CN108486223A - 一种吉氏巴贝斯虫rpa分子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，首先根据吉氏巴贝斯虫线粒体COX I基因序列设计一对特异性引物及对应探针，所述的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4所示，然后提取犬血液样品中的总DNA，进行重组酶组合酶扩增反应，最后采用侧向流析试纸条对扩增产物进行检测。本发明具有快速、简单实用并且灵敏度高、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种吉氏巴贝斯虫的重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)分子检测方法。
技术背景
犬吉氏巴贝斯虫病是以蜱为传播媒介的血液原虫病，多发于蜱虫孳生的夏秋季，主要引起犬高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿。自1967年Bauer F在犬中查到巴贝斯虫以来，Birkenheuer等科学家们相继在不同地区犬内发现了此种巴贝斯虫。因此被认为是一种新型的犬流行病。
该病主要的致病阶段是由巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)的原虫寄生于脊椎动物的红细胞，虫体在其中***、繁殖，造成红细胞的裂解，并产生毒素。目前检测方法分为直接法和间接法。直接法对患病动物外周血涂片镜检，此方法简便，特异性高，但敏感性较差，与动物的染虫率密切相关，同时受环境、人员等外界的因素干扰相对比较大。间接法即免疫学诊断法，主要有补体结合反应、间接免疫荧光试验、ELISA、放射免疫试验等。其中间接免疫荧光试验和补体结合反应最为敏感。以上方法都比较繁琐，只适合用于实验室检查，而不适合临床的诊断。
基于分子水平对吉氏巴贝斯虫COX I基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器、检测费用高，耗时长、对检测人员要求较高的技术等，无法在条件较差的基层实验室进行。重组酶聚合酶等温扩增可以在等温条件下高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)从而大大降低了检测的费用，能更广泛地应用于犬吉氏巴贝斯虫病的临床诊断以及以非临床诊断为目的的吉氏巴贝斯虫实验室筛查鉴定中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的犬吉氏巴贝斯虫的RPA分子检测方法。
本发明的具体方案包括下列步骤：
1)引物设计：根据2016年已报道的登录号为AB499087.1的吉氏巴贝斯虫线粒体COX I基因序列(见序列表SEQ ID NO：1所示)设计一对特异性引物及对应探针，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
上游引物F1：5'-ATAGTTTATTGCTTCAGCCAATAGCTTTCTGTTTGG-3'；
下游引物R1：5'-TATCTACAGTTTGACCAATTGATTTTAAAGCGCC-3'；
探针：5＇-ATAATATTTGGTTTACTTGCCTCAGGTATAGCTAGTGCTATGAGTG-3＇
上述引物对的核苷酸序列已经采用专用软件处理成专利程序的核苷酸序列计算机可读形式副本，这些引物对在序列表中被依次命名为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4。
2)提取犬血液样品中的总DNA，进行重组酶组合酶扩增反应；
3)采用侧向流析试纸条对扩增产物进行检测。
优选地，所述重组酶组合酶扩增反应的体系为：29.5μL Rehydration Buffer的缓冲液，11.2μL ddH2O，2.1μL上游引物，2.1μL下游引物，2μL DNA模板，0.6μL探针，2.5μL280mM的醋酸镁。
优选地，所述重组酶组合酶扩增反应的条件为：30-40℃，避光，反应20min。
优选地，所述侧向流析试纸条检测的方法是：取50μL的重组酶聚合酶扩增的最终反应产物2μL，加入至含有98μL MGCB running buffer的1.5mL离心管中，混匀后将试纸条垂直放入离心管，反应3min，拿出试纸条并拍照。
结果说明：仅质控线显色为阴性样本；检测线及质控线均显色且相应阴性样本正常显色为阳性样本。
本发明成功建立了对吉氏巴贝斯虫的RPA分子检测方法，与其它传统方法相比具有以下优点：
1.本发明经济实用：反应是在恒温的条件下进行,不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，比如水浴锅即可完成。
2.本方法的灵敏度高：结果显示本发明所建的RPA方法在拷贝数为1.58×106copies/ml的阳性gDNA稀释到0.5个虫体/ul时仍能检测到阳性扩增条带，检测最低限度为0.5个虫体/ul。比普通PCR敏感性高10-100倍。
3.本发明的方法特异性强：1对引物对靶序列的3个特异序列区的识别，保证了RPA方法扩增的高度特异性。
4.本发明快速省时：扩增反应20min，试纸条检测扩增产物3min，总耗时少于1h。
5.本发明检测简单：直接肉眼观察反应产物经试纸条显色来定性判断吉氏巴贝斯虫COX I靶序列扩增与否。
附图说明
图1是RPA扩增温度条件的筛选结果。图中：1-7号试纸条的温度分别为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃、50℃。
图2是RPA扩增时间的筛选结果。图中：1号试纸条为阴性对照；2-7号试纸条的反应时间分别为5min，10min，15min，20min，25min和30min。
图3是吉氏巴贝斯虫COX I基因特异性检测的电泳结果。图中：泳道M：DNA Marker；1：邓氏巴贝斯虫；2：双芽巴贝斯虫；3：田鼠巴贝斯虫；4：东方巴贝斯虫；5：恶性疟原虫；6：环形泰勒虫；7：刚地弓形虫；8：长角血蜱；9：健康犬；10：水；11：阳性对照。
图4是吉氏巴贝斯虫COX I基因侧向流析试纸条检测结果。图中：1：阳性对照；2：双芽巴贝斯虫；3：田鼠巴贝斯虫；4：东方巴贝斯虫；5：恶性疟原虫；6：环形泰勒虫；7：刚地弓形虫；8：长角血蜱；9：健康犬。
图5是用18S rRNA通用引物检测犬血液总DNA中的吉氏巴贝斯虫电泳结果。图中：泳道M：DNA Marker 2KII，泳道1、2为待检样品，3为阳性对照，4为阴性对照，结果显示两份样品均为阳性。
图6：是对犬吉氏巴贝斯虫RPA检测方法敏感性实验结果。图中：1-8分别是106个虫体/ul血液、10个虫体/ul、5个虫体/ul、2.5个虫体/ul、1.25个虫体/ul、1个虫体/ul、0.5个虫体/ul、0.25个虫体/ul的血液，其中1为阳性标准品，2-8模板为阳性标准品稀释后的DNA，9模板为阴性对照ddH2O。
具体实施方式
实施例1：对犬血液样品进行吉氏巴贝斯虫的检测
1.犬血样总DNA的提取
用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(购自QIAGEN公司，目录号：No.51304，按试剂盒说明书操作)提取犬血液样品中的总DNA。
2.引物设计
上游引物F1：5'-ATAGTTTATTGCTTCAGCCAATAGCTTTCTGTTTGG-3'；
下游引物R1：5'-biotin-TATCTACAGTTTGACCAATTGATTTTAAAGCGCC-3'；(其中biotin为生物素标记，标记了生物素的引物相当于进一步标记了扩增产物，进而被试纸条检测线上的生物素配体捕获。)
探针：5＇-FAM-ATAATATTTGGTTTACTTGCCTCAGGTATA-THE-GCTAGTGCTATGAGTG-SPC3-3＇(其中FAM、THE、SPC3分别为羧基荧光素、四氢呋喃和封闭基团C3Spacer。FAM羧基荧光素标记的特异探针与Biotin生物素标记的核酸扩增产物特异性结合，将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物,当扩散到检测线时，三元复合物被生物素配体捕获，形成检测线；未杂交的FAM标记探针与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成不含生物素的两元复合物，结合在质控线上。)
3.重组酶聚合酶扩增
建立一个重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系，该体系如下：29.5μLRehydrationBuffer的缓冲液，11.2μL ddH2O，2.1μL的上游引物，2.1μL的下游引物，2μL DNA模板，0.6μL的探针，2.5μL 280mM的醋酸镁。其中阳性对照为已鉴定过吉氏巴贝斯虫阳性犬的gDNA，阴性对照为灭菌双蒸水。将上述50μL总反应液分别放置到20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，作用30min。选最优温度，进行时间优化，依次反应5min、10min、15min、20min、25min、30min。
温度梯度检测结果如图1，从图中可以看出，当反应温度为30-40℃时，条带更加清晰；时间梯度检测结果如图2，从图中可以看出，RPA扩增时间20min效果最好。
4.重组酶聚合酶反应扩增产物分析
侧向流析试纸条：取50μL的重组酶聚合酶扩增的最终反应产物2μL，加入至已含有98μL MGCB running buffer的1.5mL离心管中，混匀后将试纸条垂直放入离心管，反应3min。拿出试纸条并拍照。结果说明：仅质控线显色为阴性样本；检测线及质控线均显色且相应阴性样本正常显色为阳性样本。
实施例2：犬吉氏巴贝斯虫RPA检测方法特异性试验
如表1所示，在特异性试验中所用的犬吉氏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、田鼠巴贝斯虫、东方巴贝斯虫、环形泰勒虫以及刚地弓形虫虫株是由本申请人所在的动物寄生虫实验室分离并保存的虫株。恶性疟原虫DNA是重庆市第三军医大学惠赠。所有虫株均以冷冻抗凝血的形式保存。此外长角血蜱和犬gDNA均由本申请人所在的动物寄生虫实验室提供。
表1犬吉氏巴贝斯虫RPA检测的特异性试验
表1的说明：“+”表示试纸条检测线显色，“－”表示试纸条检测线不显色。
重组酶聚合酶反应扩增产物分析：
琼脂糖凝胶电泳：取50μL的RPA扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳20min，在凝胶成相***上成像观察扩增产物的图谱。结果如图3所示，仅11泳道在233bp处有单一条带检测为吉氏巴贝斯虫阳性，其余泳道均未检测到目标条带，说明该引物特异性较好。
侧向流析试纸条：取50μL的RPA扩增的最终反应产物2μL，加入至已含有98μL MGCBrunning buffer的1.5mL离心管中，混匀后将试纸条垂直放入离心管，反应3min。拿出试纸条并拍照。结果如图4所示，2-9号试纸条仅质控线显色，说明2-9号模板DNA为阴性样本；1号试纸条检测线及质控线均显色，说明1号模板DNA为阳性样本。
从试验结果可以看出，本发明对吉氏巴贝斯虫检测的特异性、准确性很高。
实施例3：犬吉氏巴贝斯虫RPA检测方法敏感性试验
以吉氏巴贝斯虫阳性gDNA为模板进行吉氏巴贝斯虫RPA方法的敏感性试验。方法如下：
1.从犬血液样品中提取血液总DNA模板。
2.普通PCR鉴定虫株：用18S短通用引物扩增犬血液总DNA中犬吉氏巴贝斯虫的18SrRNA基因部分，所述的引物对的核苷酸序列如下所示。
上游引物F2：5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCAT-3'；
下游引物R2：5'-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'；
反应体系为：TaKaRa Taq酶(5U/μl)0.3μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTPMixture(2.5mM)4μL，模板DNA 2μL，ddH2O 16.2μL，上下游引物各1μL。反应总体系为25μL。
3.PCR产物分析：上述PCR最终产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳20min，在凝胶成相***上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物在400bp处有单一条带为巴贝斯虫阳性。结果如图5。
4.阳性gDNA的鉴定：
将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(该试剂盒购自TianGen公司)回收DNA并送测。
将测序结果导入NCBI数据库进行序列比对，证实该gDNA为犬吉氏巴贝斯虫的阳性模板。
5.将阳性gDNA通过荧光定量PCR扩增，计算拷贝数
经计算犬吉氏巴贝斯虫阳性gDNA的拷贝数为：1.58×106copies/ml。
用ddH2O将上述gDNA先进行10倍倍比稀释，即分别稀释到105、104、103102、10、1；再将10个虫体/ul进行2倍稀释，即分别稀释到5、2.5、1.25个虫体/ul；将1个虫体/ul进行2倍稀释至0.5、0.25个虫体/ul。具体稀释方法如下：10倍稀释：取10μL标准阳性gDNA加入90μLddH2O中，充分混匀后取10μL加入另一管已有90μL ddH2O的EP管中，再次混匀后取10μL加入下一管已有90μL ddH2O的EP管中，依次类推。而2倍稀释是取20μL标准阳性gDNA加入20μLddH2O中，充分混匀后取20μL加入另一管已有20μL ddH2O的EP管中，再次混匀后取20μL加入下一管已有20μL ddH2O的EP管中，依次类推。
6.RPA敏感性实验：以F1、R1为引物，加入探针对已稀释好的阳性gDNA进行扩增。稀释好的阳性gDNA分别取2μL，体系中其它试剂为29.5μL Rehydration Buffer的缓冲液，11.2μL ddH2O，2.1μL的上游引物，2.1μL的下游引物，2μL DNA模板，0.6μL的探针，2.5μL280mM的醋酸镁。其中阳性对照为已鉴定过吉氏巴贝斯虫阳性犬的gDNA，阴性对照为灭菌双蒸水。将上述50μL总反应液放置到37℃培养箱作用20min。
7.扩增产物分析：取50μL的重组酶聚合酶扩增的最终反应产物2μL，加入至已含有98μL MGCB running buffer的1.5mL离心管中，混匀后将试纸条垂直放入离心管，反应3min。拿出试纸条并拍照。结果说明：仅质控线显色为阴性样本；检测线及质控线均显色且相应阴性样本正常显色为阳性样本。结果如图6所示，第7条试纸条检测线仍显色。该结果显示此RPA方法在拷贝数为1.58×106copies/ml的阳性质粒稀释到0.5个虫体/ul血液仍可检测到微弱条带。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1575
<212> DNA
<213> 吉氏巴贝斯虫线粒体COX I基因()
<400> 1
atggtgcccc aggccctgct cttcgtgcct ctgctcgtct ttccactgtg cttcggcaaa 60
tttcccatct acactattcc tgacaagctg ggaccctgga gtcctatcga tattcaccat 120
ctgtcatgcc ctaacaatct cgtggtcgag gatgaagggt gtaccaacct gtcaggtttc 180
agctacatgg agctgaaagt ggggtatatc ctcgctatta aggtcaacgg cttcacatgc 240
actggagtgg tcaccgaggc agaaacctac acaaattttg tgggctatgt caccacaact 300
ttcaagagga aacactttag accaacaccc gacgcctgtc gcgccgctta caactggaag 360
atggctggcg atccacgata tgaggaatct ctgcacaatc cttacccaga ctatagatgg 420
ctgcggacag tgaagaccac aaaagagagc ctggtcatca ttagcccatc cgtcgcagac 480
ctggatccct acgatagatc cctgcactct cgggtgtttc cctctggcaa gtgcagtgga 540
gtggccgtca gctccactta ctgtagcacc aaccatgatt atactatctg gatgccagag 600
aatccccggc tgggaatgtc ctgcgacatt ttcacatcta gtcgcgggaa gcgagccagt 660
aaagggtcag agacttgtgg ttttgtggac gaaaggggcc tgtataagag cctcaaagga 720
gcttgcaagc tgaaactctg tggcgtgctg ggactcagac tgatggatgg aacctgggtc 780
tcaatgcaga caagcaacga gactaagtgg tgcccccctg acaaactcgt gaatctgcac 840
gacttcaggt ccgatgagat cgaacatctg gtggtcgagg aactcgtgcg aaaaagggag 900
gaatgtctcg atgctctgga gtctatcatg actaccaagt ctgtgagttt taggagactc 960
agtcacctga gaaagctcgt ccctggcttc ggaaaagcat acaccatctt taacaagaca 1020
ctgatggaag cagacgccca ttataaaagc gtggagacct ggaatgaaat cctgccatcc 1080
aagggatgcc tccgagtcgg aggacgctgt caccctcatg tgaacggcgt cttctttaat 1140
ggaatcattc tggggcctga cggtaacgtg ctgatcccag agatgcagtc aagcctgctc 1200
cagcagcaca tggagctgct cgaatcctct gtgattcctc tggtccatcc actcgcagat 1260
ccctctacag tgttcaagga cggggatgag gccgaagact ttgtggaggt ccacctgcca 1320
gatgtgcata accaggtgtc tggggtcgac ctcggtctgc ccaattgggg gaagtacgtg 1380
ctgctcagcg ccggtgcact gactgctctc atgctgatca ttttcctgat gacctgctgt 1440
cgacgagtga accggtccga gcctactcag cacaatctgc gagggaccgg tagagaagtg 1500
tccgtcacac cacagtctgg caaaatcatt agttcatggg agagccataa gtccgggggt 1560
gaaacacgcc tgtga 1575
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atagtttatt gcttcagcca atagctttct gtttgg 36
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tatctacagt ttgaccaatt gattttaaag cgcc 34
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ataatatttg gtttacttgc ctcaggtata gctagtgcta tgagtg 46
Claims (5)
1.一种吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据吉氏巴贝斯虫线粒体COX I基因序列设计一对特异性引物及对应探针，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
上游引物F1：5'-ATAGTTTATTGCTTCAGCCAATAGCTTTCTGTTTGG-3'；
下游引物R1：5'-TATCTACAGTTTGACCAATTGATTTTAAAGCGCC-3'；
探针：5＇-ATAATATTTGGTTTACTTGCCTCAGGTATAGCTAGTGCTATGAGTG-3＇
2)提取犬血液样品中的总DNA，进行重组酶组合酶扩增反应；
3)采用侧向流析试纸条对扩增产物进行检测。
2.如权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，其特征在于：在所述下游引物R1序列的5＇端接上biotin生物素标记，在所述探针序列的5＇端接上FAM羧基荧光素标记，在所述探针序列的第30和31位点之间***THE四氢呋喃标记，在所述探针序列的3＇端接上SpC3封闭基团。
3.如权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，其特征在于所述重组酶组合酶扩增反应的体系为：29.5μL Rehydration Buffer的缓冲液，11.2μL ddH2O，2.1μL上游引物，2.1μL下游引物，2μL DNA模板，0.6μL探针，2.5μL 280mM的醋酸镁。
4.如权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，其特征在于所述重组酶组合酶扩增反应的条件为：30-40℃，避光，反应20min。
5.如权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫RPA分子检测方法，其特征在于所述侧向流析试纸条检测的方法是：取50μL的重组酶聚合酶扩增的最终反应产物2μL，加入至含有98μL MGCBrunning buffer的1.5mL离心管中，混匀后将试纸条垂直放入离心管，反应3min，拿出试纸条并拍照。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109593870A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-04-09 | 华中农业大学 | 一种东方巴贝斯虫rpa分子检测方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710433A (zh) * | 2013-11-14 | 2014-04-09 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 |
| CN105734158A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-07-06 | 新疆农业大学 | 一种马驽巴贝斯虫病荧光pcr检测试剂盒 |
| CN107653333A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-02-02 | 王素华 | 一种牛巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710433A (zh) * | 2013-11-14 | 2014-04-09 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 |
| CN105734158A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-07-06 | 新疆农业大学 | 一种马驽巴贝斯虫病荧光pcr检测试剂盒 |
| CN107653333A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-02-02 | 王素华 | 一种牛巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BARBARA A. QUROLLO等: "Improved molecular detection of Babesia infections in animals using a novel quantitative real-time PCR diagnostic assay targeting mitochondrial DNA", 《PARASITES & VECTORS》 * |
| SEBASTIAN KERSTING等: "Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis", 《MALARIA JOURNAL》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109593870A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-04-09 | 华中农业大学 | 一种东方巴贝斯虫rpa分子检测方法 |
| CN110229827A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-09-13 | 华中农业大学 | 一种犬吉氏巴贝斯虫表面蛋白及其应用 |
| CN110229827B (zh) * | 2019-05-22 | 2020-12-18 | 华中农业大学 | 一种犬吉氏巴贝斯虫表面蛋白及其应用 |
| CN111534625A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-08-14 | 天津拓瑞医药科技有限公司 | 一种吉氏巴贝斯虫pcr检测方法 |
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