CN108490171A - 一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒及其制备方法,包括在玻纤上喷涂胶体金复合物,在硝酸纤维素层析薄膜的检测限上包被重组抗原。用于检测唾液中含有的微量病毒特异性抗原。其中胶体金复合物是通过桥接分子,将识别抗体和胶体金颗粒进行连接,提高了标记效率,减少胶体金空间位阻。本发明的符合率高,并且提高了唾液抗体检测胶体金试纸的灵敏度,显色更加明显,检测结果更准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒。
技术背景
传统的人类抗体检测主要是检测血液中的抗体,如乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒、人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒等。但是在应用过程中,采集的血液样本可能携带病毒,是潜在的感染源。对医疗检测人员及环境存在潜在的危险。另外,刺血检测会带来创口,增加感染的几率。所以在传统的抗体检测试剂盒的基础上,开发了抗体唾液检测试剂盒。
唾液中抗体的含量约为血清中抗体含量的1/50至1/800。相对于血清,抗体含量极低,如果直接用检测血液的抗原检测试剂盒直接检测唾液,灵敏度过低,极易造成假阴性。这就需要提高检测试剂灵敏度。本发明采用了一种新的胶体金标记抗体的方法,在抗体与胶体金颗粒之间,加入桥接分子,制备金标颗粒复合物,使胶体金标记的效率显著提高,从而增强显色程度,进行信号放大,提高检测试纸的灵敏度。在临床检测中,机体产生的抗体作为判断是否感染病毒的指标,所以使用鼠抗人IgG单克隆抗体为金标试剂,鼠抗人IgG能够特异性识别并结合免疫球蛋白IgG的FC端,形成三层夹心状结构,保证了检测的精确度。
发明内容
本发明针对上述技术背景提出来的问题,提供一种能够在保持精确度的前提下,提高检测灵敏度的方法。
一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,包括在样品垫上标记金标颗粒复合物,在硝酸纤维素层析膜检测线上标记重组抗原。用于检测对应的唾液中特异性抗体。
一种高灵体唾敏抗液检测试剂盒的制备,主要包括胶体金复合物的制备,硝酸纤维素薄膜包被。样品垫制备等过程,具体方法见具体实施例。
作为本发明进一步的方案,金标颗粒的制备原料包括:直径为20-40nm的胶体金颗粒、亲和素化鼠抗人IgG抗体、桥接免疫分子、桥接免疫分子抗体等,在一定反应条件下,形成“亲和素化鼠抗人IgG—桥接分子—金颗粒”复合物,将在具体实施例中进一步阐述。
本发明具有以下有益效果为:本发明通过使用新的胶体金标记技术,使鼠抗人IgG和胶体金颗粒之间产生一定的距离,减小了由于胶体金直径造成的空间位阻,使待测抗原和鼠抗人IgG之间的反应效率提高;由于亲和素化的鼠抗人IgG的FC端具有四价的生物素识别位点。通过标记了生物素的桥接分子的连接作用,理论上至少可以携带2个胶体金颗粒,可以提高胶体金颗粒与金标试剂的标记效率,使检测线显色加深,从而提高检测的灵敏度。
具体实施方式
为了使本发明的优势和技术方案阐述的更加清晰,以下结合实施例,对本发明进行进一步的阐述。
实施例1。
本实施例以唾液中乙型肝炎病毒抗体(HCV)为检测对象。
步骤1:制备胶体金颗粒,使用柠檬酸还原法,制备20-40nm直径的胶体金颗粒备用。
步骤2:制备桥接分子:作为一种实施方式,选择寡聚DNA链作为桥接分子,长度约20-30bp,在3’端使用生物素标记,5’端使用地高辛(桥接分子1)和FAM(桥接分子2)分别标记。桥接分子可由商业DNA合成公司购买,本实施例中的桥接分子1和桥接分子2购买于上海生工。
桥接分子1:bio-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-DIG。
桥接分子2:Bio-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM。
步骤3:胶体金颗粒包被:金标颗粒1为标记了地高辛抗体,金标颗粒2包被了FAM抗体,单克隆抗体购置于生物制剂公司。标记方法为:在搅拌状态下,使用碳酸缓冲液调解PH至6.5-7.0之间,加入3-4ul地高辛抗体或FAM抗体继续搅拌30分钟,检测吸光度为OD525-530nm=1.7-2.0.进行离心处理。去上清之后,将沉淀使用PH为6.5-7.0的缓冲溶液进行复融。
步骤4:将上述包被的胶体金颗粒1和2等体积混合,制成混合体系。再将上述混合液与桥接分子1、桥接分子2、亲和素化的鼠抗人IgG以4:2:2:1进行搅拌混合,反应温度为常温,反应体系中NaCl浓度为0.85%,PH为6-9。在反应过程中,持续搅拌,使溶液保持澄清状态。反应30min后,加入地高辛和FAM分子,中和识别位点,终止反应。随后进行低温冷冻离心机上纯化,时间为50-60min,转数1-8000-12000rpm,温度4-8℃。弃去上清,将沉淀物复融至30-40OD。
步骤5:将包被的胶体金复合物加入保护蛋白和表面活性剂,喷涂至玻璃纤维样品垫上。干燥备用。
步骤6将HCV半抗原包被于检测线上,质控抗体蛋白标记于控制线上。干燥。
试验分组:选取不同年龄、不同感染程度的HCV唾液样本100份,同时对样品提供者进行血液样本采集,通过荧光定量PCR法进行检测,阳性样本为61份,其中弱阳性样本为12份。
对上述样本进行检测。采用两种检测试纸条。一种是上述实施例描述的高灵敏试纸,另一种是直接使用鼠抗人IgG标记金颗粒制成的试纸,进行对比试验。
由上述实施例制备的唾液HCV检测试剂盒的实际检测结果可知,通过创新的标记方法,可以降低产品的检测限,从而提高了检测的灵敏度,并且显色均一,易于判读。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施例,但本发明的保护范围并不局限于上述实施例,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的保护范围内,可以轻易想到的优化或替换,都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:包括在玻璃纤维上喷涂胶体金复合物,在硝酸纤维素薄膜上包被重组抗原,用于检测唾液中的病毒特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:胶体金复合物的结构为:桥接分子一端的生物素与亲和素识别结合,另外一端标记的地高辛特异性结合标记在金颗粒上的地高辛抗体,标记的FAM特异性结合标记在金颗粒上的FAM抗体,形成胶体金复合物。
3.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:所述的桥接分子为一段20-30bp的DNA片段,并且在一端标记生物素分子,另一端标记地高辛或FAM等分子。
4.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:所述的桥接分子特异性抗体为地高辛单抗体或FAM抗体。
5.根据权利要求2所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:胶体金颗粒直径为20-40nm。
6.根据权利要求3所述的一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒,其特征在于:所述的两种桥接分子之间无碱基互补的现象。
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