CN108517343A - 一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：以条斑紫菜为原料进行粉碎处理、水提取、灭菌处理，得到浸提液；将得到的浸提液接种乳酸菌进行发酵，发酵后将混合液进行灭菌处理；将灭菌后的混合液采用木瓜蛋白酶进行酶解处理；酶解结束后进行灭活处理，冷却后，进行离心分离，收集上清液；将收集的上清液过滤后，进行干燥，即得条斑紫菜抗氧化蛋白肽。本发明提供的条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，通过能将乳酸菌发酵和酶解法进行结合，不仅可以制得没有苦味且具有发酵风味、适口性好的肽产品；还能大大提高所制备的抗氧化蛋白肽的对·OH自由基和DPPH·自由基的去除能力；对提高紫菜的附加值具有积极的影响。

Description

一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物应用技术领域，特别涉及一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法。
背景技术
条斑紫菜是海洋食用藻类，广泛存在于江苏沿海领域。紫菜营养丰富，通常蛋白质含量较高，比海带高出数倍。紫菜蛋白是一种优质蛋白质，因其高含量及独特的生物学功能，受到了人们广泛关注，是紫菜开发利用中的研究热点。
紫菜蛋白肽作为紫菜蛋白的主要活性物质，具有降血压、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、参与机体调节免疫等多种生理功效。紫菜蛋白肽可以通过酶水解法、发酵法制得。
现有技术中，以江苏沿海条斑紫菜为原料，采用不同条件下酶解制备紫菜蛋白抑菌肽和紫菜α-葡萄糖苷酶抑制剂；也有以坛紫菜为原料，采用胰蛋白酶水解坛紫菜蛋白制备坛紫菜蛋白肽，通过体外实验验证,经最优工艺酶解得到的坛紫菜蛋白肽具有良好的降血压、降胆固醇和抗氧化活性；还有以条斑紫菜为原料，采用酶解-膜分离技术从紫菜酶解产物中分离纯化制得抗氧化蛋白肽。
由以上现有技术中可知，制备抗氧化蛋白肽采用酶解的方法较普遍，酶解方法具有生厂成本低、条件温和、水解过程易控制的优点，但采用酶解法生产的肽苦味较重，适口性差，且制得的蛋白肽的羟自由基和DPPH·的清除率均较低。
现有技术中，也有采用发酵法制备抗氧化蛋白肽的方法，和酶解法相比，发酵法制备肽的得率不高，且制备的蛋白肽对去除·OH自由基和DPPH·自由基的去除率也较低。
发明内容
为解决以上背景技术中的问题，本发明提供一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
S100、以条斑紫菜为原料进行粉碎处理、水提取、灭菌处理，得到浸提液；
S200、将得到的浸提液接种乳酸菌进行发酵，乳酸菌的接种量为1％～3％，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间20～36小时，发酵后将混合液进行灭菌处理；
S300、将灭菌后的混合液采用木瓜蛋白酶进行酶解处理，木瓜蛋白酶添加量为条斑紫菜质量的0.5％～2％，酶解温度为55℃～65℃，酶解反应时间为2～4小时；酶解结束后进行灭活处理，冷却后，进行离心分离，收集上清液；
S400、将收集的上清液过滤后，进行干燥，即得条斑紫菜抗氧化蛋白肽。
进一步地，S100中，所述粉碎处理、水提取、灭菌包括：将条斑紫菜粉碎后与水按照料水比为1:20～1:50混合，经搅拌处理20min～30min进行浸提；所述料水比的单位为g/mL；
将得到的浸提液于115℃～125℃下处理10min～30min进行杀灭病原菌后冷却至30℃～40℃备用。
进一步地，步骤S200中，所述乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌中的至少一种。
进一步地，步骤S200中，乳酸菌接种浸提液前，接种于MRS培养基，活化10～12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分。
进一步地，MRS培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L,七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L；
所述MRS培养基的pH为6.8，并于115℃灭菌30min～40min。
进一步地，酶解2～4小时后，控制温度在0℃～5℃，往反应室中冲入氮气，用减压阀调整进气量2升/小时,充气时间2h,反应室压力控制1.5bar；同时采用超声处理，并用紫外光照射12min～15min；紫外光处理结束后，继续通入氮气反应室压力控制1.0bar，温度升至在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液。
进一步地，S400中，将上清液进行过滤的方法包括：采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集得到滤液。
进一步地，S400中干燥方法包括：采用真空干燥箱，将浓缩液干燥成粉；浓缩干燥温度为55℃～60℃，干燥时间为10h～15h。
本发明提供的技术方案通过能将乳酸菌发酵和酶解法进行结合，通过乳酸菌产酶和酶解合成一步，省去了酶的分离和提纯步骤，而且通过乳酸菌代谢产生的端肽酶可以对小肽的末端进行修饰、重组，使氨基酸重排、转移，不仅可以制得没有苦味且具有发酵风味的肽产品，适口性好；还能大大提高制备的抗氧化蛋白肽的对·OH自由基和DPPH·自由基的去除能力；本发明采用食用乳酸菌发酵结合酶解法生产紫菜抗氧化蛋白肽产品，对开发紫菜保健食品，提高紫菜的附加值具有积极的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的方法所制备的条斑紫菜蛋白肽对羟自由基的清除率与浓度的关系；
图2为本发明提供的方法所制备的条斑紫菜蛋白肽对DPPH·自由基的清除率与浓度的关系。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
S100、以条斑紫菜为原料进行粉碎处理、水提取、灭菌处理，得到浸提液；
S200、将得到的浸提液接种乳酸菌进行发酵，乳酸菌的接种量为1％～3％，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间20～36小时，发酵后将混合液进行灭菌处理；
S300、将灭菌后的混合液采用木瓜蛋白酶进行酶解处理添加量为条斑紫菜质量的0.5％～2％，酶解温度为55℃～65℃，酶解反应时间为2～4小时；酶解结束后进行灭活处理，冷却后，进行离心分离，收集上清液；
其中，木瓜蛋白酶的酶活性为2×105U/g；灭活处理的温度为100℃～105℃，处理时间为15min～20min；
S400、将收集的上清液过滤后，进行干燥，即得条斑紫菜抗氧化蛋白肽。
其中，S100中，所述粉碎处理、水提取、灭菌包括：将条斑紫菜粉碎后采用40目过筛并与水按照料水比为1:20～1:50混合，单位为g/mL；经搅拌处理20min～30min进行浸提；浸提后，将得到的浸提液于115℃～125℃下处理10min～30min进行杀灭病原菌后冷却至30℃～40℃备用。
步骤S200中，所述乳酸菌可以采用***颁发的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)所列的乳酸菌菌株，包括但不限于保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的至少一种或多种组合。
乳酸菌接种浸提液前，接种于新鲜MRS培养基，活化10～12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分。
其中，MRS培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L,七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L；
所述MRS培养基的pH为6.8，并于115℃灭菌30min～40min。
S300中，优选地，酶解2～4小时后，控制温度在0℃～5℃，往反应室中冲入氮气，用减压阀调整进气量2升/小时,充气时间2h,反应室压力控制1.5bar；同时采用超声处理，并用紫外光照射12min～15min；紫外光处理结束后，继续通入氮气反应室压力控制1.0bar，温度升至在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液。
该优选方案通过在酶解过程中，采用紫外光进行处理，一方面能够更好地破坏紫菜的细胞壁，使蛋白质进一步溶解，提高制备效率；另一方面，在采用发酵乳杆菌的进行酶解反应时，紫外光能够提供能量，促进发酵乳杆菌与氨基酸的反应更完全，使氨基酸的侧链更充分地暴露；然而，紫外光的使用又存在许多问题，若使用不当将造成肽链的水解，从而降低产品得率且降低产品的质量。在本步骤中，先在低温条件下氮气作为惰性保护，防止肽链被氧化，采用超声处理，使氮气更好地附着在蛋白质周围，之后再用紫外光照射；该工艺中，对温度、氮气用量以及紫外光处理时间进行了控制，使紫外光提高发酵乳杆菌进行酶解反应，提高产品得率以及对·OH自由基和DPPH·自由基的清除能力同时，保证了紫外光不会产生不良的影响。
S400中，将上清液进行过滤的方法包括：采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集得到滤液。
S400中，干燥方法包括：采用真空干燥箱，将浓缩液干燥成粉，真空干燥箱的型号为DZG-6020，浓缩干燥温度为55℃～60℃，干燥时间为10h～15h，优选12h。
本发明提供以下实施例：
实施例一
S100、取20g条斑紫菜粉碎后采用40目过筛并加入500mL蒸馏水混匀；经搅拌处理20min进行浸提；浸提后，将浸提液于121℃下处理10min进行杀灭病原菌后冷却至40℃备用；
S200、将保加利亚乳杆菌接种于新鲜MRS培养基，活化12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分；
将上述活化后的培养液接种于S100制备的浸提液接中；其中保加利亚乳杆菌的接种量为3％，发酵温度为37℃，发酵时间36小时；发酵后混合液经90℃，10分钟热处理。
S300、加入0.3g木瓜蛋白酶(2×105U/g)，酶解温度为60℃，酶解反应为4小时；酶解结束后，在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液；
S400、采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液；采用DZG-6020型真空干燥箱，55℃下将浓缩液干燥12h，成品水分含量控制3％，取出成品粉碎过80目筛，获得条斑紫菜蛋白肽粉。
实施例二
S100、取20g条斑紫菜粉碎后采用40目过筛并加入500mL蒸馏水混匀；经搅拌处理20min进行浸提；浸提后，将浸提液于121℃下处理10min进行杀灭病原菌后冷却至40℃备用；
S200、将发酵乳杆菌接种于新鲜MRS培养基，活化12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分；
将上述活化后的培养液接种于S100制备的浸提液接中；其中发酵乳杆菌的接种量为3％，发酵温度为37℃，发酵时间36小时；发酵后混合液经90℃，10分钟热处理。
S300、加入0.3g木瓜蛋白酶(2×105U/g)，酶解温度为60℃，酶解反应为4小时；酶解结束后，在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液；
S400、采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液；采用DZG-6020型真空干燥箱，55℃下将浓缩液干燥12h，成品水分含量控制3％，取出成品粉碎过80目筛，获得条斑紫菜蛋白肽粉。
实施例三
S100、取20g条斑紫菜粉碎后采用40目过筛并加入500mL蒸馏水混匀；经搅拌处理20min进行浸提；浸提后，将浸提液于121℃下处理10min进行杀灭病原菌后冷却至40℃备用；
S200、将发酵乳杆菌接种于新鲜MRS培养基，活化12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分；
将上述活化后的培养液接种于S100制备的浸提液接中；其中发酵乳杆菌的接种量为3％，发酵温度为37℃，发酵时间36小时；发酵后混合液经90℃，10分钟热处理。
S300、加入0.3g木瓜蛋白酶(2×105U/g)，酶解温度为60℃，酶解反应为4小时；控制温度在0℃，往反应室中冲入氮气，用减压阀调整进气量2升/小时,充气时间2h,反应室压力控制1.5bar；同时采用超声处理，并用紫外光照射12min；
紫外处理结束后，继续通入氮气反应室压力控制1.0bar，温度升至在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液；
S400、采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液；采用DZG-6020型真空干燥箱，55℃下将浓缩液干燥12h，成品水分含量控制3％，取出成品粉碎过80目筛，获得条斑紫菜蛋白肽粉。
将实施例一为采用保加利亚乳杆菌作为发酵的乳酸菌，实施例二为采用发酵乳杆菌作为发酵的乳酸菌，实施例三为在实施例二的基础上进一步优化方案，将实施例一、二、三制得的条斑紫菜蛋白肽进行如下理化性质及其抗氧化性分析。
(1)、蛋白肽得率的测定分析
蛋白肽得率Y(％)以最终真空干燥得到的蛋白肽粉的质量与紫菜干粉的质量百分比为计算方法，以现有技术中采用发酵法制得条斑紫菜蛋白肽作为对比例一，测试紫菜抗氧化蛋白肽得率，结果如表1所示。
表1
名称 实施例一 实施例二 实施例三 对比例一
紫菜蛋白肽得率(％) 14.28 15.21 19.82 11.01
由表1可以看出，本发明通过采用乳酸菌结合木瓜蛋白酶进行酶解的方法所制备的紫菜抗氧化蛋白肽与现有技术的采用发酵法制备的抗氧化蛋白肽相比，得率明显提高；通过实施例一和实施例二对比，可以看出采用发酵乳杆菌制备得到蛋白肽的收率高于采用保加利亚乳杆菌制备蛋白肽的收率；而实施例三中，通过工艺的改进，其得率具有明显进步。
(2)、条斑紫菜蛋白肽的氨基酸组成的测定分析
氨基酸组成及含量测定按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》，条斑紫菜蛋白肽经盐酸水解法处理后，采用氨基酸自动分析仪测定，测定结果如表2所示：
表2
注：*表示必需氨基酸，△表示呈味氨基酸，“-”表示未检出
由表2可以看出，条斑紫菜蛋白中，氨基酸总量为28.46％，且鲜味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等含量较高，且天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等8种呈味氨基酸总量为15.85％，占氨基酸总量55.69％，说明紫菜味道鲜美，并且经过发酵酶解工艺，呈味氨基酸的含量均增加；
其中，保加利亚乳杆菌发酵酶解物中8种呈味氨基酸占氨基酸总量的60.75％，而发酵乳杆菌发酵酶解物中8种呈味氨基酸占氨基酸总量的59.33％，含量均有一定提升，说明乳酸菌发酵酶解法使紫菜口感得到进一步提升。
由表2还可以看出，经乳酸菌发酵酶解后，虽然天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸等氨基酸含量增加，但亮氨酸、组氨酸、精氨酸等氨基酸的含量有一定程度的降低，说明在经乳酸菌发酵酶解过程中，乳酸菌对部分氨基酸中的氮源进行了降解利用，并分泌出大量酶破坏紫菜细胞壁，使胞内蛋白溶解，并在木瓜蛋白酶的协同作用下降解成紫菜蛋白肽。由表2还可以看出，经发酵后，氨基酸总量上升，说明乳酸菌在分解发酵条斑紫菜过程中，产生酶类物质，这些酶类物质可有效降解大分子蛋白质、糖类等转变成为氨基酸等物质，从而提高了营养价值。
(3)、条斑紫菜蛋白肽的羟自由基(·OH)清除能力的测试
取步骤4中制备的条斑紫菜蛋白肽，制成浓度梯度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.5mg/mL的待测溶液，取1mL待测溶液，依次加入1mL浓度为9mM的FeSO4溶液和6mM的H2O2溶液，用振荡器混匀并静置10分钟，接着加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，用振荡器混匀，常温静置30分钟后于510nm处测定吸收值，记录数值。
蛋白肽对·OH自由基的清除效果用清除率表示，清除率计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸收值/空白吸收值)]×100％；
根据不同浓度的条斑紫菜蛋白肽溶液对羟自由基的清除率不同作图，结果如图1所示。
由图1可以看出，本发明所制得的条斑紫菜蛋白肽对羟自由基具有清除能力。
在研究的酶解产物(即条斑紫菜抗氧化蛋白肽)质量浓度范围内，随着酶解产物质量浓度的增加，由保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌结合酶解法制备的肽对羟自由基清除率增加，呈正相关。当酶解产物质量浓度为0.15mg/mL时，由保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽的羟自由基的清除率分别为45.89％和54.36％。当酶解产物质量浓度为0.5mg/mL时，由发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽的羟自由基的清除率为93.25％。
申请号为201110362654.5的专利公开了一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，其制备的紫菜抗氧化蛋白肽作为对比例二，申请号为201410533079.4的专利制备抗氧化蛋白肽作为对比例三，测试对羟自由基的清除率，结果如下表所示：
表3
浓度 实施例一 实施例二 实施例三 对比例二 对比例三
0.15mg/mL 45.89％ 54.36％ 60.13％ / /
0.5mg/mL 89.12％ 93.25％ 96.57％ / /
1.0mg/mL / / / / 20.26％
100mg/mL / / / 47.12％ /
由表3可以看出，本发明提供的实施例和对比例二和对比例二相比，在各自pH和温度保持适宜的情况下，实施例采用更低浓度，但能对羟自由基更高的清除率更高，可以看出具有显著的进步。
此外，为准确量化比较两种条斑紫菜蛋白肽清除羟自由基活性大小，对绘制清除率对底物浓度曲线进行拟合，由回归方程计算出清除率为50％时蛋白肽溶液的质量浓度即IC50值，IC50值越小，酶解液清除羟自由基的能力越强，抗氧化活性也越强。
由保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽对羟自由基的量效关系分别为：
Y保加利亚乳杆菌＝32.023ln(X)+109.55,R2＝0.9771，由此IC50＝0.1557mg/mL；
Y发酵乳杆菌＝33.796ln(X)+118.48,R2＝0.9938,由此IC50＝0.1326mg/mL。
保加利亚乳杆菌IC50值0.1557mg/mL，发酵乳杆菌IC50值0.1326mg/mL，由此可看出，发酵乳杆菌制备的条斑紫菜蛋白肽对羟自由基的清除能力高于保加利亚乳杆菌，这是由于两种乳酸菌对紫菜蛋白的水解能力不同，发酵乳杆菌发酵制备的紫菜肽能参加反应的氨基酸侧链暴露更多，其清除能力也更强。
(4)、条斑紫菜蛋白肽的DPPH·清除能力的测试
取步骤4中制备的条斑紫菜蛋白肽，制成浓度梯度为0.1、0.3、0.5、0.8、1.0mg/mL的待测溶液，取1mL待测溶液，再加入1mL0.04mg/mL的DPPH溶液，振荡混合均匀，反应30min后，3000r/mim离心10分钟，取上清液；在波长为517nm处测吸光值，记录数值；条斑紫菜蛋白肽对DPPH·自由基的清除效果用清除率表示；清除率计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸收值/空白吸收值)]×100％；
根据不同浓度的条斑紫菜蛋白肽溶液对DPPH·的清除率不同作图，结果如图2所示。
由图2可以看出，所制得的条斑紫菜蛋白肽对DPPH·具有清除能力，在0.1mg/mL～1.0mg/mL实验浓度范围内，两种产物的清除能力都弱于维生素C。在研究的酶解产物质量浓度范围内，随着酶解产物质量浓度的增加，对DPPH·清除率也逐渐增强。当酶解产物质量浓度为0.8mg/mL时，由保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽的DPPH·的清除率分别为70.05％和81.33％。当酶解产物质量浓度为1.0mg/mL时，由发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽的DPPH·的清除率为84.11％。
将申请号为201110362654.5的专利制备的紫菜抗氧化蛋白肽作为对比例二，测试对DPPH·自由基的清除率，测试结果如下表所示：
表4
浓度 实施例一 实施例二 实施例三 对比例二
0.8mg/mL 70.05％ 81.33％ 89.52％ /
1.0mg/mL 75.12％ 84.11％ 92.12％ /
100mg/mL / / / 47.04％
通过表4可以看出，实施例于对比例二相比，在各自pH和温度保持适宜的情况下，本发明提供的实施例采用更低浓度，但能够实现对羟自由基更高的清除率更高，具有显著的进步。
为准确量化比较两种条斑紫菜蛋白肽清除DPPH·活性大小，对绘制清除率对底物浓度曲线进行拟合，由回归方程计算出清除率为50％时蛋白肽溶液的质量浓度即IC50值，IC50值越小，酶解液清除DPPH·的能力越强，抗氧化活性也越强。由保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌发酵酶解法制备的条斑紫菜蛋白肽对DPPH·的量效关系分别为：
Y保加利亚乳杆菌＝20.708ln(X)+73.791,R2＝0.9852，由此IC50＝0.3142mg/mL；
Y发酵乳杆菌＝23.534ln(X)+85.679,R2＝0.9976,由此IC50＝0.2196mg/mL。
保加利亚乳杆菌IC50值0.3142mg/mL，发酵乳杆菌IC50值0.2196mg/mL，由此可见，发酵乳杆菌制备的紫菜蛋白肽对DPPH·的清除能力高于保加利亚乳杆菌。
结合以上的实验数据与结论，表明两种乳酸菌制备的紫菜蛋白肽都具有抗氧化性，但发酵乳杆菌制备的紫菜蛋白肽在清除·OH自由基和DPPH·自由基方面具有更强的清除能力。发酵制备的紫菜蛋白肽具有的良好抗氧化性可作为生物活性物质应用于保健食品和食品工业，具有广发的应用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S100、以条斑紫菜为原料进行粉碎处理、水提取、灭菌处理，得到浸提液；
S200、将得到的浸提液接种乳酸菌进行发酵，乳酸菌的接种量为1％～3％，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间20～36小时，发酵后将混合液进行灭菌处理；
S300、将灭菌后的混合液采用木瓜蛋白酶进行酶解处理，木瓜蛋白酶添加量为条斑紫菜质量的0.5％～2％，酶解温度为55℃～65℃，酶解反应时间为2～4小时；酶解结束后进行灭活处理，冷却后，进行离心分离，收集上清液；
S400、将收集的上清液过滤后，进行干燥，即得条斑紫菜抗氧化蛋白肽。
2.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，S100中，所述粉碎处理、水提取、灭菌包括：将条斑紫菜粉碎后与水按照料水比为1:20～1:50混合，经搅拌处理20min～30min进行浸提；所述料水比的单位为g/mL；
将得到的浸提液于115℃～125℃下处理10min～30min进行杀灭病原菌后冷却至30℃～40℃备用。
3.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤S200中，所述乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌中的至少一种。
4.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤S200中，乳酸菌接种浸提液前，接种于MRS培养基，活化10～12小时，培养温度为37℃，摇床转速200转/分。
5.根据权利要求4所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，MRS培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L,七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L；
所述MRS培养基的pH为6.8，并于115℃灭菌30min～40min。
6.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，S300中：酶解2～4小时后，控制温度在0℃～5℃，往反应室中冲入氮气，用减压阀调整进气量2升/小时,充气时间2h,反应室压力控制1.5bar；同时采用超声处理，并用紫外光照射12min～15min；紫外光处理结束后，继续通入氮气反应室压力控制1.0bar，温度升至在100℃下，处理时间为15min进行灭活；自然冷却后，5000r/min离心15分钟，收集上清液。
7.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，S400中，将上清液进行过滤的方法包括：采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量10Ka的超滤膜对上清液除杂，收集得到滤液。
8.根据权利要求1所述条斑紫菜抗氧化蛋白肽的制备方法，其特征在于，S400中干燥方法包括：采用真空干燥箱，将浓缩液干燥成粉；浓缩干燥温度为55℃～60℃，干燥时间为10h～15h。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109221878A (zh) * 2018-11-16 2019-01-18 青岛海思达生物科技有限公司 一种紫菜发酵物及其在制备抗氧化剂中的应用
CN115281325A (zh) * 2022-06-07 2022-11-04 阳江喜之郎果冻制造有限公司 一种海苔边角料回收用调味料酶解装置及酶解方法
CN116875505A (zh) * 2023-07-21 2023-10-13 江苏海洋大学 一种解淀粉芽孢杆菌mmb-02及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用
CN117209553A (zh) * 2023-07-21 2023-12-12 江苏海洋大学 一种联合菌种发酵条斑紫菜提高其破壁率的益生菌剂及其发酵方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000157226A (ja) * 1998-09-25 2000-06-13 Shirako:Kk 海苔の酵素分解物およびその用途
CN101669571A (zh) * 2009-09-28 2010-03-17 东北农业大学 乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺
CN102154423A (zh) * 2011-01-12 2011-08-17 淮海工学院 一种紫菜活性肽的制备方法
CN103749959A (zh) * 2013-12-31 2014-04-30 上海源耀生物股份有限公司 一种生物发酵麸皮及其加工方法
CN104263794A (zh) * 2014-09-30 2015-01-07 青岛嘉瑞生物技术有限公司 一种发酵酶解法制备谷朊粉肽的工艺技术
CN105112478A (zh) * 2015-05-14 2015-12-02 浙江海洋学院 一种鱿鱼皮活性多肽的制备方法
CN107365823A (zh) * 2017-09-06 2017-11-21 仇颖莹 一种河蚌抗氧化活性肽的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000157226A (ja) * 1998-09-25 2000-06-13 Shirako:Kk 海苔の酵素分解物およびその用途
CN101669571A (zh) * 2009-09-28 2010-03-17 东北农业大学 乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺
CN102154423A (zh) * 2011-01-12 2011-08-17 淮海工学院 一种紫菜活性肽的制备方法
CN103749959A (zh) * 2013-12-31 2014-04-30 上海源耀生物股份有限公司 一种生物发酵麸皮及其加工方法
CN104263794A (zh) * 2014-09-30 2015-01-07 青岛嘉瑞生物技术有限公司 一种发酵酶解法制备谷朊粉肽的工艺技术
CN105112478A (zh) * 2015-05-14 2015-12-02 浙江海洋学院 一种鱿鱼皮活性多肽的制备方法
CN107365823A (zh) * 2017-09-06 2017-11-21 仇颖莹 一种河蚌抗氧化活性肽的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CIAN 等: "Bioactive properties of peptides obtained by enzymatic hydrolysis from protein byproducts of Porphyra columbina", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
陈文雅 等: "生物活性肽制备及其在粮油中的开发", 《粮油食品科技》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109221878A (zh) * 2018-11-16 2019-01-18 青岛海思达生物科技有限公司 一种紫菜发酵物及其在制备抗氧化剂中的应用
CN115281325A (zh) * 2022-06-07 2022-11-04 阳江喜之郎果冻制造有限公司 一种海苔边角料回收用调味料酶解装置及酶解方法
CN115281325B (zh) * 2022-06-07 2024-05-10 阳江喜之郎果冻制造有限公司 一种海苔边角料回收用调味料酶解装置及酶解方法
CN116875505A (zh) * 2023-07-21 2023-10-13 江苏海洋大学 一种解淀粉芽孢杆菌mmb-02及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用
CN117209553A (zh) * 2023-07-21 2023-12-12 江苏海洋大学 一种联合菌种发酵条斑紫菜提高其破壁率的益生菌剂及其发酵方法
CN116875505B (zh) * 2023-07-21 2024-04-26 江苏海洋大学 一种解淀粉芽孢杆菌mmb-02及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用

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