-18 | 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法 |
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2018
- 2018-05-18 CN CN201810480505.0A patent/CN108531583B/zh not_active Expired - Fee Related
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