CN108484956A - 具有图案化表面的可降解高分子材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物材料技术领域，具体为一种具有图案化表面的可降解高分子材料及其制备方法与应用。本发明的可降解高分子材料，以可生物降解的水凝胶为基质，其表面修饰有由活性物质组成的图案；所谓图案化表面是指在基质材料表面通过修饰形成图案阵列。水凝胶表面所构筑的图案化形貌结构稳定，成分可独立于基底材料组分。所得材料具有良好的生物相容性、可控的降解性，图案化形貌可供进一步修饰拥有响应性生物活性位点；动态降解性的引入使材料具备更贴近真实生理环境的功能。该材料可以应用于干细胞培养、组织工程、生物诊断、生物识别、仿生材料设计等领域。

Description

具有图案化表面的可降解高分子材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属生物材料技术领域，具体涉及一种可降解高分子材料及其制备方法与应用。
背景技术
生物材料的降解性是设计新型生物医用材料需要考虑一个极为重要的性质。生物材料在植入人体后的初期应具备组织修复和替代所需的模量和强度等方面的要求；一旦降解则涉及到材料诸多性质的变化，如模量和强度下降、质量损失、化学组成变化等。目前有关材料降解的规律已经有不少研究，但是对生物材料的降解如何模拟环境动态变化和影响生物体内大小单位的行为如干细胞的黏附和分化方面的研究还远远不够。相关基础研究的深入开展首先需要建立可控的材料体系。
具有生物相容性和良好可控性的材料，在研究细胞行为受多因素调控的影响下，体系中可以引入较低的复杂性；在已有的材料体系中引入可降解组分是使其具有降解性最为普遍的方法，常见策略是在不可降解水凝胶的分子链两端引入可降解组分如水解敏感成分或酶可识别的多肽序列作为交联单元，使合成得到水凝胶具有降解性。通过调节共聚单元的数目，此类材料交联特性和降解性可以在一定范围内进行调控。
图案化技术为***性研究生物材料的细胞响应性提供了可靠的材料手段。通过图案化技术构筑的结构可以帮助理解很多细胞层面甚至是更小的分子层面的响应信息，对所构筑的图案的尺度、分布、组成进行调整，还可以帮助揭示细胞与材料相互作用的规律。材料体系的建立过程中引入图案化技术，能够隔离庞杂的材料信息，帮助解释复杂的生理过程。
本发明以生物相容性良好的可降解水凝胶为基础，结合图案化技术搭建了一类基底可降解并具备图案化表面形貌的水凝胶材料平台。该材料体系具有可调控的降解性以及良好的动态响应性，可以调控细胞、组织等活性体与材料的相互作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有图案化表面的可降解高分子材料及其制备方法和应用。
本发明提供的具有图案化表面的可降解高分子材料，以可生物降解的水凝胶为基质，其表面修饰有由活性物质组成的图案；所谓图案化表面是指在基质材料表面通过修饰形成图案阵列。
本发明的高分子材料中，所述的可生物降解的水凝胶，为天然来源的胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、纤维蛋白或它们衍生物为基的水凝胶。
本发明的高分子材料中，所述的可生物降解的水凝胶，为人工合成来源的聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚甲基丙烯酸甲酯等与少量的可降解聚酯、聚氨基酸、多肽、聚氨酯、聚酯酰胺、聚正交酯、聚酸酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚磷腈、聚磷酸酯通过共聚、交联、共混、形成互穿网络的方式相结合而成的水凝胶。
本发明的高分子材料中，所述的可生物降解的水凝胶，为聚乙二醇与寡聚酯通过形成大单体的方式聚合交联而成的水凝胶。
本发明的高分子材料中，所述的活性物质，选自下述物质的一种或几种：铂、金、钛、锆、钴、镍、银类金属，羟基磷灰石、骨水泥、生物玻璃类无机非金属，胶原、纤维素蛋白、纤连蛋白类生物大分子，特殊的活性多肽序列。
本发明的高分子材料中，所述的活性物质，选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（REDV）的多肽序列。
本发明的高分子材料中，所述的图案化表面的形貌尺度可以是宏观尺度或微观尺度或二者结合：宏观尺度指肉眼可观察的范围（如为~cm量级），微观尺度指是微米尺度（即~µm量级）、纳米尺度（即~nm量级），或者二者的结合。
本发明所述的高分子材料，可通过水解、酶促水解、细菌分解、热分解、氧化降解单独或多者结合的方式降解。其降解速率可以通过调整降解组分的比率和降解触发物来调节。
本发明提供的具有图案化表面的可降解高分子材料的制备方法，主要涉及图案转移，具体步骤如下：
（1）利用掩膜版辅助的光刻、嵌段共聚物胶束自组装或二者结合的方式在稳定基底表面构筑不同尺度的图案阵列，得到图案化模板；
（2）将经修饰的天然高分子或人工合成高分子与可降解物质共聚，获得含降解组分且可交联聚合的高分子大单体；
（3）对于含图案阵列的基底表面进行偶联剂修饰，使上述高分子大单体通过聚合反应与图案表面结合形成可降解高分子组成的水凝胶，从而将图案转移到可降解水凝胶的表面。
上述的制备方法中，所述图案基底表面进行偶联剂修饰，是指引入可以同时与表面图案以及高分子大单体发生相互作用的双官能团偶联剂，促进图案阵列转移。
所述的双官能团偶联剂，其一端官能团可以与基底表面的图案阵列形成共价键、离子键、金属键、配位键其中之一的稳定的键合，另一端官能团可以是烯烃双键、巯基、金属离子，作为单体组分参与到水凝胶交联网络聚合过程。
上述的制备方法中，可降解高分子大单体聚合成为水凝胶可以是热交联、光交联、离子交联的方式。
上述的制备方法中，步骤（1）所述的掩膜版辅助的光刻方式可以在稳定基底构筑微米尺度图案化模板，微米尺度图案模板尺度可选择在1 µm~5000 µm，通过含有不同尺寸图形阵列的光刻掩膜板来获得。
上述的制备方法中，步骤（1）所述的嵌段共聚物胶束自组装的方式可以在稳定基底构筑纳米尺度的图案化阵列，纳米尺度图案模板的尺度在5-150 nm范围。
上述的嵌段共聚物胶束自组装方式在稳定基底上构筑纳米图案化阵列，是通过两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂中负载不同类型金属盐的前驱体来调节所得到纳米图案的尺寸、分布及组分。胶束阵列经等离子体处理以后，可以去除嵌段共聚物成分，将金属从前驱体中还原，得到金属阵列。
上述的制备方法中，步骤（1）所述的图案化模板可以是微米-纳米尺度杂合图案，是先通过嵌段共聚物自组装法得到纳米尺度的图案阵列模板，再经过旋涂-光刻步骤将得到的纳米尺度图案阵列以微米尺度的图形阵列进行限定来获得的。
上述的制备方法中，通过使用活性物质进一步对水凝胶表面图案阵列进行修饰，可在水凝胶表面构筑多种活性物质的图案阵列。
本发明提供的具有图案化表面的可降解高分子材料，其降解速率可以通过调整降解组分的比率和降解触发物来调节。图案化技术能在材料表面构筑宏观到微观多尺度的结构，可以成为生物材料研究中涉及的精准相互作用（如靶向生物识别、细胞膜配体-受体结合等）的平台，材料降解的过程对前述相互作用的影响亦成为研究的新视野。
本发明提供的具有图案化表面的可降解高分子材料，具有良好的生物相容性，可应用于生物识别及诊断、细胞培养、细菌和其它微生物的培养、细胞筛选、细菌和其它微生物的筛选、组织工程等领域。
本发明的优点在于：
（1）可降解高分子生物材料具有良好的生物相容性；
（2）制备方法操作性强，可批量制备，可控性强；
（3）表面经图案化修饰的可降解水凝胶，可以通过降解所引起的材料性质动态变化，仿生真实体外环境刺激或体内环境生理变化过程，对材料应用过程中器官、组织、细胞所受到的动态环境刺激做出解释；
（4）图案化阵列的尺度、成分组成、分布可以调节，可以在研究多尺度多维度的对象如分子、细胞、组织、器官的响应作用和各类表征、精加工仪器的识别与监测等方面发挥作用，应用于干细胞培养、组织工程、生物诊断、生物识别、仿生材料设计等多方面体内外应用领域。
附图说明
图 1为表面图案化水凝胶的制备与降解。其中，（a）虚线框处部分为实施例 13聚乙二醇-寡聚酯大单体的合成，下方为实施例44-60大单体在图案化玻片表面进行聚合转移的示意图；（b）水凝胶降解过程中交联网络结构瓦解示意图。
图2为实施例40玻片表面纳米图案阵列扫描电镜表征图。其中，（a）嵌段共聚物P18225-S2VP通过胶束自组装构筑在玻片上所形成的纳米金点分布图，纳米间距为30 nm左右；（b）嵌段共聚物P4633-S2VP通过胶束自组装构筑在玻片上所形成的纳米金点分布图，纳米间距为64 nm左右；（c）嵌段共聚物P5052-S2VP通过胶束自组装构筑在玻片上所形成的纳米金点分布图，纳米间距为90 nm左右。
图3为实施例40中，用实施例36得到的P4633-S2VP纳米图案化玻片表面进行原子力显微镜表征图。其中，（a）玻片表面纳米阵列二维AFM表征高度图像；（b）与二维高度图同视野的三维高度图像；（c）二维高度图像中虚线所指示纳米金点列的高度曲线图。
图4为实施例69-70，实施例66-67得到的纳米图案化水凝胶表面扫描电镜表征图。其中，（a）由嵌段共聚物P4633-S2VP所构筑的纳米阵列转移到水凝胶表面的扫描电镜表征图；（b）由嵌段共聚物P18225-S2VP所构筑的纳米阵列转移到水凝胶表面的扫描电镜表征图。
图5为实施例82，对实施例80得到的已接枝RGD多肽纳米图案化水凝胶表面进行细胞黏附试验，以及所得到的一天（左）以及七天（右）的荧光染色照片。其中（a）干细胞接种在图案化可降解水凝胶表面一天后的细胞荧光染色图像；（b）干细胞接种，在图案化可降解水凝胶表面七天后的细胞荧光染色图像。
具体实施方式
下面通过实例进一步描述本发明，但不限于这些实施例。
实施例1天然高分子衍生物单体合成
取分子量为50kDa的透明质酸（HA）50g用Milli-Q溶解配制为1 wt%的溶液，用1 M氢氧化钠溶液将溶液pH调节至8，以滴加的方式向溶液体系加入50%当量的甲基丙烯酸酐，体系于冰浴条件下反应24小时。反应后，用截留分子量范围为5-8 kDa的透析膜进行透析，最初12小时内，每小时换一次水，后面对透析溶液置换时间可适当延长至2~3小时，总透析时长为48小时。透析完毕后的产物用冷冻干燥机除去水分，48小时后取出白色粉末状固体MeHA，密封保存于-20℃冰箱。
实施例2
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 2000）50g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入消旋丙交酯（DL-LA）14.4 g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例3
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 2000）50g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入三亚甲基碳酸酯20.4g（200 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例4
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 2000）50g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入乙交酯11.6g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例5
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 2000）50 g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入己内酯（CL）11.4 g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例6
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 4000）100g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入消旋丙交酯（D,L-LA）14.4 g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例7
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 4000）100g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入三亚甲基碳酸酯（TMC）10.2g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例8
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 4000）100 g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入乙交酯（GA）11.6 g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例9
称取带双羟基的聚乙二醇（M n= 4000）100 g（25 mmol），转移入三颈反应瓶。将体系密封，通上氩气进行保护，接水冷泵散热；体系升温至120℃，同时开启搅拌，进行抽真空3 h进行除水。除水完毕后，体系降温至80℃，增大氩气通气量，依次向三颈瓶内加入己内酯（CL）11.4 g（100 mmol）、反应物比0.1 wt%的辛酸亚锡催化剂，将体系升温至140℃进行反应。反应12 h后，将反应体系降至120℃，抽真空2~3 h，后将体系降至室温。用适量氯仿稀释反应产物液体，在搅拌条件下，缓缓将其转移入体积比1:10冰***中进行沉降，全部加入完毕后静置于-20℃冰箱中使沉降完全。静置沉降12 h后，滤掉上层沉降液，用冷冻干燥机抽除残余***，得到白色固体粉末，密封保存于-20℃冰箱待后续取用。
实施例10按照实施例2-9给出的基本步骤，用不同分子量双羟基的PEG与不同聚酯单体合成嵌段共聚物，其反应产物性质列于下表1：
表1
。
实施例11
开环聚合产物分子链两端引入双键进行修饰。按照实施例10给出的寡聚单元修饰数估算出实施例10中各开环共聚产物的分子量；快速称取10 mmol的产物单体，转移入带支口的反应瓶，抽换空气3次，保证内部气体环境为氩气氛围；用长针头取90 mL二氯甲烷加入反应瓶内，开启搅拌，溶解反应物。使体系处于冰浴条件下，待冷却完全后，用长针头取7 mL左右的三乙胺加入反应瓶；在注射器内快速配制40 mmol丙烯酰氯的二氯甲烷溶液10 mL，用注射泵缓慢滴加入反应瓶内。整个滴加过程保持冰浴条件，滴加速度维持匀速，滴加自开始到完成，必须保持在冰浴下反应6 h，撤除冰浴后，在室温下继续反应18 h。反应后的混合液体为浅黄色，经硅藻土装填的砂芯漏斗过滤盐分后得到澄清透明产物液，但此时仍有少部分副产物盐溶于二氯甲烷溶剂中，故加入适量乙酸乙酯进行萃取，使剩余的盐析出；砂芯漏斗过滤后得到产物乙酸乙酯与二氯甲烷的混合液，旋蒸蒸出大部分溶剂后，用1:10体积的冰***进行沉降，24 h后过滤出沉降物用二氯甲烷溶解后再度进行沉降，进一步除杂。沉降产物经冷冻干燥后得到乳白色的固体粉末，简称为oligoester-PEG-oligoester DA单体，密封保存于-20℃冰箱中，合成过程示意见图1.
实施例12
按照实施例11给出的基本步骤，不同分子量双羟基的PEG经双键修饰以及其与不同的聚酯单体合成的嵌段共聚物经双键修饰，反应产物性质列于下表2：
表2
。
实施例13
称取实施例12得到的2.25 g oligoLA-PEG2000-oligoLA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶。
实施例14
称取实施例12得到的2.0 g oligoLA-PEG2000-oligoLA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为20 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为20%的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶。
实施例15
称取实施例12得到的4.0 g oligoLA-PEG2000-oligoLA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为50 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为50%的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶。
实施例16
称取实施例12得到的2.25 g oligoTMC-PEG2000-oligoTMC DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoTMC-PEG2000-oligoTMC水凝胶。
实施例17
称取实施例12得到的2.25 g oligoGA-PEG2000-oligoGA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoGA-PEG2000-oligoGA水凝胶。
实施例18
称取实施例12得到的2.25 g oligoCL-PEG2000-oligoCL DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoCL-PEG2000-oligoCL水凝胶。
实施例19
称取实施例12得到的2.25 g oligoLA-PEG4000-oligoLA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoLA-PEG4000-oligoLA水凝胶。
实施例20
称取实施例12得到的2.25 g oligoTMC-PEG4000-oligoTMC DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoTMC-PEG4000-oligoTMC水凝胶。
实施例21
称取实施例12得到的2.25 g oligoGA-PEG4000-oligoGA DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoGA-PEG4000-oligoGA水凝胶。
实施例22
称取实施例12得到的2.25 g oligoCL-PEG4000-oligoCL DA单体，用Milli-Q配制为浓度为45 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.1 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为45%的oligoCL-PEG4000-oligoCL水凝胶。
实施例23
称取实施例1得到的3 g MeHA单体，用Milli-Q配制为浓度为30 wt%的溶液，密封避光搅拌12 h及以上至完全溶解；提前用Milli-Q超声清洗干净玻片，于室温条件下晾干之后置入聚合反应玻璃架，充分贴合；在上述准备工作进行同时，向大单体溶液中加入事先配制好浓度为0.05 wt%的D2959光引发剂饱和溶液（7.6 mg/mL）并避光搅拌0.5 h，得到预聚合溶液。预聚合溶液转移入带支口的圆底玻璃反应瓶中，抽换氮气3次，防止其阻聚，整个过程保持避光，后放置于阴暗处待取用。准备完毕后，向干净玻片上方小心滴入300 µL左右预聚合溶液，用盖玻片扣紧以密封；将玻璃反应架全部转移入紫外反应装置中，通高纯氮排出反应器内空气5min后，开启紫外灯，聚合1 h。得到固含量为30 %的MeHA水凝胶。
实施例24
实施例13-23得到的凝胶样片在溶剂中充分溶胀后，夹出并用擦拭纸将其表面水分拭去，用流变仪测试其压缩模量。流变仪的夹具选择型号为PU 8、直径为8 mm的平板夹具；试验开始，设置夹具下降速度为0.005 mm/s，得到水凝胶法向受力Force与夹具间距Gap值曲线，根据水凝胶样片初始厚度值及水凝胶受力面积大小，换算得到应力应变（σ-e）曲线，在低应变e ≤ 5%的范围内，由应力应变曲线的斜率可以得到水凝胶的压缩模量。
实施例25
实施例13-23得到的水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中溶胀24 h后取出，其特定线尺寸（例如直径）的变化可以由尺子量取，线性溶胀比（linearswellingratio）由溶胀前后的水凝胶样品特定边尺寸之比得出
其中，D1指水凝胶在溶胀前的线尺寸；D2指水凝胶样片在溶胀后的线尺寸；
实施例 26
实施例13-23得到的水凝胶，在PBS中充分溶胀后从溶剂中夹取水凝胶样片，用擦拭纸拭去其表面水分，称重，记录为m 1；后将水凝胶于真空干燥烘箱中干燥至恒重m 0。干态聚合物大单体粉末的密度由比重法测得。体积溶胀比（Q V）由质量溶胀比（Q m）换算得出
其中，指干态聚合物大单体的密度；指溶剂的密度。
实施例 27，在玻璃基底上构筑金微米图案
用食人鱼洗液（H2SO4: H2O2= 3:1）处理玻片，超纯水超声清洗三次，每次10分钟，后用氮气吹干。玻片放入丙酮中超声处理830分钟，氮气吹干后在120℃烘箱中烘4小时，冷却至室温备用。于暗室中将光刻胶以3500 r/min，20 s的参数均匀涂覆在上述清洗干净的玻片上，然后置入150℃烘箱烘30分钟。用光刻机进行光刻，选择掩膜版上直径范围在4µm-100 µm的微米圆岛作为模板，在掩膜版下被紫外光照射到的部分在有机溶剂中的溶解度会增加。曝光完毕的玻片放入显影液中35 s，再放入超纯水中进行定影。定影后的玻片用氮气吹干，放入120℃烘箱中烘30分钟。玻片冷却至室温后，放入离子溅射仪中以8 mA，100 s喷金处理。喷金完毕的玻片置入丙酮超声处理3次，每次10分钟。氮气吹干后静置存放。
实施例 28，在玻璃基底上构筑金微米图案
用食人鱼洗液（H2SO4: H2O2= 3:1）处理玻片，超纯水超声清洗三次，每次10分钟，后用氮气吹干。玻片放入丙酮中超声处理830分钟，氮气吹干后在120℃烘箱中烘4小时，冷却至室温备用。于暗室中将光刻胶以3500 r/min，20 s的参数均匀涂覆在上述清洗干净的玻片上，然后置入150℃烘箱烘30分钟。用光刻机进行光刻，选择掩膜版上微米宽度分布为10µm-100 µm，长度为5000µm的条纹作为模板，在掩膜版下被紫外光照射到的部分在有机溶剂中的溶解度会增加。曝光完毕的玻片放入显影液中35 s，再放入超纯水中进行定影。定影后的玻片用氮气吹干，放入120℃烘箱中烘30分钟。玻片冷却至室温后，放入离子溅射仪中以8mA，100 s喷金处理。喷金完毕的玻片置入丙酮超声处理3次，每次10分钟。氮气吹干后静置存放。
实施例 29，玻璃表面金微米图案观察
使用光学显微镜，物镜放大倍数为10X，目镜为40X，在相差模式下对玻璃表面的金微米图案进行观察，可以验证金图案形状是否完整。
实施例30，嵌段共聚物胶束溶液的配制
选择分子量为115500，苯乙烯与2-乙烯基吡啶单元数比值为759:347的P4633-S2VP聚合物，按4.0mg/ml的浓度溶解于甲苯配制10 mL胶束溶液，避光搅拌24 h；计算当载金量为0.40时，所需的金前驱体氯金酸的量，称取并加入到聚合物溶液中，称量好的溶液用铝箔小心包裹两层于室温下避光搅拌24 h。
实施例31，嵌段共聚物胶束溶液的配制
选择分子量为44300，苯乙烯与2-乙烯基吡啶单元数比值为320:105的P18225-S2VP聚合物，按7.1mg/ml的浓度溶解于甲苯配制10 mL胶束溶液，避光搅拌24 h；计算当载金量为0.61时，所需的金前驱体氯金酸的量，称取并加入到聚合物溶液中，称量好的溶液用铝箔小心包裹两层于室温下避光搅拌24 h。
实施例32，嵌段共聚物胶束溶液的配制
选择分子量为217000，苯乙烯与2-乙烯基吡啶单元数比值为1776:304的P5052-S2VP聚合物，按3 mg/ml的浓度溶解于甲苯配制10 mL胶束溶液，避光搅拌24 h；计算当载金量为0.44时，所需的金前驱体氯金酸的量，称取并加入到聚合物溶液中，称量好的溶液用铝箔小心包裹两层于室温下避光搅拌24 h。
实施例33，嵌段共聚物胶束溶液的配制
选择分子量为257000，苯乙烯与2-乙烯基吡啶单元数比值为1728:732的P4556-S2VP聚合物，按3 mg/ml的浓度溶解于甲苯配制10 mL胶束溶液，避光搅拌24 h；计算当载金量为0.35时，所需的金前驱体氯金酸的量，称取并加入到聚合物溶液中，称量好的溶液用铝箔小心包裹两层于室温下避光搅拌24 h。
实施例 34，按照实施例30-33给出的基本步骤，用不同分子量PS-b-P2VP嵌段共聚物和氯金酸（HAuCl4·3H2O）配制负载氯金酸的聚合物胶束溶液，配制参数列于下表3：
表3
。
实施例35，胶束溶液形貌表征
实施例30-33得到的负载氯金酸胶束溶液分散均匀性通过透射电子显微镜（TEM）进行表征。用玻璃滴管蘸取少量溶液，滴在透射电镜观察铜网上，于室温下挥发完全。透射电镜观察时，加速电压设置为200 kV, 放大倍数设定为2.5万以及5万时，可以观察到胶束溶液中氯金酸的负载情况与胶束的分布情况。
实施例36，玻璃表面纳米图案阵列的制备
用食人鱼洗液处理预进行浸渍提拉操作的玻片，浸泡于超纯水中。将实施例30得到的胶束溶液转移入10 mL玻璃小烧杯中。玻片粘于提拉机样品杆上，设置提拉速度为420 µm/s，镀膜完毕的玻片在阴暗避光处静置24 h以上，待甲苯挥发完毕后用低温等离子机处理。设置等离子体处理参数：功率100 W，一路氧气流量100 cm3/s，清洗次数4次，最低真空度8Pa，处理时间1 h。处理完毕的玻片于干燥处避光保存。
实施例37，玻璃表面纳米图案阵列的制备
用食人鱼洗液处理预进行浸渍提拉操作的玻片，浸泡于超纯水中。将实施例31得到的胶束溶液转移入10 mL玻璃小烧杯中。玻片粘于提拉机样品杆上，设置提拉速度为210µm/s，镀膜完毕的玻片在阴暗避光处静置24 h以上，待甲苯挥发完毕后用低温等离子机处理。设置等离子体处理参数：功率100 W，一路氧气流量100 cm3/s，清洗次数4次，最低真空度8Pa，处理时间1 h。处理完毕的玻片于干燥处避光保存。
实施例38，玻璃表面纳米图案阵列的制备
用食人鱼洗液处理预进行浸渍提拉操作的玻片，浸泡于超纯水中。将实施例32得到的胶束溶液转移入10 mL玻璃小烧杯中。玻片粘于提拉机样品杆上，设置提拉速度为210µm/s，镀膜完毕的玻片在阴暗避光处静置24 h以上，待甲苯挥发完毕后用低温等离子机处理。设置等离子体处理参数：功率100 W，一路氧气流量100 cm3/s，清洗次数4次，最低真空度8Pa，处理时间1 h。处理完毕的玻片于干燥处避光保存。
实施例39 ，玻璃表面纳米图案阵列的制备
用食人鱼洗液处理预进行浸渍提拉操作的玻片，浸泡于超纯水中。将实施例33得到的胶束溶液转移入10 mL玻璃小烧杯中。玻片粘于提拉机样品杆上，设置提拉速度为210µm/s，镀膜完毕的玻片在阴暗避光处静置24 h以上，待甲苯挥发完毕后用低温等离子机处理。设置等离子体处理参数：功率100 W，一路氧气流量100 cm3/s，清洗次数4次，最低真空度8Pa，处理时间1 h。处理完毕的玻片于干燥处避光保存。
实施例40，玻片表面纳米金点阵列的表征
采用原子力显微镜（AFM）和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）两种表征方式对实施例36-39的得到的纳米图案化玻片进行了表征。AFM表征参数如下：空气环境下操作，探针设置为轻敲模式（Softtapping），探针型号RTESP，扫描范围500 nm´500 nm和800 nm´800 nm，其余参数为默认。SEM表征参数为加速电压1.5 kV，探头使用二次电子探头（SE），光阑孔径设置为30µm，工作距离从3.5 mm左右开始调整，放大倍数范围20k-80 k。不同共聚物模板得到的图案纳米间距不同，实施例36-38的扫描电镜拍摄结果如图2；实施例36所得到的图案模板AFM表征结果如图3，可由高度图像得出每个纳米金点的尺寸在10 nm以下。
实施例41，实施例40扫描电镜所表征得到实施例36-39中纳米图案化玻片上纳米间距列于表4：
表4
。
实施例42，玻璃表面微纳米杂合图案阵列的制备
将实施例41得到的具有不同纳米间距的纳米玻片用低温等离子体处理15分钟，清洁玻片表面；将玻片放置于丙酮中，超声清洗三次，每次十分钟，后用氮气吹干，将玻片置于120℃烘箱中过夜。取出玻片，降至室温，在暗室中以以3500 r/min，20 s的参数将光刻胶均匀涂覆在上述玻片表面，放入100℃烘箱中20分钟进行烘干。用光刻机进行光刻，选择掩膜版上尺寸为35µm和65µm的方形微米岛作为模板，在掩膜版下被紫外光照射到的部分在有机溶剂中的溶解度会增加。曝光完毕的玻片放入显影液中60 s，再依次放入两杯干净超纯水中进行60 s定影，定影后的玻片用氮气吹干，放入120℃烘箱中烘30分钟。
称取7.4 g的NH4F溶解于385mL的水中，充分搅拌溶解后加入9 mL浓度为 40%的HF溶液，搅拌10分钟，配置成浓度为0.5 M的HF/NH4F缓冲溶液。将上述处理好的玻片置于配置好的缓冲溶液中进行刻蚀，每10秒取出用水充分清洗，水分除尽后重新放入缓冲液中，相同操作循环至反应时间充分。刻蚀完的玻片，放入大量Milli-Q中进行清洗，再用Milli-Q超声清洗三次，每次十分钟，后用氮气吹干。将玻片用丙酮超声清洗3次，每次3分钟，进行脱胶，再用超纯水超声10分钟后用氮气吹干保存。
实施例43，玻片图案预处理
玻片上的金图案需要利用偶联剂进行修饰后转移水凝胶表面。聚乙二醇及其衍生物水凝胶交联体系可选择的偶联剂结构示意如下：
①HS-PEG-SH与大单体分子链形成物理缠结作用参与到水凝胶聚合过程；
②ACRL-PEG-SH通过与大单体发生化学反应和物理缠结参与到水凝胶聚合；
③烯丙基硫醇通过与大单体发生化学反应参与到水凝胶聚合；
④双键封端的胱胺类分子通过与大单体发生化学反应作用参与到水凝胶聚合
实施例44，玻片表面微米图案预处理
实施例27得到的微米圆岛图案玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM 双官能团小分子Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例45，玻片表面微米图案预处理
实施例28得到的微米条纹图案玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM 双官能团小分子Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例46，玻片表面微米图案预处理
实施例28得到的微米条纹图案玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下5 mM 双官能团小分子Linker（实施例40③烯丙基硫醇）的无水乙醇溶液中，处理1.0 h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例47，玻片纳米图案预处理
实施例36得到的纳米图案化玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM 双官能团小分子Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例48，玻片纳米图案预处理
实施例37得到的纳米图案化玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM双官能团小分子 Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例49，玻片纳米图案预处理
实施例38得到的纳米图案化玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM双官能团小分子 Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例50，玻片纳米图案预处理
实施例39得到的纳米图案化玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下2 mM双官能团小分子 Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例51，玻片微纳米杂合图案预处理
实施例42得到的微纳米杂合图案化玻片用低温等离子体处理15 min，于 120℃烘箱中加热处理0.5 h后，玻片浸没于无水乙醇中，保证金点被全部还原为金单质，0.5 h取出再度浸没于35℃下1.5 mM双官能团小分子 Linker（N,N-双丙烯酰基胱胺）的无水乙醇溶液中，处理1.5 h，紫外光聚合反应之前用高纯氮气吹干。
实施例52，表面微米图案化水凝胶制备
操作同实施例23，实施例1得到的MeHA大单体用Milli-Q配制为30wt%的浓度，在实施例44中通过修饰双丙烯酰基胱胺得到的含微米圆岛图案化玻片表面进行聚合，得到表面分布有微米圆岛图案的透明质酸HA水凝胶。
实施例53，表面微米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA DA大单体用Milli-Q配制为45 wt%的浓度，在实施例44中通过修饰双丙烯酰基胱胺得到的含微米圆岛图案化玻片表面进行聚合，得到表面分布有微米圆岛图案的水凝胶。
实施例54，表面微米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA DA大单体用Milli-Q配制为45 wt%的浓度，在实施例45中通过修饰双丙烯酰基胱胺得到的含微米条纹图案化玻片表面进行聚合，得到表面分布有微米条纹图案的水凝胶。
实施例55，表面微米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA DA大单体用Milli-Q配制为45 wt%的浓度，在实施例43中通过修饰双官能团烯丙基硫醇得到的含微米条纹图案化玻片表面进行聚合，得到表面分布有微米条纹图案的水凝胶。
实施例56，表面纳米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA大单体在实施例47得到的纳米间距为64 nm左右纳米图案化玻片表面进行聚合，得到表面纳米图案化的水凝胶。
实施例57，表面纳米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA大单体在实施例48得到的纳米间距为31 nm左右的纳米图案化玻片表面进行聚合，得到表面纳米图案化的水凝胶。
实施例58，表面纳米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA大单体在实施例49得到的纳米间距为90 nm左右的纳米图案化玻片表面进行聚合，得到表面纳米图案化的水凝胶。
实施例59，表面纳米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例11得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA大单体在实施例50得到的纳米间距为130 nm左右的纳米图案化玻片表面进行聚合。得到表面纳米图案化的水凝胶。
实施例60，表面微纳米图案化水凝胶制备
操作同实施例13，实施例12得到的oligoLA-PEG2000-oligoLA大单体在实施例51得到的微纳米图案化玻片表面进行聚合。得到表面微纳米图案化的水凝胶。
实施例61，光学显微镜观察水凝胶表面微米图案
实施例52得到的表面分布有不同尺寸微米圆岛的MeHA水凝胶聚合完成后在Milli-Q中溶胀，待溶胀完全后，取出切割为小于载玻片尺寸的大小，倒置放于载玻片上，有图案一面朝下，用10 X物镜在相差模式下进行观察，可以通过改变观察视野确认所有的微米圆岛都成功转移到了水凝胶表面。
实施例62，光学显微镜观察水凝胶表面微米图案
实施例53得到的表面分布有不同尺寸微米圆岛的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶聚合完成后在Milli-Q中溶胀，待溶胀完全后，取出切割为小于载玻片尺寸的大小，倒置放于载玻片上，有图案一面朝下，用10 X物镜在相差模式下进行观察，可以通过改变观察视野确认所有的微米圆岛都成功转移到了水凝胶表面。
实施例63，光学显微镜观察水凝胶表面微米图案
实施例54得到的表面分布有不同宽度条纹的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶聚合完成后在Milli-Q中溶胀，待溶胀完全后，取出切割为小于载玻片尺寸的大小，倒置放于载玻片上，有图案一面朝下，用10 X物镜在相差模式下进行观察，可以通过改变观察视野确认所有宽度的微米条纹成功转移到了水凝胶表面。
实施例64，光学显微镜观察水凝胶表面微米图案
实施例55得到的表面分布有不同宽度条纹的oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶聚合完成后在Milli-Q中溶胀，待溶胀完全后，取出切割为小于载玻片尺寸的大小，倒置放于载玻片上，有图案一面朝下，用10 X物镜在相差模式下进行观察，可以通过改变观察视野确认所有宽度的微米条纹成功转移到了水凝胶表面。小分子烯丙基硫醇同样可以实现较大尺寸图案的完全转移。
实施例65，显微镜观察水凝胶表面微纳米图案
实施例60得到的表面分布有不同尺寸方形圆岛且圆岛内含有纳米图案阵列的水凝胶，该oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶聚合完成后在Milli-Q中溶胀，待溶胀完全后，取出切割为小于载玻片尺寸的大小，倒置放于载玻片上，有图案一面朝下，用10 X物镜在相差模式下进行观察，可以通过改变观察视野确认所有尺寸的方形微米岛成功转移到了水凝胶表面。
实施例66
为了观察纳米金点在水凝胶表面的分布情况，采用扫描电镜对脱水后的样品表面进行观察。在Milli-Q中溶胀实施例51得到的纳米图案化水凝胶，用Milli-Q进行置换三次，每次20 min，、配制体积比30%、50%、70%、90%、95%、100%的乙醇溶液，逐步替换水凝胶溶胀溶剂，每个梯度处理时间为0.5~1 h，100%的无水乙醇处理完毕后，将乙醇全部吸出，样品在室温下隔夜挥发。
实施例67
为了观察纳米金点在水凝胶表面的分布情况，采用扫描电镜对脱水后的样品表面进行观察。在Milli-Q中溶胀实施例52得到的纳米图案化水凝胶，用Milli-Q进行置换三次，每次20 min，、配制体积比30%、50%、70%、90%、95%、100%的乙醇溶液，逐步替换水凝胶溶胀溶剂，每个梯度处理时间为0.5~1 h， 100%的无水乙醇处理完毕后，将乙醇全部吸出，样品在室温下隔夜挥发。
实施例68
为了观察纳米金点在水凝胶表面微米岛内的分布情况，采用扫描电镜对脱水后的样品表面进行观察。在Milli-Q中溶胀实施例60得到的微纳米杂合图案水凝胶，用Milli-Q进行置换三次，每次20 min，、配制体积比30%、50%、70%、90%、95%、100%的乙醇溶液，逐步替换水凝胶溶胀溶剂，每个梯度处理时间为0.5~1 h， 100%的无水乙醇处理完毕后，将乙醇全部吸出，样品在室温下隔夜挥发。
实施例69，扫描电镜观察水凝胶表面纳米图案
实施例66得到的水凝胶底部用导电胶固定后，四周用导电胶与底部进行连接，提高样品的导电性。表征参数设置为：加速电压≤1kV，光阑孔径20 µm，探头选择二次电子SE或InLens（为了观察更突出的表面形貌），工作距离2.5 mm左右，根据电压和光阑孔径适当调节，结果如图4左。玻片上初始纳米间距为64 nm左右的纳米阵列图案成功转移到了水凝胶表面。
实施例70，扫描电镜观察水凝胶表面纳米图案
实施例67得到的水凝胶底部用导电胶固定后，四周用导电胶与底部进行连接，提高样品的导电性。表征参数设置为：加速电压≤1kV，光阑孔径20 µm，探头选择二次电子SE或InLens（为了观察更突出的表面形貌），工作距离2.5 mm左右，根据电压和光阑孔径适当调节。结果如图4右。玻片上初始纳米间距为30 nm左右的纳米阵列图案成功转移到了水凝胶表面。
实施例71，扫描电镜观察水凝胶表面微纳米图案
实施例60得到的水凝胶底部用导电胶固定后，四周用导电胶与底部进行连接，提高样品的导电性。表征参数设置为：加速电压≤1kV，光阑孔径20 µm，探头选择二次电子SE或InLens（为了观察更突出的表面形貌），工作距离2.5 mm左右，根据电压和光阑孔径适当调节。扫描电镜8k放大倍数下可以观察到微米岛边缘较锋利，氢氟酸刻蚀过程较为完全；同时在20k-80k的放大倍数下可以观察到微米圆岛内分布有不同纳米间距的纳米图案阵列，微/纳米杂合图案在oligoLA-PEG2000-oligoLA水凝胶表面成功构筑。
实施例72，不含图案水凝胶降解
实施例23得到固含量为30 wt%的MeHA水凝胶，在37℃，5 ´ 104U/mL噬菌体H4489A透明质酸酶进行降解, 取样时间点分别为0 d、1 d、4 d、7 d。每阶段降解样品取出后，用PBS缓冲液洗去酶液，辅以摇床加速置换后浸泡于PBS缓冲液。
上述步骤得到的不同降解阶段的水凝胶样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解进行而下降，体积溶胀比上升的结果，说明所得MeHA水凝胶样品在所选择的降解条件下能够降解。
实施例73，不含图案水凝胶降解
实施例13-15得到的不同固含量的oligoLA-PEG-oligoLA水凝胶，在37℃，2 mol/L盐酸条件下进行降解，氢离子浓度12 mol/L的盐酸与Milli-Q以体积比1:1混合后得到强酸水溶液，同时设置纯PBS溶液为弱降解条件。设定降解总时长12 h，降解取样时间点分别为0 h、2h、4 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h和12 h，其中0 h表示的是无外加酸条件下的降解点。每阶段降解样品取出后，用PBS缓冲液洗去酸液，辅以摇床加速置换，每次0.5 h，一共5次至溶液pH为7.4，后浸泡于PBS缓冲液。
上述步骤得到的不同降解阶段的水凝胶样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解进行而下降，体积溶胀比上升的结果，说明水凝胶样品能够降解，并且降解速率低固含量的水凝胶快于高固含量的水凝胶。
实施例74，不含图案水凝胶降解
实施例13得到45 wt%的oligoLA-PEG-oligoLA水凝胶，在37℃，PBS条件下进行降解，在0 天、4天、7天、14天取出样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解时间延长而下降，体积溶胀比上升的结果，说明水凝胶样品在仿生条件PBS缓冲液能够以较慢的速度降解。
实施例75，不含图案水凝胶降解
实施例16得到45 wt%的oligoTMC-PEG-oligoTMC水凝胶，在37℃，5 ´104U/mL脂肪酶条件下进行降解，在0 天、4天、7天、14天取出样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解时间延长而下降，体积溶胀比上升的结果，说明该种水凝胶样品在脂肪酶作用下能够以较慢的速度降解，水凝胶结构能够瓦解。
实施例76，不含图案水凝胶降解
实施例17得到45 wt%的oligoGA-PEG-oligoGA水凝胶，在37℃，2 mol/L盐酸条件下进行降解，氢离子浓度12 mol/L的盐酸与Milli-Q以体积比1:1混合后得到强酸水溶液，同时设置纯PBS溶液为弱降解条件。设定降解总时长12 h，降解取样时间点分别为0 h、2 h、4 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h和12 h，其中0 h表示的是无外加酸条件下的降解点。每阶段降解样品取出后，用PBS缓冲液洗去酸液，辅以摇床加速置换，每次0.5 h，一共5次至溶液pH为7.4，后浸泡于PBS缓冲液。
上述步骤得到的不同降解阶段的水凝胶样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解进行而下降，体积溶胀比上升的结果，且变化率高于同样固含量的oligoLA-PEG-oligoLA，该种水凝胶样品能够降解，并且降解速率快于含寡聚LA段的水凝胶。
实施例77，不含图案水凝胶降解
实施例18得到45 wt%的oligoCL-PEG-oligoCL水凝胶，在37℃，2 mol/L盐酸条件下进行降解，氢离子浓度12 mol/L的盐酸与Milli-Q以体积比1:1混合后得到强酸水溶液，同时设置纯PBS溶液为弱降解条件。设定降解总时长12 h，降解取样时间点分别为0 h、2 h、4 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h和12 h，其中0 h表示的是无外加酸条件下的降解点。每阶段降解样品取出后，用PBS缓冲液洗去酸液，辅以摇床加速置换，每次0.5 h，一共5次至溶液pH为7.4，后浸泡于PBS缓冲液。
上述步骤得到的不同降解阶段的水凝胶样品，同实施例24-26操作对模量、溶胀比进行测定，可以得到模量随降解进行而下降，体积溶胀比上升的结果，且变化率低于同样固含量的oligoLA-PEG-oligoLA，该种水凝胶样品能够降解，并且降解速率慢于含寡聚LA段的水凝胶。
实施例78
选取实施例73结果中45 wt%的oligoLA-PEG2000-oligoLA模量变化曲线中的3个时间点，于细胞培养条件（37℃，5% CO2，细胞培养基）下对水凝胶的降解性能（模量、溶胀比）进行测定，结果表明模量进一步的降低并且体积溶胀比也有变化，水凝胶在细胞培养条件下会再度进行降解，降解起点与环境不同可以得到不同的降解速率。
实施例79，微米图案进行胶原修饰
实施例52得到的微米图案化oliogLA-PEG-oligoLA水凝胶，于PBS溶胀后，夹出并小心拭去其表面和周边的水分。用Milli-Q配制1mg/mL的胶原对其微米图案化形貌进行修饰，用枪头向水凝胶表面小心滴加胶原水溶液，使水凝胶表面全部覆盖有溶液；放入4℃冰箱中隔夜处理12 h。接枝好的样品需及时用PBS进行清洗3次，每次0.5 h。得到的水凝胶表面分布有胶原修饰的微米圆岛，可以作为促进神经再生的支架应用于组织工程。
实施例80，接枝RGD多肽
实施例56得到的水凝胶，于PBS溶胀后，夹出并小心拭去其表面和周边的水分。其表面具有纳米尺度的图案化形貌，选择环状五肽c(RGDfK)-SH作为生物大分子细胞黏附相关配体对其图案化形貌进行修饰，配制25 µM RGD多肽溶液；用枪头向水凝胶表面滴加RGD多肽水溶液，使水凝胶表面全部覆盖有溶液；放入4℃冰箱中隔夜接8 h。接枝好的样品需及时用PBS进行清洗3次，每次0.5 h。
实施例81，接枝REDV多肽
实施例56得到的水凝胶，于PBS溶胀后，夹出并小心拭去其表面和周边的水分。其表面具有纳米尺度的图案化形貌，选择环状五肽c(RGDfK)-SH作为生物大分子细胞黏附相关配体对其图案化形貌进行修饰，配制25 µM REDV多肽溶液；用枪头向水凝胶表面滴加REDV多肽水溶液，使水凝胶表面全部覆盖有溶液；放入4℃冰箱中隔夜接8 h。接枝好的样品需及时用PBS进行清洗3次，每次0.5 h。
实施例82，观察纳米图案化水凝胶表面细胞黏附反差
从大鼠体内分离并培养的骨髓间充质干细胞（rMSC），将其接种在实施例80中得到的接枝有细胞黏附多肽RGD的olioLA-PEG-oligoLA水凝胶，于培养基中培养七天，在第一天和第七天时，取出样品并用组织固定液固定细胞，进行后续染色。细胞的细胞骨架F-actin（红）、黏着斑蛋白Vinculin（绿）、细胞核（蓝）进行免疫荧光染色后，显微镜拍摄的照片如图5，可以观察到有无纳米图案（图中虚线所分隔的区域）的水凝胶表面出现了显微镜下可视化的细胞黏附与否反差区域。细胞在水凝胶基底不同区域上的选择性粘附可以应用于干细胞培养。
实施例83，纳米图案化水凝胶应用于细胞识别与筛选
将内皮细胞与平滑肌细胞同时接种在实施例80-81中得到的接枝有REDV多肽和RGD多肽的olioLA-PEG-oligoLA水凝胶表面，于培养基中培养1天进行观察。修饰有REDV纳米阵列的水凝胶表面对内皮细胞有较好的选择性黏附。继续培养至7天，水凝胶基底的降解对上述的选择性并无显著影响。此种方法构建了内皮细胞选择性功能表面，可以应用于相关的细胞培养与筛选。

Claims (13)

1.一种具有图案化表面的可降解高分子材料，其特征在于，以可生物降解的水凝胶为基质，其表面修饰有由活性物质组成的图案；所谓图案化表面是指在基质材料表面通过修饰形成图案阵列。
2.根据权利要求1所述的具有图案化表面的可降解高分子材料，其特征在于，所述的可生物降解的水凝胶，为天然来源的胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、纤维蛋白或它们衍生物为基的水凝胶；或者
所述的可生物降解的水凝胶，为人工合成来源的聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷或聚甲基丙烯酸甲酯与少量的可降解聚酯、聚氨基酸、多肽、聚氨酯、聚酯酰胺、聚正交酯、聚酸酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚磷腈或聚磷酸酯通过共聚、交联、共混、形成互穿网络的方式相结合而成的水凝胶；或者
所述的可生物降解的水凝胶，为聚乙二醇与寡聚酯通过形成大单体的方式聚合交联而成的水凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的具有图案化表面的可降解高分子材料，其特征在于，所述的活性物质，选自下述物质的一种或几种：铂、金、钛、锆、钴、镍、银类金属，羟基磷灰石、骨水泥、生物玻璃类无机非金属，胶原、纤维素蛋白、纤连蛋白类生物大分子，特殊的活性多肽序列；或者
所述的活性物质，选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸的多肽序列。
4.根据权利要求3所述的具有图案化表面的可降解高分子材料，其特征在于，所述的图案化表面的形貌尺度为宏观尺度或微观尺度或二者结合，宏观尺度是指肉眼可观察的范围，为~cm量级；微观尺度指是微米尺度、纳米尺度，或者二者的结合。
5.根据权利要求1、2或4所述的具有图案化表面的可降解高分子材料，其特征在于，可通过水解、酶促水解、细菌分解、热分解、氧化降解单独或多者结合的方式降解；其降解速率通过调整降解组分的比率和降解触发物来调节。
6.如权利要求1-5之一所述的具有图案化表面的可降解高分子材料的制备方法，主要涉及图案转移，其特征在于，具体步骤如下：
（1）利用掩膜版辅助的光刻、嵌段共聚物胶束自组装或二者结合的方式在稳定基底表面构筑不同尺度的图案阵列，得到图案化模板；
（2）将经修饰的天然高分子或人工合成高分子与可降解物质共聚，获得含降解组分且可交联聚合的高分子大单体；
（3）对于含图案阵列的基底表面进行偶联剂修饰，使上述高分子大单体通过聚合反应与图案表面结合形成可降解高分子组成的水凝胶，从而将图案转移到可降解水凝胶的表面；
其中，所述图案基底表面进行偶联剂修饰，是指引入可以同时与表面图案以及高分子大单体发生相互作用的双官能团偶联剂，促进图案阵列转移。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的双官能团偶联剂，其一端官能团可以与基底表面的图案阵列形成共价键、离子键、金属键、配位键其中之一的稳定的键合，另一端官能团是烯烃双键、巯基、金属离子，作为单体组分参与到水凝胶交联网络聚合过程。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，可降解高分子大单体聚合成为水凝胶采用热交联、光交联或离子交联的方式。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的掩膜版辅助的光刻方式是在稳定基底构筑微米尺度图案化模板，微米尺度图案模板尺度为1 µm~5000 µm，通过含有不同尺寸图形阵列的光刻掩膜板来获得；
步骤（1）中所述的嵌段共聚物胶束自组装的方式是在稳定基底构筑纳米尺度的图案化阵列，纳米尺度图案模板的尺度为5-150 nm。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的嵌段共聚物胶束自组装方式在稳定基底上构筑纳米图案化阵列，是通过两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂中负载不同类型金属盐的前驱体来调节所得到纳米图案的尺寸、分布及组分；胶束阵列经等离子体处理以后，去除嵌段共聚物成分，将金属从前驱体中还原，得到金属阵列。
11.根据权利要求6、7或9所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的图案化模板是微米-纳米尺度杂合图案，先通过嵌段共聚物自组装法得到纳米尺度的图案阵列模板，再经过旋涂-光刻步骤将得到的纳米尺度图案阵列以微米尺度的图形阵列进行限定来获得的。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，通过使用活性物质进一步对水凝胶表面图案阵列进行修饰，在水凝胶表面构筑多种活性物质的图案阵列。
13.如权利要求1-5之一所述的可降解高分子材料，在生物识别及诊断，细胞培养，细菌和其它微生物的培养，细胞筛选，细菌和其它微生物的筛选，或者组织工程方面的应用。
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