CN108490171A - 一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒及其制备方法，包括在玻纤上喷涂胶体金复合物，在硝酸纤维素层析薄膜的检测限上包被重组抗原。用于检测唾液中含有的微量病毒特异性抗原。其中胶体金复合物是通过桥接分子，将识别抗体和胶体金颗粒进行连接，提高了标记效率，减少胶体金空间位阻。本发明的符合率高，并且提高了唾液抗体检测胶体金试纸的灵敏度，显色更加明显，检测结果更准确。

Description

一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒。
技术背景
传统的人类抗体检测主要是检测血液中的抗体，如乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒、人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒等。但是在应用过程中，采集的血液样本可能携带病毒，是潜在的感染源。对医疗检测人员及环境存在潜在的危险。另外，刺血检测会带来创口，增加感染的几率。所以在传统的抗体检测试剂盒的基础上，开发了抗体唾液检测试剂盒。
唾液中抗体的含量约为血清中抗体含量的1/50至1/800。相对于血清，抗体含量极低，如果直接用检测血液的抗原检测试剂盒直接检测唾液，灵敏度过低，极易造成假阴性。这就需要提高检测试剂灵敏度。本发明采用了一种新的胶体金标记抗体的方法，在抗体与胶体金颗粒之间，加入桥接分子，制备金标颗粒复合物，使胶体金标记的效率显著提高，从而增强显色程度，进行信号放大，提高检测试纸的灵敏度。在临床检测中，机体产生的抗体作为判断是否感染病毒的指标，所以使用鼠抗人IgG单克隆抗体为金标试剂，鼠抗人IgG能够特异性识别并结合免疫球蛋白IgG的FC端，形成三层夹心状结构，保证了检测的精确度。
发明内容
本发明针对上述技术背景提出来的问题，提供一种能够在保持精确度的前提下，提高检测灵敏度的方法。
一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，包括在样品垫上标记金标颗粒复合物，在硝酸纤维素层析膜检测线上标记重组抗原。用于检测对应的唾液中特异性抗体。
一种高灵体唾敏抗液检测试剂盒的制备，主要包括胶体金复合物的制备，硝酸纤维素薄膜包被。样品垫制备等过程，具体方法见具体实施例。
作为本发明进一步的方案，金标颗粒的制备原料包括：直径为20-40nm的胶体金颗粒、亲和素化鼠抗人IgG抗体、桥接免疫分子、桥接免疫分子抗体等，在一定反应条件下，形成“亲和素化鼠抗人IgG—桥接分子—金颗粒”复合物，将在具体实施例中进一步阐述。
本发明具有以下有益效果为：本发明通过使用新的胶体金标记技术，使鼠抗人IgG和胶体金颗粒之间产生一定的距离，减小了由于胶体金直径造成的空间位阻，使待测抗原和鼠抗人IgG之间的反应效率提高；由于亲和素化的鼠抗人IgG的FC端具有四价的生物素识别位点。通过标记了生物素的桥接分子的连接作用，理论上至少可以携带2个胶体金颗粒，可以提高胶体金颗粒与金标试剂的标记效率，使检测线显色加深，从而提高检测的灵敏度。
具体实施方式
为了使本发明的优势和技术方案阐述的更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步的阐述。
实施例1。
本实施例以唾液中乙型肝炎病毒抗体（HCV）为检测对象。
步骤1：制备胶体金颗粒，使用柠檬酸还原法，制备20-40nm直径的胶体金颗粒备用。
步骤2:制备桥接分子：作为一种实施方式，选择寡聚DNA链作为桥接分子，长度约20-30bp，在3’端使用生物素标记，5’端使用地高辛（桥接分子1）和FAM（桥接分子2）分别标记。桥接分子可由商业DNA合成公司购买，本实施例中的桥接分子1和桥接分子2购买于上海生工。
桥接分子1：bio-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-DIG。
桥接分子2：Bio-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM。
步骤3：胶体金颗粒包被：金标颗粒1为标记了地高辛抗体，金标颗粒2包被了FAM抗体，单克隆抗体购置于生物制剂公司。标记方法为：在搅拌状态下，使用碳酸缓冲液调解PH至6.5-7.0之间，加入3-4ul地高辛抗体或FAM抗体继续搅拌30分钟，检测吸光度为OD525-530nm=1.7-2.0.进行离心处理。去上清之后，将沉淀使用PH为6.5-7.0的缓冲溶液进行复融。
步骤4：将上述包被的胶体金颗粒1和2等体积混合，制成混合体系。再将上述混合液与桥接分子1、桥接分子2、亲和素化的鼠抗人IgG以4：2：2:1进行搅拌混合，反应温度为常温，反应体系中NaCl浓度为0.85%，PH为6-9。在反应过程中，持续搅拌，使溶液保持澄清状态。反应30min后，加入地高辛和FAM分子，中和识别位点，终止反应。随后进行低温冷冻离心机上纯化，时间为50-60min，转数1-8000-12000rpm，温度4-8℃。弃去上清，将沉淀物复融至30-40OD。
步骤5:将包被的胶体金复合物加入保护蛋白和表面活性剂，喷涂至玻璃纤维样品垫上。干燥备用。
步骤6将HCV半抗原包被于检测线上，质控抗体蛋白标记于控制线上。干燥。
试验分组：选取不同年龄、不同感染程度的HCV唾液样本100份，同时对样品提供者进行血液样本采集，通过荧光定量PCR法进行检测，阳性样本为61份，其中弱阳性样本为12份。
对上述样本进行检测。采用两种检测试纸条。一种是上述实施例描述的高灵敏试纸，另一种是直接使用鼠抗人IgG标记金颗粒制成的试纸，进行对比试验。
由上述实施例制备的唾液HCV检测试剂盒的实际检测结果可知，通过创新的标记方法，可以降低产品的检测限，从而提高了检测的灵敏度，并且显色均一，易于判读。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于上述实施例，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的保护范围内，可以轻易想到的优化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：包括在玻璃纤维上喷涂胶体金复合物，在硝酸纤维素薄膜上包被重组抗原，用于检测唾液中的病毒特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：胶体金复合物的结构为：桥接分子一端的生物素与亲和素识别结合，另外一端标记的地高辛特异性结合标记在金颗粒上的地高辛抗体，标记的FAM特异性结合标记在金颗粒上的FAM抗体，形成胶体金复合物。
3.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的桥接分子为一段20-30bp的DNA片段，并且在一端标记生物素分子，另一端标记地高辛或FAM等分子。
4.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的桥接分子特异性抗体为地高辛单抗体或FAM抗体。
5.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：胶体金颗粒直径为20-40nm。
6.根据权利要求3所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的两种桥接分子之间无碱基互补的现象。
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