CN108531540B - 一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法 - Google Patents

一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法，属于病理学实验技术领域。该染液主要是由下述原料制成的：苏木素，媒染试剂，氧化剂，酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水；媒染剂为十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种；氧化剂为碘酸钠、高锰酸钾中的任意一种；酸为醋酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种。本发明成功解决了长期困扰医学病理诊断领域HE染色，关于苏木素染液稳定性差、保质期短、有金属膜、有染料残渣、起泡沫、核质对比不清晰，层次不分明、核染颜色暗等问题。

Description

一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法，属于病理学实验技术领域。
背景技术
苏木素染液是病理实验室常规的细胞核染色剂，其配方也多种多样。市场上常见的苏木素染液主要区别在于：一、氧化剂的不同。有长期放置自然氧化的，有利用***、高锰酸钾氧化剂快速氧化的，有使用碘酸钠氧化剂缓速氧化的；二、媒染剂的不同。常见的媒染剂为硫酸铝、三氯化铁、十二水硫酸铝钾、硫酸铜等；三、用的酸不同。常使用的酸为醋酸、盐酸、柠檬酸等。
但总的来说，苏木素染液每一种配方都存在共同的问题：一、氧化过度形成着色团被破坏的过氧化苏木精，染液表面氧化的苏木素与空气中的氧气接触，进一步氧化形成过氧化苏木精，过氧化苏木精聚集形成片层，即为氧化膜，过多的过氧化苏木精容易与媒染剂形成聚合沉积；染色能力下降也是由于氧化的苏木素不断过氧化的结果；二、核染颜色暗且核质着色层次不分明；三、此外苏木素染液形成大量泡沫，影响病理实验的染色操作及染色结果。
发明内容
为解决现有苏木素染液容易产生沉淀、核染颜色暗且核质着色层次不分明、染液形成泡沫。本发明提供了一种新型无汞环保苏木素染液及其制备方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种新型无汞环保苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，媒染试剂，氧化剂，酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水；所述媒染剂为十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种；所述氧化剂为碘酸钠或高锰酸钾；所述酸为醋酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种。
本发明所述乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量比为(0.2-0.4)：4(g/g)。优选为(0.3-0.4)：4(g/g)，最优为0.4:4(g/g)。
本发明所述异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为(3-5)：4(mL/g)，优选为(4-5)：4(mL/g)，最优为5：4(mL/g)。
本发明所述十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为(20-24):4(g/g)，优选为(22-24):4(g/g)，最优为24:4(g/g)。
本发明所述硫酸铝与苏木素的质量比为(4-8):4(g/g)，优选为(6-8):4(g/g)，最优为8:4(g/g)。
本发明所述三氯化铁与苏木素的质量比为(4-8):4(g/g)，优选为(6-8):4(g/g)，最优为8:4(g/g)。
本发明所述硫酸铜与苏木素的质量比为(8-12):4(g/g)，优选为(10-12):4(g/g)，最优值为12:4(g/g)。
本发明所述碘酸钠与苏木素的质量比为(0.2-0.4):4(g/g)，优选为(0.3-0.4):4(g/g)，最优值为0.4:4(g/g)。
本发明所述高锰酸钾与苏木素的质量比为(0.1-0.3):4(g/g)，优选为(0.2-0.3):4(g/g)，最优值为0.3:4(g/g)。
本发明所述醋酸与苏木素之比为(6-10):4(mL/g)，优选为(8-10):4(mL/g)，最优值为10:4(mL/g)。
本发明所述盐酸与苏木素之比为(7-11):4(mL/g)，优选为(9-11):4(mL/g)，最优值为11:4(mL/g)。
本发明所述柠檬酸与苏木素质量之比为(16-20):4(g/g)，优选为(18-20):4(g/g)，最优为20:4(g/g)。
本发明所述甘油与苏木素之比为(80-120):4(mL/g)，优选为(100-120):4(mL/g)，最优为120:4(mL/g)。
最优选地，本发明所述苏木素染液中：所述乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量比为0.4:4；所述异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；所述十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4；所述碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4；所述醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；所述甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)。
优选地，本发明苏木素染液还包括有机硅油；所述有机硅油与苏木素之比为(0.2-0.4):4(mL/g)，优选为(0.3-0.4):4(mL/g)，最优为0.4:4(mL/g)。
最优选地，本发明所述苏木素染液中：所述乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量比为0.4:4；所述异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；所述十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；所述碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；所述醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；所述甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)；所述有机硅油与苏木素之比为0.4:4(mL/g)。
本发明还提供了一种上述苏木素染液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)溶液A的制备：将苏木素与水进行混合后边搅拌边加热至60℃-70℃，然后加入氧化剂，并进行恒温搅拌，然后密封放置3周-4周，获得溶液A；
2)溶液B的制备：将媒染剂与水进行混合，搅拌至全部溶解，静置过夜，获得溶液B；
3)将步骤1)获得的溶液A与步骤2)获得的溶液B混合后搅拌均匀，立即加入甘油，搅拌均匀后加入异构十三醇聚氧乙烯醚，搅拌均匀后再加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后加入酸，搅拌均匀；
4)加水后放置过夜，过滤后即获得苏木素染液。
优选地，在步骤3)加入酸搅拌均匀之后加入有机硅油，具体为：
1)溶液A的制备：将苏木素与水进行混合后边搅拌边加热至60℃-70℃，然后加入氧化剂，并进行恒温搅拌，然后密封放置3周-4周，获得溶液A；
2)溶液B的制备：将媒染剂与水进行混合，搅拌至全部溶解，静置过夜，获得溶液B；
3)将步骤1)获得的溶液A与步骤2)获得的溶液B混合后搅拌均匀，立即加入甘油，搅拌均匀后加入异构十三醇聚氧乙烯醚，搅拌均匀后再加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后加入酸，搅拌均匀；
4)加入有机硅油，搅拌均匀；
5)加水后放置过夜，过滤后即获得苏木素染液。
现有技术中一般将氧化成熟的苏木素与媒染剂一起混合配制，存在极容易出现沉淀的问题，本发明重新建立了一种苏木素染液的配置方法，通过分别将氧化成熟的苏木素与媒染剂(如十二水硫酸铝钾)各自单独配制，然后将已经均匀溶解的媒染剂(B液)与氧化成熟的A液快速融合后，马上加入的甘油、异构十三醇聚氧乙烯醚、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、冰醋酸，并且在A液制备过程中通过控制氧化剂和溶剂的加入量、初期的温度、后期氧化平衡所需时间及其他条件进而控制苏木素的氧化条件，使苏木素局部氧化平衡而不发生过氧化，进一步减少甚至防止沉淀的生成，从而克服苏木素与十二水硫酸铝钾络合沉积问题，解决了现有方法一直未解决的产生沉淀的问题。
本发明将氧化的苏木素与媒染剂混合后马上加入丙三醇(甘油)，使丙三醇与氧化苏木精形成“空间阻隔效应”，能够进一步阻止媒染剂与氧化的苏木精聚合成沉淀。
本发明还通过调整氧化剂的加入量，使加入苏木素量的一半被氧化，并长期放置，使苏木素趋于氧化平衡，这样几乎不出现苏木素过氧化现象。
为了解决苏木素染液不能达到染液长期稳定的问题，本发明向苏木素染液中添加乙二胺四乙酸二钠，能够确保苏木素染液长期稳定，不产生氧化膜和沉淀。
成熟稳定的苏木素染液，长期与空气中的氧气接触形成氧化膜，本发明通过添加异构十三醇聚氧乙烯醚，可溶解形成的氧化膜，获得稳定溶液，维持苏木素染液高清染色的长效性。
本发明通过调整酸的最适加入量，这样既能避免由于酸的加入量过多而使细胞核的染色不够鲜亮，也能避免由于酸的加入量过少而引起的细胞核质区分不明显，从而提高了苏木素染色液核染鲜亮度和细胞核质对比清晰、层次分明。
苏木素染液在使用过程中会形成大量泡沫，从而影响病理实验的染色操作及染色结果，本发明中通过加入有机硅油，达到消除泡沫并且不影响病理实验染色。
本发明有益效果：
本发明通过将苏木素的氧化和溶解、十二水硫酸铝钾的溶解、苏木素氧化后与十二水硫酸铝钾络合三个过程进行了分开处理，即通过A、B液的分开配制，解决了如下问题：1)苏木素的氧化不充分或过氧化；2)初期未氧化的苏木素与十二水硫酸铝钾络合沉积而被滤除掉，降低染色效果。
通过提高甘油的加入量，提高了苏木素和十二水硫酸铝钾在溶剂中的溶解性，使其不易析出。通过降低了十二水硫酸铝钾的用量，提高了其利用率，且同时避免因温度、pH等条件变化而使其析出的问题。通过调整酸的用量，解决了苏木素染液核染暗淡的问题。通过加入乙二胺四乙酸二钠，促进了苏木素染液表面氧化膜的溶解，并使染液处于稳定的离子平衡状态。通过加入十三醇聚氧乙烯醚，进一步加强溶液的均匀、不沉积，达到溶液均一、稳定效果。通过加入有机硅油，避免了因震荡或摇动等原因产生大量气泡，影响染色的操作和染色效果。
本发明成功解决了长期困扰医学病理诊断领域HE染色，关于苏木素染液稳定性差保质期短、易沉积、起泡沫、核染颜色暗等问题。
附图说明
图1为传统苏木素染液制片(HE×40)。
图2为本发明苏木素染液制片(HE×40)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
本实施例提供了一种苏木素染液，主要是由下述组分配制而成：苏木素，媒染试剂，氧化剂，酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水；媒染剂为十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种；氧化剂为碘酸钠或高锰酸钾；酸为醋酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种。
实施例1：乙二胺四乙酸二钠(EDTA)添加量
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，碘酸钠，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；调整乙二胺四乙酸二钠的添加量，使乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比分别为0.1:4(g/g)(实验组1)、0.2:4(g/g)(实验组2)、0.3:4(g/g)(实验组3)、0.4:4(g/g)(实验组4)、0.5:4(g/g)(实验组5)。
对照组1：不添加乙二胺四乙酸二钠，其余组分添加量与实验组1-5相同。
苏木素染液的制备方法如下：
1)溶液A的制备：将苏木素与水按照4:(200-220)(g/mL)进行混合后边搅拌边加热至60℃-70℃，然后加入氧化剂，并进行恒温搅拌，然后密封放置3周-4周，获得溶液A；
2)溶液B的制备：将媒染剂与水按照8：(330-660)(g/mL)进行混合，搅拌至全部溶解，静置过夜，获得溶液B；
3)将步骤1)获得的溶液A与步骤2)获得的溶液B混合后搅拌均匀，立即加入甘油后搅拌均匀，加入异构十三醇聚氧乙烯醚，搅拌均匀，再加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀，然后加入酸，搅拌均匀；
4)加水后放置过夜，过滤后即获得苏木素染液。
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表1所示。
表1按照实验组1-5和对照组配置苏木素染液比对结果
是否有金属膜(≤36个月) 稳定期限
对照组(不添加EDTA) 有金属膜(+++) ≤6个月
实验组1(0.1：4) 有金属膜(+) ≤12个月
实验组2(0.2：4) 无金属膜 ≤18个月
实验组3(0.3：4) 无金属膜 ≤24个月
实验组4(0.4：4) 无金属膜 ≤36个月
实验组5(0.5：4) 不稳定，有沉积 不稳定
表1中“+”代表金属膜生成量的多少，染液中有金属膜影响组织切片染色不利于病理诊断并且影响染液稳定性，稳定期限衡量染液的稳定性，是染液好坏的衡量标准；是否有金属膜(≤36个月)，其中≤36个月证明染液36个月内都稳定有效。
由表1可知：当乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为(0.2-0.4)：4(g/g)时，不产生金属膜，并且稳定期限长达18个月-36个月，效果较好，当乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4：4时，不产生金属膜，并且稳定期限最长可达36个月，效果最好，因此乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比可为(0.2-0.4)：4(g/g)，优选为(0.3-0.4)：4(g/g)，最优为0.4：4(g/g)。
实施例2：异构十三醇聚氧乙烯醚添加量
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，碘酸钠，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4:4(g/g)；调整异构十三醇聚氧乙烯醚的添加量，使异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比(mL/g)分别为2:4(实验组1)、3:4(实验组2)、4:4(实验组3)、5:4(实验组4)、6:4(实验组5)。
对照组：不添加异构十三醇聚氧乙烯醚，其余组分添加量与实验组1-5相同。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表2所示。
表2按照实验组1-5和对照组配置苏木素染液比对结果
Figure BDA0001239052060000061
表2中“+”代表染色的鲜亮强度。
由表2可知：当异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为(2-5)：4(mL/g)时，染液稳定，染色鲜亮，效果较好，当异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5：4(mL/g)时，染色鲜亮，染液稳定，稳定期限最长可达36个月，效果最好，因此异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比可为(2-5)：4(mL/g)，优选为(3-5)：4(mL/g)，最优为5：4(mL/g)。
实施例3：媒染试添加量的确定
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，媒染试剂，碘酸钠，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4:4(g/g)，异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；其余为水。媒染试剂为十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种。
当媒染试剂为十二水硫酸铝钾时，调整十二水硫酸铝钾的添加量，使十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比(g/g)分别为18:4(实验组1)、20:4(实验组2)、22:4(实验组3)、24:4(实验组4)、26:4(实验组5)。
当媒染试剂为硫酸铝时，调整硫酸铝的添加量，使硫酸铝与苏木素的质量比(g/g)分别为2:4(实验组6)、4:4(实验组7)、6:4(实验组8)、8:4(实验组9)、10:4(实验组10)。
当媒染试剂为三氯化铁时，调整三氯化铁的添加量，使三氯化铁与苏木素的质量比(g/g)分别为2:4(实验组11)、4:4(实验组12)、6:4(实验组13)、8:4(实验组14)、10:4(实验组15)。
当媒染试剂为硫酸铜时，调整硫酸铜的添加量，使硫酸铜与苏木素的质量比(g/g)分别为6:4(实验组16)、8:4(实验组17)、10:4(实验组18)、12:4(实验组19)、14:4(实验组20)。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表3所示。
表3按照实验组1-15配置苏木素染液比对结果
Figure BDA0001239052060000071
Figure BDA0001239052060000081
表3中“+”代表染色的鲜亮程度。
由表3可知：本发明媒染试剂采用十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种时在染液稳定性、染色效果、稳定期限等方面均取得了良好的效果，当媒染试剂为十二水硫酸铝钾时，实验组4效果最好，实验组2和3效果次之，实验组1和5效果再次之，因此，十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比(g/g)可为(20-24):4，优选为(22-24):4，最优为24:4。当媒染试剂为硫酸铝时，实验组9效果最好，实验组7和8效果次之，实验组6和10效果再次之，因此，硫酸铝与苏木素的质量比(g/g)可为(4-8):4，优选为(6-8):4，最优为8:4。当媒染试剂为三氯化铁时，实验组14效果最好，实验组12和13效果次之，实验组11和15效果再次之，因此，三氯化铁与苏木素的质量比(g/g)为(4-8):4，优选为(6-8):4，最优为8:4。当媒染试剂为硫酸铜时，实验组19效果最好，实验组17和18效果次之，实验组16和20效果再次之，因此，硫酸铜与苏木素的质量比(g/g)的范围为(8-12):4，优选为(10-12):4，最优值为12:4。
通过比较试验组1-20，媒染试剂十二水硫酸铝钾的染色效果最好，染液的有效期限最长。综上所述，用十二水硫酸铝钾做媒染剂时，染液稳定性、病理诊断切片染色效果最好，其他媒染剂的染色效果次之，且相近。
实施例4：氧化剂的添加量
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，氧化剂，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4:4(g/g)，异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5：4(mL/g)；其余为水。氧化剂为碘酸钠或高锰酸钾。
当媒染试剂为碘酸钠时，调整碘酸钠的添加量，使碘酸钠与苏木素的质量比(g/g)分别为0.1：4(实验组1)、0.2：4(实验组2)、0.3：4(实验组3)、0.4：4(实验组4)、0.5：4(实验组5)。
当媒染试剂为高锰酸钾时，调整高锰酸钾的添加量，使高锰酸钾与苏木素的质量比(g/g)分别为0.05：4(实验组6)、0.1：4(实验组7)、0.2：4(实验组8)、0.3：4(实验组9)、0.4：4(实验组10)。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表4所示。
表4按照实验组1-10配置苏木素染液比对结果
Figure BDA0001239052060000091
表4“+”代表切片染色的鲜亮程度。
由表4可知：本发明氧化剂采用碘酸钠或高锰酸钾时在染液稳定性、染色效果、稳定期限等方面均取得了良好的效果，当氧化剂为碘酸钠时，实验组4效果最好，实验组2和3效果次之，实验组1和5效果再次之，因此，碘酸钠与苏木素的质量比(g/g)范围为(0.2-0.4):4，优选为(0.3-0.4):4，最优值为0.4:4。当媒染试剂为高锰酸钾时，实验组9效果最好，实验组7和8效果次之，实验组6和10效果再次之，因此，高锰酸钾与苏木素的质量比(g/g)的范围为(0.1-0.3):4，优选为(0.2-0.3):4，最优值为0.3:4。并且碘酸钠的效果更好。
实施例5：酸的添加量的确定
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，碘酸钠，酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量之比为0.4:4(g/g)，异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；其余为水。酸为醋酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种。
当酸为醋酸时，调整醋酸的添加量，使醋酸与苏木素之比(mL/g)分别为4:4(实验组1)、6:4(实验组2)、8:4(实验组3)、10:4(实验组4)、12:4(实验组5)。
当酸为盐酸时，调整盐酸的添加量，使盐酸与苏木素之比(mL/g)分别为5:4(实验组6)、7:4(实验组7)、9:4(实验组8)、11:4(实验组9)、13:4(实验组10)。
当酸为柠檬酸时，调整柠檬酸的添加量，使柠檬酸与苏木素质量之比(g/g)分别为14:4(实验组16)、16:4(实验组17)、18:4(实验组18)、20:4(实验组19)、22:4(实验组20)。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表5所示。
表5按照实验组1-10配置苏木素染液比对结果
Figure BDA0001239052060000101
Figure BDA0001239052060000111
表5中“+”代表染色鲜亮程度。
由表5可知：本发明酸采用醋酸或盐酸或柠檬酸时在染液稳定性影响、染色效果、稳定期限等方面均取得了良好的效果，当使用醋酸时，实验组4效果最好，实验组2和3效果次之，实验组1和5效果再次之，因此，醋酸与苏木素之比(mL/g)的范围为(6-10):4，优选为(8-10):4，最优值为10:4。当使用盐酸时，实验组9效果最好，实验组7和8效果次之，实验组6和10效果再次之，因此，盐酸与苏木素之比(mL/g)的范围为(7-11):4，优选范围为(9-11):4，最优值为11:4。当使用柠檬酸时，实验组14效果最好，实验组12和13效果次之，实验组11和15效果再次之，因此，柠檬酸与苏木素质量之比(g/g)为(16-20):4，优选范围为(18-20):4，最优值为20:4。并且醋酸的效果更好。
实施例6：甘油的添加量的确定
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，碘酸钠，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4:4(g/g)，异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；调整甘油的添加量，使甘油与苏木素之比(mL/g)分别为60:4(实验组1)、80:4(实验组2)、100:4(实验组3)、120:4(实验组4)、140：(实验组5)。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表6所示。
表6按照实验组1-5配置苏木素染液比对结果
对染液稳定性的影响 稳定性期限 染色效果
实验组1(60：4) 不稳定，浑浊 ≤6个月 染色鲜亮(++)
实验组2(80：4) 稳定，略浑浊 ≤20个月 染色鲜亮(++)
实验组3(100：4) 稳定，澄清 ≤24个月 染色鲜亮(+++)
实验组4(120：4) 稳定，澄清 ≤36个月 染色鲜亮(+++)
实验组5(140：4) 稳定，澄清 ≤36个月 染色浅
表6中“+”代表染色鲜亮程度。
由表6可知：本发明实验组1-5在染液稳定性、稳定性期限、染色效果等方面均取得了良好的效果，其中实验组4效果最好，实验组2和3效果次之，实验组1和5效果再次之，因此，甘油与苏木素的比(mL/g)的范围为(80-120):4，优选为(100-120):4，最优值为120:4。
实验组7：有机硅油添加量的确定
本实施例提供了一种苏木素染液，该苏木素染液主要是由下述组分配制而成：苏木素，十二水硫酸铝钾，碘酸钠，醋酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水，其中：十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，乙二胺四乙酸二钠与苏木素质量之比为0.4:4(g/g)；异构十三醇聚氧乙烯醚与与苏木素之比为5:4(mL/g)；
添加有机硅油，并且调整有机硅油的添加量，使有机硅油与苏木素之比(mL/g)分别为0.1:4(实验组1)、0.2:4(实验组2)、0.3:4(实验组3)、0.4:4(实验组4)、0.5:4(实验组5)。
对照组：不添加有机硅油，其余组分添加量与实验组1-5相同。
苏木素染液的制备方法同实施例1：
按照上述配方和方法配置苏木素染液，对染液的稳定性和染色效果进行比对，结果如表7所示。
表7按照实验组1-5和对照组配置苏木素染液比对结果
Figure BDA0001239052060000121
Figure BDA0001239052060000131
表7中“+”代表泡沫的生成量或染色鲜亮程度。
由表7可知：通过对比对照组与实验组1-5可知，添加有机硅油可以达到消除泡沫的效果，并且染色效果好，染液稳定性好，因此使用有机硅油可以很好的解决染液产生泡沫的问题。通过比较实验组发现实验组4效果最好，无泡沫，染色鲜亮，染液稳定，实验组2和3效果次之，因此有机硅油与苏木素之比(mL/g)的范围为(0.2-0.5):4，优选为(0.3-0.5):4，最优值为0.4:4。
实施例8
综合实施例1-7可知，本发明苏木素染液的最优配方为：乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为5:4(mL/g)；十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为24:4(g/g)；碘酸钠与苏木素的质量比为0.4:4(g/g)；醋酸与苏木素之比为10:4(mL/g)；甘油与苏木素之比为120:4(mL/g)，有机硅油与苏木素之比为0.4:4(mL/g)，其余为水。
按照本发明配方和方法制备本发明苏木素染液，按照传统苏木素制备方法制备传统苏木素染液(照传统苏木素染液的配方和配置方法配置1L苏木素染液，具体如下：
每2g苏木素加入250mL无水乙醇，10g硫酸铝加入蒸馏水750mL，两液加热煮沸2min，再加入碘酸钠0.5g，柠檬酸1.0g搅拌均匀，放置过夜即得苏木素染。
将两种苏木素染液进行比较，如表8所示。
表8传统苏木素染液和本发明最优配方苏木素染液的比较
Figure BDA0001239052060000132
通过表1可以知道：由于配方和配制方法的原因，传统染液的稳定性差，且有效期短，染色效果也很差；而本发明苏木素染液，稳定性好，保质期长，且染色均匀，核质对比清晰，层次分明。
然后分别将按照本发明最优配方获得的苏木素染液与按照传统苏木素制备方法制备传统苏木素染液进行制备切片，如图1和图2所示。
从图1中可以看出：细胞核与细胞质染色对比不鲜明、结构清晰度一般。从图2中可以看出：细胞核与细胞质染色对比鲜明、结构更清晰。图2中切片颜色明显比图1中更鲜亮、鲜明、清晰。因此本发明苏木素染液制备的切片比传统苏木素染液制备的切片染色效果好，细胞核与细胞质染色对比鲜明、结构更清晰。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种无汞环保苏木素染液，其特征在于，主要是由下述组分配制而成：苏木素，媒染剂，氧化剂，酸，乙二胺四乙酸二钠，异构十三醇聚氧乙烯醚，甘油和水；所述媒染剂为十二水硫酸铝钾、硫酸铝、三氯化铁和硫酸铜中的任意一种；所述氧化剂为碘酸钠或高锰酸钾；所述酸为醋酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种；
其中，所述乙二胺四乙酸二钠与苏木素的质量比为(0.2-0.4):4(g/g)；
所述异构十三醇聚氧乙烯醚与苏木素之比为(3-5)：4(mL/g)；
所述十二水硫酸铝钾与苏木素的质量比为(20-24)：4(g/g)，或所述硫酸铝与苏木素的质量比为(4-8)：4(g/g)，或所述三氯化铁与苏木素的质量比为(4-8):4(g/g)，或所述硫酸铜与苏木素的质量比为(8-12):4(g/g)；
所述碘酸钠与苏木素的质量比为(0.2-0.4):4(g/g)；或所述高锰酸钾与苏木素的质量比为(0.1-0.3):4(g/g)；
所述醋酸与苏木素之比为(6-10):4(mL/g)，或所述盐酸与苏木素之比为(7-11):4(mL/g)，或所述柠檬酸与苏木素质量之比为(16-20):4；
所述甘油与苏木素之比为(80-120):4(mL/g)。
2.根据权利要求1所述的苏木素染液，其特征在于，还包括有机硅油；所述有机硅油与苏木素之比为(0.3-0.4):4(mL/g)。
3.一种权利要求1所述的苏木素染液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)溶液A的制备：将苏木素与纯净水进行混合后边搅拌边加热至60℃-70℃，然后加入氧化剂，并进行恒温搅拌，然后密封放置3周-4周，获得溶液A；
2)溶液B的制备：将媒染剂与水进行混合，搅拌至全部溶解，静置过夜，获得溶液B；
3)将步骤1)获得的溶液A与步骤2)获得的溶液B混合后搅拌均匀，立即加入甘油，搅拌均匀后加入异构十三醇聚氧乙烯醚，搅拌均匀后再加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后加入酸，搅拌均匀；
4)加水后放置过夜，过滤后即获得苏木素染液。
4.根据权利要求3所述的苏木素染液的制备方法，其特征在于，在步骤3)加入酸搅拌均匀之后加入有机硅油。
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