CN108504581A

CN108504581A - 短密木霉的固体培养和液体发酵工艺

Info

Publication number: CN108504581A
Application number: CN201810333470.8A
Authority: CN
Inventors: 王春明; 郭成; 周天旺; 徐生军; 荆卓琼
Original assignee: INSTITUTE OF PLANT PROTECTION GANSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF PLANT PROTECTION GANSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-04-13
Also published as: CN108504581B

Abstract

本发明公开了短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。通过筛选短密木霉培养基的最佳基础配料，对接种和孢子培育以及发酵工艺条件等进行优化，确定出短密木霉的最适固体培养和液体发酵条件，并进一步确定了对多种植物病原真菌均具有较好抑制作用的短密木霉GSAAMLSHU‑1菌株生长和产孢的最适条件，为其工业化生产及其推广应用提供依据。

Description

短密木霉的固体培养和液体发酵工艺

技术领域

本发明涉及微生物发酵工艺，具体地说，涉及短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。

背景技术

我国是个农业大国，农业是国民经济的基础。有资料记载，我国每年平均发生病虫害约27-28亿亩次，农药使用量逐年增多，80-90年代，每公顷土地用药量从4.65 公斤增加到15.9公斤以上，增加了两倍多。20世纪达每公顷20公斤以上。在人口压力大、环境资源紧张、农业基础薄弱，且农业有害生物多发重发频发的严峻形势下，我国粮食生产连续保持增长，化肥农药做出了重要的贡献。农药是重要的农业生产资料，对防病治虫、促进粮食和农业稳产高产至关重要。然而，由于过量和不能合理、适时、对症用药，使得农药利用率不高，带来生产成本增加、农产品农药残留超标、病虫抗(耐)药性上升、次要害虫大发生、作物药害、环境污染等一系列问题。为了减少化学杀菌剂对环境的污染和在农产品中的残留，寻找对环境友好的新型植物病害防治剂受到普遍重视。大量研究表明，生物防治在植物病害的综合治理中有不可替代的重要作用。

生物防治，是指利用生物物种间的相互关系，通过有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法，与传统化学防治相比较，具有无污染、无公害、长效性等优点，具有广阔的发展前景，是实现生态农业的重要保障。目前，许多生防制剂被广泛应用于植物病虫害的防治，并取得了较好的防治效果。在已经研究的生防菌中，木霉属下的若干菌种因具有适应能力强、抗病谱广、拮抗机制多样化而被广泛用于防治植物病害。木霉菌(Trichoderma.spp)因为培养条件简单，繁殖速度快，被公认为可取代化学试剂化用于农作物的保护，到2010年止世界各国己经注册木霉制剂约50种，使用的含木霉成分生物制剂达到100多种。

木霉菌属于真菌界，半知菌亚门，丝孢目，木霉属(Trichoderma)，是一种自然界常见的无性、丝状、腐生性真菌。木霉因其能产生多种蛋白酶，有重要的生物技术应用价值，又能抵抗植物病原菌，有显著的生物防治效果，历来为人们重视。木霉对病原菌的作用机制是多种多样的，主要包括抗菌、溶解、竞争、重寄生等。但就特定的木霉菌株来说，则又各具特点，防治效果也是各异的。因此，对具有广谱生防功效的特定木霉菌的菌株生长和产孢最适条件等进行研究，将为有益微生物菌剂生产及其推广应用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。

本发明的另一目的是提供保藏号CGMCC NO.15391的短密木霉的液体发酵工艺。

为了实现本发明目的，本发明提供一种短密木霉(Trichoderma brevicompactum)的固体或液体培养基基料，所述基料选自马铃薯、***、麦麸、油渣和玉米粉中的至少一种。

优选地，所述基料为麦麸、油渣(菜籽饼和/或菜籽粕)或玉米粉。更优选麦麸。

本发明还提供短密木霉的固体培养基，所述固体培养基是将上述基料加入适量水煮沸后，用纱布过滤，滤汁用水稀释后加入适量琼脂粉，灭菌后冷却制得。

所述固体培养基的制备方法如下：

取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g(优选15g)，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，

取***、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g(优选15g)，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min 后，冷却即得。

本发明还提供短密木霉的固体培养方法，将短密木霉接种于上述固体培养基，于20-30℃(优选25-27℃)培养。

本发明还提供短密木霉的液体发酵培养基，所述液体发酵培养基是将所述固体培养基中的琼脂粉替换成蔗糖或葡萄糖制得。

优选地，所述液体发酵培养基的制备方法如下：

取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，

取***、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min 后，冷却即得。

本发明的液体发酵培养基的pH值为3-10，优选pH自然，或pH＝7。

本发明还提供一种短密木霉的液体发酵工艺，包括以下步骤：

A1、菌种活化：将保存在PDA斜面上的短密木霉菌种接入PDA平板中，于20-30℃(优选25-27℃)培养，进行菌种活化；

A2、种子液制备：将活化的菌种接入装有100-120mL种子培养液的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选25-27℃，150r/min)振荡培养6d，作为种子液；其中，所述种子液的活菌数为1×10⁶-1×10⁷cfu/mL；

A3、摇瓶发酵：按照5-25％(优选15-20％)的接种量将上述种子液转接至装有100-120mL所述液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选 25-27℃，150r/min)振荡培养3-6d。

本发明中，所述种子培养液的成分为：酵母粉5g，葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，无水CaCL₂ 0.25g，H₂O 1000mL，pH自然。

本发明进一步提供保藏号CGMCC NO.15391的短密木霉(Trichodermabrevicompactum)GSAAMLSHU-1的液体发酵工艺。

发明人从甘肃省景泰县条山农场马铃薯连作试验田采集的土样中分离纯化得到一株具有广谱拮抗植物病原真菌作用的真菌GSAAMLSHU-1，菌株在PDA培养基上可产生气生菌丝，菌落正面绒毛状至毡状，白色浓厚蓬松，突起于表面，呈明显同心圆状，5d后PDA上长满大量深绿色或黄绿色孢子，背面反面黄褐色。在SNA培养基上长满细微透明菌丝，白色絮状，青绿色孢子，孢子微量，散布于整个平皿，边缘较多，有酒味。分生孢子梗主轴较粗，节较短，侧枝极短粗，分生孢子梗形状似梨形，饱满，基部开始膨大，颈部缢缩，4-8个成为一簇长在各枝端、节点上，整体似葱花。分生孢子卵圆形，光滑。PCR扩增菌株GSAAMLSHU-1的EF-1α基因序列，扩增产物大小为393bp。对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。与 GenBank核苷酸数据库中已有的木霉菌EF-1α基因序列进行比对，GSAAMLSHU-1与GenBank上登录号为AB558910(Trichoderma brevicompactum)、EU280056(T.brevicompactum)、KP985653(T.brevicompactum)、GU592404(T.brevicompactum)、HM234081(T.brevicompactum)的亲缘关系最近，同源性达97％以上。利用DNAstar 软件进行聚类分析，构建聚类分析图，发现菌株GSAAMLSHU-1亦与以上亲缘关系最近的短密木霉位于***发育树的同一分支，聚为一类。以ITS1和ITS4为引物，菌株GSAAMLSHU-1的基因组DNA为模板，进行PCR扩增后，将PCR产物纯化后测序， PCR产物大小为611bp(SEQ ID NO:2)。将ITS基因序列在Genbank上比对后，发现菌株GSAAMLSHU-1的rDNA-ITS序列为木霉菌范畴，菌株GSAAMLSHU-1与GenBank 中登记的KX092002(Trichoderma brevicompactum)、KC561068(T.brevicompactum)、 KU851839(T.brevicompactum)、KC884785(T.brevicompactum)和HQ596986 (T.brevicompactum)的亲缘关系最近，同源性均达99％。利用DNAStar软件绘制其 ***发育树状图，结果表明，菌株GSAAMLSHU-1亦与以上亲缘关系最近的短密木霉位于***发育树的同一分支，聚为一类。根据菌株GSAAMLSHU-1的菌学特征、 rDNA-ITS和EF-1α序列分析结果，将其鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类的木霉属真菌，短密木霉(Trichoderma brevicompactum)。菌株GSAAMLSHU-1 现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.15391，保藏日期2018年3月26日。

菌株GSAAMLSHU-1产孢的最适液体发酵培养基，其制备方法为：取麦麸50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。

菌株GSAAMLSHU-1发酵产孢的最适pH＝7，最佳培养时间为5d，最适发酵温度为25℃，最佳接种量为20％，且光暗交替条件下，产孢量最大。

短密木霉GSAAMLSHU-1的液体发酵工艺具体如下：

B1、菌种活化：将保存在PDA斜面上的短密木霉GSAAMLSHU-1菌种接入PDA 平板中，于20-30℃(优选25-27℃)培养至出现白色菌丝；

B2、种子液制备：用接种针挑取一个菌饼接入装有100mL种子培养液的250mL 三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选25-27℃，150r/min)振荡培养6d，所得种子液的活菌数为1×10⁶-1×10⁷cfu/mL；

B3、摇瓶发酵：按照20％的接种量将上述种子液转接至装有100-120mL所述液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选25-27℃，150r/min) 振荡培养3-6d(优选3-5d)；其中，所述液体发酵培养基的制备方法为：取麦麸50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。

前述发酵工艺中，步骤A3或B3摇瓶发酵时的光照条件为：10h-12h黑暗，12h-14h光照，光照强度为1400-1700lux。优选地，10h黑暗，14h光照，光照强度为1400lux。

本发明通过筛选短密木霉培养基的最佳基础配料，对接种和孢子培育以及发酵工艺条件等进行优化，确定出短密木霉的最适固体培养和液体发酵条件，并进一步确定了对多种植物病原真菌均具有较好抑制作用的短密木霉GSAAMLSHU-1菌株生长和产孢的最适条件，为其工业化生产及其推广应用提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例3中生防短密木霉GSAAMLSHU-1在不同培养基中培养菌落形态差异。

图2为本发明实施例4中不同培养时间对菌株GSAAMLSHU-1产孢量的影响。

图3为本发明实施例4中不同PH值对菌株GSAAMLSHU-1产孢量的影响。

图4为本发明实施例4中不同温度值对菌株GSAAMLSHU-1产孢量的影响。

图5为本发明实施例4中不同温度值对菌株GSAAMLSHU-1产孢量的影响。

图6为本发明实施例4中不同光照对菌株GSAAMLSHU-1产孢量的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1短密木霉GSAAMLSHU-1菌种活化

将保存在PDA斜面上的生防短密木霉GSAAMLSHU-1菌种用接种环接入PDA 平板中央，27℃下培养，待出现白色菌丝而不长满平皿为止。

其中PDA培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂粉15g，H₂O1000mL， pH自然。

实施例2短密木霉GSAAMLSHU-1种子液制备

将PDA平板上生长的生防短密木霉GSAAMLSHU-1用接种针接入一个菌饼至装有100mL种子培养液的250ml三角瓶中，27℃150r/min振荡培养6d，作为种子液。所得种子液的活菌数为5.5×10⁶cfu/mL。

其中种子培养液成分为：酵母粉5g，葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，无水CaCL₂ 0.25g，H₂O 1000mL，pH自然。

实施例3短密木霉GSAAMLSHU-1最佳培养基的筛选

1、平板培养筛选最佳基质

(1)试验方法

马铃薯(鲜重)取250g，或者***、麦麸、油渣(菜籽粕)或玉米粉(干重)各取50g，加入适量水煮沸后30min，用四层纱布过滤取汁。另各加琼脂粉15g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20min。每皿(直径9cm)倒20ml培养基制成平板，将生防短密木霉GSAAMLSHU-1菌种接种于平板中央，27℃培养，记录3d后菌落直径，每处理3 重复，取平均值。

(2)试验结果

由表1可以看出，生防短密木霉GSAAMLSHU-1可以在供试的各种基质的培养基上生长，其中在油渣平板培养基上生长的最好，培养3d后菌落直径为6.9cm；其次是在玉米粉平板培养基上，培养3d后菌落直径为6.5cm；而在马铃薯平板培养基上生长最差，3d后菌落直径仅为5.2cm。这说明油渣、玉米粉和麦麸基质培养基的营养最好，能够保证木霉的生长，可作为生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵培养的培养基使用。同时短密木霉菌株生防短密木霉GSAAMLSHU-1在不同的基质上培养后，其菌丝的疏密程度等形态特征也存在一定的差异(图1)。

表1生防短密木霉GSAAMLSHU-1在不同培养基中培养3d的菌落直径

培养基	培养3d的菌落直径(cm)
		马铃薯	5.2
玉米粉	6.5
		***	5.5
麦麸	6.1
		油渣	6.9

注：表中数据为3次重复平均值。

2、摇瓶液体培养最佳基质筛选

(1)试验方法

上述各基质不加琼脂而加蔗糖20g制成液体培养基，250mL三角瓶中每瓶装入100mL，接种实施例2培养好的生防短密木霉GSAAMLSHU-1种子液1.0ml，于27℃下振荡培养6d，测定菌丝体生长量，每处理3重复，取平均值。

菌丝体生长量的测定：取生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵液100mL，在 4000r/min下离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次，所得菌体在60℃下烘干至恒重，精确称量并计算出每100mL发酵液中菌丝体的干重(g)，即为菌丝体的生长量。

(2)试验结果

由表2可知，生防短密木霉GSAAMLSHU-1经不同基质的培养基摇瓶培养后产生的菌丝性状有所差异，测得菌丝体生长量最多的是玉米粉培养基，为0.45g/100mL，且菌丝层厚而稠密，形成的小菌球数量多；其次是麦麸培养基，为0.44g/100mL，产生的菌丝球数量较少，大小不同；菌丝体生长量最低的为马铃薯，仅为0.16g/100mL，产生的菌球数量最少，大小不同。但由于玉米粉的水溶性较差，其粗颗粒还有可能混入到菌丝中，因此选择麦麸作为摇瓶发酵的最佳培养基。

表2短密木霉GSAAMLSHU-1在不同培养基摇瓶培养的菌丝性状及菌丝体生长量

注：表中数据为3次重复平均值。

实施例4短密木霉GSAAMLSHU-1发酵条件的优化

本实施例中所用液体发酵培养基的制备方法为：取麦麸50g，加入适量水煮沸30min后，用四层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌 20min后，冷却即得。种子液按实施例2方法制备。

1、试验方法

(1)培养时间对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

从开始培养起，每天测量生防短密木霉GSAAMLSHU-1产孢量的变化，直到第 6d，3次重复，共测15个视野。

(2)初始pH值对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

用250ml三角瓶，每瓶装100ml液体发酵培养基，并用1％HC1和1％NaOH溶液调节培养液的初始pH，使pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，以1％的接种量接入种子液，27℃，150r/min，振荡培养5d，测量产孢量，3次重复。

(3)温度对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

用250mL三角瓶，每瓶装100mL由本试验确定的发酵培养液，分别在20℃、 22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、30℃温度下进行振荡培养，测定5d 后测量产孢量，3次重复。

(4)接种量对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

用250mL三角瓶，每瓶装100-120mL由本试验确定的发酵培养液，分别以5％、10％、15％、20％、25％接种量下进行振荡培养，培养5d后测量产孢量。

(5)光照对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

用250mL三角瓶，每瓶装100mL由本试验确定的发酵培养液，分别在全光照(光照强度为1400lux)、全黑暗、黑暗交替(10h黑暗，14h光照，光照强度为1400lux) 条件下进行振荡培养，培养4d后测量产孢量。

其中孢子量测定采用孢子悬液梯度稀释后，用血球计数板计数。

2、试验结果

(1)培养时间对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

由图2可以看出，生防短密木霉GSAAMLSHU-1的培养从第2d起，发酵液中孢子量呈上升趋势，第5d达到产孢量的高峰期，第6d开始产孢量急剧下降。原因可能是在有限的营养浓度内菌体达到最大增长限度后自身开始产生一些碱性物质抑制生长并伴有菌体自溶现象。因此，我们选择木霉摇瓶培养的时间为5d。

(2)初始pH值对生防短密木霉(Trichoderma brevicompactum)GSAAMLSHU-1 发酵的影响

由图3可见，生防短密木霉GSAAMLSHU-1液体发酵在pH值3.0～10.0之间都可观察到菌丝生长和形成小菌球。由产孢量可知，pH值在3.0～6.0之间时，产孢量呈缓慢上升趋势，但pH值由6上升到7时，产孢量急剧上升达到高峰，而后当pH值高于7.0 生防短密木霉GSAAMLSHU-1产孢量又急剧下降，下降幅度大于pH值由6上升到7的幅度，这可能是由于pH值偏酸性或中性时，菌体能较好地利用营养而迅速生长，产孢量和菌丝体重量也达到最大。当pH偏高时，生长条件不很适宜而使产包量和菌丝体生长量降低。

(3)温度对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

由图4可知，生防短密木霉GSAAMLSHU-1在20～30℃均有不同程度的生长，产孢量最适的温度25℃。因此，我们选择发酵温度为25℃。

(4)接种量对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

由图5可见，生防短密木霉GSAAMLSHU-1液体发酵在接种量5％～25％之间都可观察到菌丝生长和形成小菌球。由产孢量可知，接种量20％时，产孢量最大，故选择 20％为它的最佳接种量。

(5)光照对生防短密木霉GSAAMLSHU-1发酵的影响

由图6可见，生防短密木霉GSAAMLSHU-1液体发酵在全光照、全黑暗和光暗交替三种条件下都可观察到菌丝生长和形成小菌球。由产孢量可知，光暗交替(10h黑暗，14h光照，光照强度为1400lux)条件下，产孢量最大。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 甘肃省农业科学院植物保护研究所

<120> 短密木霉的固体培养和液体发酵工艺

<130> KHP181111052.0

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttacttgaag gaacccttac cgagttcggc ggcttcctgt tgagggggaa atgggtcagt 60

acaactgaag aagatgaaaa ggatagtagc gacgattgag atgtgatgag atgcattggg 120

tgatgaagag tatcaacagg taacagagcg tcactggtag tagtgggggt ttgctccaag 180

aagtaccccc actaaaacct agtaaggcag caaaaaaatt ttgcaggtct gtaccaaagg 240

aggggtaggc cgcgaaagcg gggtgaccat gaaaaaaaaa attgacacga aatcctcaaa 300

taactgagaa ttgtcgggca caattgcatg gagtgaaggt caaaatgaga gagaaaatca 360

ggcgtaagct taccttctcg acttctcgat gac 393

<210> 2

<211> 611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggggggcct gcggagggat cattaccgag tttacaactc ccaaacccca atgtgaacgt 60

taccaaactg ttgcctcggc gggatttctg ccccgggcgc gtcgcagccc cggaccaagg 120

cgcccgccgg aggaccaatt tacaaactct tttgtatatc ccatcgcgga ttctttacat 180

tctgagcttt ctcggcgctc ctagcgagcg tttcgaaaat gaatcaaaac tttcaacaac 240

ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt 300

gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg 360

ggcatgcctg tccgagcgtc atttcaaccc tcgaacccct ccggggggtc ggcgttgggg 420

atcggcactt acctgccggc cccgaaatac agtggcggtc tcgccgcagc ctctcctgcg 480

cagtagtttg cacactcgca ccgggagcgc ggcgcgtcca cggccgtaaa acaacccaaa 540

cttctgaaat gttgacctcg gatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag catatcaaaa 600

gccgggagga a 611

Claims

1.短密木霉(Trichoderma brevicompactum)的固体或液体培养基基料，其特征在于，所述基料选自马铃薯、***、麦麸、油渣和玉米粉中的至少一种；

其中，所述油渣为菜籽饼和/或菜籽粕。

2.根据权利要求1所述的基料，其特征在于，所述基料为麦麸、油渣或玉米粉。

3.短密木霉的固体培养基，其特征在于，所述固体培养基是将权利要求1或2所述的基料加入适量水煮沸后，用纱布过滤，滤汁用水稀释后加入适量琼脂粉，灭菌后冷却制得。

4.根据权利要求3所述的固体培养基，其特征在于，所述固体培养基的制备方法如下：

取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，

取***、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。

5.短密木霉的固体培养方法，其特征在于，将短密木霉接种于权利要求3或4所述的固体培养基，于20-30℃培养。

6.短密木霉的液体发酵培养基，其特征在于，所述液体发酵培养基是将权利要求3或4所述固体培养基中的琼脂粉替换成蔗糖或葡萄糖制得。

7.根据权利要求6所述的液体发酵培养基，其特征在于，所述液体发酵培养基的制备方法如下：

取***、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。

8.短密木霉的液体发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

A1、菌种活化：将保存在PDA斜面上的短密木霉菌种接入PDA平板中，于20-30℃培养，进行菌种活化；

A2、种子液制备：将活化的菌种接入装有100-120mL种子培养液的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min振荡培养6d，作为种子液；其中，所述种子液的活菌数为1×10⁶-1×10⁷cfu/mL；

A3、摇瓶发酵：按照5-25％的接种量将上述种子液转接至装有100-120mL权利要求6或7所述液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min振荡培养3-6d。

9.根据权利要求8所述的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

B1、菌种活化：将保存在PDA斜面上的保藏号CGMCC NO.15391的短密木霉菌种接入PDA平板中，于27℃培养至出现白色菌丝；

B2、种子液制备：用接种针挑取一个菌饼接入装有100-120mL种子培养液的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min振荡培养6d，所得种子液的活菌数为1×10⁶-1×10⁷cfu/mL；其中，所述种子培养液的成分为：酵母粉5g，葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，无水CaCL₂ 0.25g，H₂O 1000mL，pH自然；

B3、摇瓶发酵：按照20％的接种量将上述种子液转接至装有100-120mL所述液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min振荡培养5d；其中，所述液体发酵培养基的制备方法为：取麦麸50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。

10.根据权利要求8或9所述的发酵工艺，其特征在于，步骤A3或B3摇瓶发酵时的光照条件为：10h-12h黑暗，12h-14h光照，光照强度为1400-1700lux。