CN108504643A - 一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述偏甘油酯脂肪酶晶体结构由2个不对称单体组成，分别为：单体A和单体B；晶体结构参数为：空间群P1211；晶胞参数：每个单体有β折叠和α螺旋，构成了典型的丝氨酸水解酶α/β折叠结构，并由Ser153、Asp260，His268构成的催化三联体形成活性中心。本发明提供的偏甘油酯脂肪酶的三维结构，有助于利用蛋白质工程技术改造酶分子，更高效地获得满足工业应用需求的酶蛋白变异体，如底物选择性，热稳定性及催化活力等性能改善。

Description

一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体 结构

技术领域

本发明涉及来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构，属于酶工程技术领域。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰基甘油水解酶，能够催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性。另外，脂肪酶以其催化功能多样、催化底物类型广泛(酯、醇、酸、酸酐、酰胺等都可以成为它的底物)以及对环境不会造成污染等优点，使它在食品、饲料、造纸、制革、水产、生物化工、油脂化工、医药、和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。目前脂肪酶已经成为重要的工业用酶之一，它们在工业研究中的发展相当迅速。

偏甘油酯脂肪酶是一类具有特殊底物选择性的脂肪酶。该类脂肪酶不能水解或者只能轻微水解甘油三酯，但却能特异性地作用于甘油二酯和(或)甘油一酯，特别适合于高纯度甘油单酯、甘油二酯的工业生产。甘油二酯是油脂的天然成分，具有营养、安全、人体相容性高、加工适性好等诸多优点，在食品、医药、化工等行业具有广泛的应用前景。

AOL是米曲霉分泌的一种偏甘油脂肪酶，可以特异性作用于甘油二酯和甘油单酯，因此，AOL可作为甘油二酯合成的新型酶制剂。此外，对AOL进行克隆及重组表达，可以扩大偏甘油酯脂肪酶的家族，以便能够更好地适应工业生产。

目前国内研究较多的能特异性作用于单酯和二酯的脂肪酶主要有以下几种：来源于Penicillium camembertii；Penicillium cyclopium；Aspergillus oryzae和Malassezia globosa的偏甘油脂肪酶。其中来源于Penicillium camembertii、Penicillium cyclopium和Malassezia globosa偏甘油脂肪酶的晶体结构已经解析，但是该类酶独特的底物选择性机制研究还不深入，因此，有必要扩大该类酶的晶体数据，对其晶体结构进行研究，为这类酶应用于工业生产提供借鉴和指导。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶的制备方法和晶体结构。

本发明的第一个方面提供一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶，其含有如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的优化的核酸分子，获得在大肠高表达的热稳定脂肪酶。具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

一种重组质粒，包含上述的基因。

一种重组大肠杆菌，包含有上述重组质粒。

一种源于米曲霉的偏甘油脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备热稳定脂肪酶表达质粒：

a.人工合成权利要求2的基因序列；

b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和EcoRI分别对纯化的基因片段和质粒pFL-B13cl进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒；

(2)利用表达质粒制备重组菌株：

a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒转入大肠杆菌ShuffleT7；

b.将转化液涂布于含(100μg/mL)氨苄青霉素的LB平板中，37℃培15-18h，长出大肠杆菌单菌落即为偏甘油酯脂肪酶的重组菌株。

所述偏甘油酯脂肪酶的重组菌株采用亲和层析和凝胶排阻层析法纯化，得到偏甘油酯脂肪酶。

步骤(1)所述PCR的引物序列如下：AOL For5'-GATGGGTACCTACCCAACAGCAATAGACGTTAGA-3'AOL Rev5'-GACGCAATTCTTATCTCAATGGCAGTCCGGGTCC-3'。

一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶晶体结构，由2个不对称单体组成，分别为：单体A和单体B；晶体结构参数为：

空间群P1211；

晶胞参数：

每个单体有β折叠和α螺旋，构成了典型的丝氨酸水解酶α/β折叠结构，并由Ser153、Asp260，His268构成的催化三联体形成活性中心。

上述晶体结构的原子坐标如表1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供了一种偏甘油酯脂肪酶的三维结构信息，有助于利用蛋白质工程技术改造酶分子，更高效地获得满足工业应用需求的酶蛋白变异体，如底物选择性，热稳定性及催化活力等性能改善；还可用于提高酶的pH耐受性、改变底物旋光特异性，高效生产甘油单酯和甘油单酯等方面。

附图说明

图1为带SUMO标签的AOL在大肠杆菌中表达的蛋白电泳图；从左到右，M为蛋白质分子标准Marker，泳道1为总菌，泳道2为上清，泳道3为沉淀。

图2为带SUMO标签的AOL第一次经镍柱纯化蛋白电泳图；从左到右依次为纯化的带SUMO标签的AOL蛋白条带、蛋白质分子标准Marker。

图3为带SUMO标签AOL经SUMO蛋白酶酶切后再经镍柱纯化的电泳图；从左到右依次为蛋白质分子标准Marker、纯化的不带SUMO标签AOL蛋白条带。

图4为AOL经分子筛纯化的蛋白电泳图；图4-A代表分子筛纯化不带SUMO标签的AOL的UV示意图，图4-B为根据图4-A不同时间收集的AOL蛋白经SDS-PAGE的鉴定结果。

图5为优化结晶条件后生长的AOL的晶体。

图6为AOL的三维结构图；一个不对称单元含两个蛋白分子。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

AOL大肠杆菌表达载体的构建

根据Genbank的米曲霉偏甘油脂肪酶AOL的基因(GenBank登录号：D85895)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根据大肠杆菌密码子偏好性对序列进行优化(序列SEQ ID NO:1)。基因合成后，利用引物AOL-F:5'-GATGGGTACCTACCCAACAGCAATAGACGTTAGA-3'(SEQ ID NO:3)AOL-R:5'-GACGCAATTCTTATCTCAATGGCAGTCCGGGTCC-3'。(SEQ ID NO:4)扩增成熟肽序列，PCR扩增条件：98℃3min；98℃10s，58℃15s，72℃80s，30个循环；72℃7min。PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶KpnI和EcorI分别对纯化的基因片段和质粒(购自Invitrogen)进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB平板(含100ug/mL氨苄青霉素)。挑取阳性克隆通过KpnI和EcorI双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了pFL-B13cl-AOL表达质粒。

实施例2

大肠杆菌重组子的构建、筛选及鉴定

将pFL-B13cl-AOL表达质粒热击转入大肠杆菌Shuffle T7中，将转化液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板中，37℃培15-18h。随机挑取平板上大肠杆菌单菌落于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃、200rpm摇床过夜培养，至OD0.6～0.8，然后加IPTG至终浓度为0.2mM，15℃，200rpm诱导16h，于4℃收集菌液，10000rpm离心5min，弃上清。然后加入预冷PBS溶液重悬菌体，超声破碎，10000rpm离心20min去除不溶蛋白，将总菌，上清，沉淀分别跑蛋白电泳验证目的蛋白是否表达。蛋白电泳图如图1所示，带有Sumo标签目的蛋白几乎都在上清，分子量大约45kda。

实施例3

AOL的扩大培养和纯化

将筛选的阳性重组子接种到300uL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养基中，37℃，200rpm培养5h，将200uLpFL-B13cl-AOL/Suffle T7菌液接种到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养16h，最后将10mL二级种接到500mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中中，37℃，200rpm培养到OD 0.6～0.8，然后加1M IPTG至终浓度为0.4mM 16℃，200rpm培养16h。发酵液的收集参照实施例2。破菌上清利用镍螯合亲和层析柱(HisTrap HPcolumn,GE Healthcare)纯化，流速1mL/min，最后用200mM pH7.4含500mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目标蛋白，利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(见图2)。

经过镍螯合亲和层析柱后，按目的蛋白：Sumo蛋白酶＝1mg:150ug比例加入Sumo蛋白酶，30℃静置酶切5小时，酶切后的蛋白液在通过利用镍螯合亲和层析柱纯化，目的蛋白全穿过，利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(见图3)。将穿过夜于4℃条件下用超滤管浓缩至蛋白浓度为10mg左右，然后用凝胶层析柱(分子筛)纯化(Hiload 16/60Superdex 75)。方法：先用1.2倍柱体积的10mm Tris,100mm NaCl,pH 7.5平衡分子筛，流速1mL/min；将5mL离心后的蛋白加载到分子筛，收集洗脱的蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。AOL整个分子筛纯化过程出现2个峰(图4-A)。峰1时，AOL未被洗脱下来；峰2时，AOL逐渐从分子筛上被洗脱下来。随纯化时间收集的AOL的SDS-PAGE的鉴定结果如图4-B所示，峰2收集的AOL在31kDa位置附近呈现为单一的蛋白条带，混合后纯度可以到达95％以上，满足了蛋白质结晶纯度要求。

实施例4

晶体制备和结构解析

1.晶体制备：将分子筛纯化后的蛋白浓缩到10mg/ml，用坐滴法进行结晶，共筛选了10个结晶kit。3天后，在20度，在含有0.3μl蛋白和0.3μl池液(0.1M BIS-TRIS pH 6.5,45％v/v Polypropylene glycol P 400)的结晶液滴中长出了晶体。经过扩大体系和优化，在含有2μl蛋白和2μl池液(0.1M BIS-TRIS pH 6.4,41％v/v Polypropylene glycol P400)的结晶液滴中长出了形状较好的晶体(图5)，晶体保存于16℃。

2.数据采集：数据采集使用SSRF同步辐射，首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换(MR，Molecular Replacement)方法，以卡柏门偏甘油脂肪酶(5ch8)搜索模型，得到，米曲霉偏甘油酯脂肪酶AOL的精细三维结构(图5)。

表1 AOL晶体结构的衍射数据

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacccaacag caatagacgt tagagatatt ccaacgacgc agcttgaaga ttttaagttc 60

tgggttcaat acgctgcagc aacctactgt cctaacaact atgttgccaa agatggagag 120

aaacttaact gcagtgtagg taactgtcca gacgtggaag cagctggttc aaccgtcaag 180

ctatcctttt cagacgatac tataacggac actgctggtt ttgtcgctgt tgataatact 240

aataaggcta tagtggttgc tttccgtgga tcctattcaa ttaggaattg ggttaccgat 300

gccacatttc cccaaactga tcctggatta tgcgatggtt gtaaggctga gctgggcttc 360

tggactgctt ggaaagtcgt tcgagacagg atcattaaga ctctggacga actgaaacca 420

gaacatagtg attataaaat tgtagttgtc ggtcattctc taggtgcagc catcgcctct 480

ttggctgccg cagatttgag aaccaagaat tatgatgcta tcttatatgc ctacgctgcc 540

cctcgtgtcg ctaacaagcc cttggcagag ttcatcacta accaagggaa taactacaga 600

ttcacccaca atgatgaccc agtgccaaaa ttgccccttt tgactatggg gtacgtccat 660

atttctcctg aatactatat tacagccccc gacaacacta cagttactga caaccaggta 720

accgtgttgg acggctatgt taattttaag ggcaatacag gtacatccgg aggtttacct 780

gatttgttgg cttttcattc tcacgtgtgg tacttcattc acgctgatgc ttgtaaagga 840

cccggactgc cattgaga 858

<210> 3

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Pro Thr Ala Ile Asp Val Arg Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu

1 5 10 15

Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn

20 25 30

Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn

35 40 45

Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly Ser Thr Val Lys Leu Ser Phe Ser

50 55 60

Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala Gly Phe Val Ala Val Asp Asn Thr

65 70 75 80

Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Arg Asn

85 90 95

Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp

100 105 110

Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe Trp Thr Ala Trp Lys Val Val Arg

115 120 125

Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Pro Glu His Ser Asp

130 135 140

Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr Lys Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr

165 170 175

Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile

180 185 190

Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg Phe Thr His Asn Asp Asp Pro Val

195 200 205

Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met Gly Tyr Val His Ile Ser Pro Glu

210 215 220

Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn Thr Thr Val Thr Asp Asn Gln Val

225 230 235 240

Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser

245 250 255

Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala Phe His Ser His Val Trp Tyr Phe

260 265 270

Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly Pro Gly Leu Pro Leu Arg

275 280 285

Claims (9)

1.一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述偏甘油酯脂肪酶的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒含有权利要求2所述的基因。

4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌含有权利要求3所述的重组质粒。

5.一种源于米曲霉的偏甘油脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备热稳定脂肪酶表达质粒：

a.人工合成权利要求2的基因序列；

b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和EcoRI分别对纯化的基因片段和质粒pFL-B13cl进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒；

(2)利用表达质粒制备重组菌株：

a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒转入大肠杆菌ShuffleT7；

b.将转化液涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，37℃培15-18h，长出大肠杆菌单菌落即为偏甘油酯脂肪酶的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述偏甘油酯脂肪酶的重组菌株采用亲和层析和凝胶排阻层析法纯化，得到偏甘油酯脂肪酶。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR的引物序列如下：

AOL For5'-GATGGGTACCTACCCAACAGCAATAGACGTTAGA-3'

AOL Rev5'-GACGCAATTCTTATCTCAATGGCAGTCCGGGTCC-3'。

8.一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶晶体结构，其特征在于，

所述偏甘油酯脂肪酶晶体结构由2个不对称单体组成，分别为：单体A和单体B；晶体结构参数为：

空间群P1211；

晶胞参数：

每个单体有β折叠和α螺旋，构成了典型的丝氨酸水解酶α/β折叠结构，并由Ser153、Asp260，His268构成的催化三联体形成活性中心。

9.根据权利要求8所述晶体结构，其特征在于，该晶体结构的原子坐标如表1所示。