CN108478555B - EPC和EPD用作miR-21激活剂和骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了EPC和EPD用作miR‑21激活剂和骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。本发明发现，Euphorangin C(EPC)和Euphorangin D(EPD)可以显著提高骨髓间充质干细胞中miR‑21的表达，进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化，可以制备成miR‑21激活剂和骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂。提高miR‑21表达或促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂可以含有上述化合物或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

Description

EPC和EPD用作miR-21激活剂和骨髓间充质干细胞成骨分化促 进剂的用途
技术领域
本发明属于生物领域，涉及miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂。
背景技术
骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间充质干细胞(MSCs)，因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此有的文献也把MSCs称做贴壁细胞或者成纤维细胞集落形成单位。由于它们来自骨髓的支持结构，并且可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(BMSCs)。鉴于BMSCs的以下特点而日益引起人们的兴趣：1、在不同的理化环境和细胞因子的诱导下，BMSCs具有可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞甚至神经元样细胞等多系分化潜能；2、BMSCs是造血支持细胞，作为滋养层支持造血干细胞的生长。由于具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞移植等领域应用前景十分广阔。
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加和易骨折为特征的全身代谢性骨病。糖皮质激素性骨质疏松症是继发性骨质疏松症的主要类型，其预防和治疗是骨科领域亟待解决的严重问题。骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降与骨质疏松症发生密切相关。有研究表明，miR-21与骨髓间充质干细胞成骨分化相关，miR-21的高表达会促进骨髓间充质干细胞成骨分化(参考文献：miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究，牙体牙髓牙周病学杂志，2015年25卷8期)。
二萜类化合物根据化学结构母核的差异分为西松烷型二萜、松香烷型二萜、阿替斯烷型二萜、贝壳杉烷型二萜等。不同类型的二萜、相同类型不同化学结构的二萜由于化学结构中母核、取代基的差异，药理活性多种多样，成为药物开发的宝贵资源库。
发明内容
本发明目的在于提供miR-21激活剂，该miR-21激活剂可以作为促进骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂，用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化，进而缓解或治疗骨质疏松症。
上述目的通过如下技术方案实现：
泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素均为二萜化合物，但是母核和取代基不同，其化学信息如下表所示。
泽漆内酯A和B用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
泽漆内酯A或B用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有泽漆内酯A或B，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
泽漆内酯A或B用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有泽漆内酯A或B，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
Euphorangin C和D用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
Euphorangin C或D用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有Euphorangin C或D，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
Euphorangin C或D用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有Euphorangin C或D，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
岩大戟内酯A用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
岩大戟内酯A用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有岩大戟内酯A，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
岩大戟内酯A用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有岩大戟内酯A，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
月腺大戟甲素用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
月腺大戟甲素用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有月腺大戟甲素，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
月腺大戟甲素用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有月腺大戟甲素，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
月腺大戟乙素用作miR-21激活剂及骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂
月腺大戟乙素用于制备miR-21激活剂的用途。
一种提高miR-21表达的药物制剂，含有月腺大戟乙素，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。
月腺大戟乙素用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有月腺大戟乙素，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素可以显著促进骨髓间充质干细胞中miR-21的表达，进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。
附图说明
图1为泽漆内酯A和B对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响；
图2为Euphorangin C和D对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响；
图3为岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响；
图4为岩大戟内酯A对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响；
图5为月腺大戟甲素对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响；
图6为月腺大戟乙素对骨髓间充质干细胞成骨分化和miR-21相对表达量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。
一、实验材料
泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素购买或自制，纯度均在95％以上。SPF级SD大鼠，雌雄不拘，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
DMEM/F12、胎牛血清购自Hyclone公司。SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基、茜素红染液购于赛业(广州)生物科技有限公司。PrimeScrip RT Master Mix(反转录试剂盒)、SYBR Premix Ex Taq(荧光定量PCR试剂盒)均购自大连宝生物公司。
β-actin、miR-21引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下所示。
二、实验方法
1、大鼠BMSCs的分离与培养
脊椎脱臼法处死SD大鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剔除附着在其上的肌肉、韧带和关节软骨，剪去两侧的干骺端暴露骨髓腔，用10mL无菌注射器抽取含体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔。再将冲洗液转移到25cm2培养瓶中，置于37℃、体积分数为5％CO2的细胞培养箱内培养。48h后首次更换培养基，以后每隔1d更换培养基。细胞融合度达到80％时，用0.25％胰酶消化后按1:3的比例传代。按上述方法将细胞培养至第3代，以进行后续实验。
2、实验分组及处理方法
取培养至对数期的第3代BMSCs，调整细胞浓度为2×108/L，接种于6孔板内，每孔1mL细胞悬液，再加1mL完全培养基，细胞融合度达到约80％时，按如下方法分组、处理：
对照组：更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(正常培养基)，继续培养；
阳性组：更换SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基(诱导培养基)，继续培养；
给药组：在对照组基础上，分别加入低浓度(10μM)、高浓度(20μM)泽漆内酯A或B，或Euphorangin C或D，或岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B，或岩大戟内酯A，或月腺大戟甲素，或月腺大戟乙素，继续培养。
每3d换液1次，继续培养11d。
3、茜红素染色检测成骨分化率
弃去培养基，用4℃预冷PBS洗3遍，40g/L多聚甲醛在室温下固定15min，弃去多聚甲醛，PBS洗3遍，茜素红染色15min，弃去染液，双蒸水洗2遍，最后在显微镜下观察，计算相对钙结节面积(％)作为骨髓间充质干细胞成骨分化指标。
4、RT-qPCR法检测miR-21的相对表达量
细胞按实验分组处理后加入Trizol提取细胞总RNA，测定浓度后，用PrimeScripRT Master Mix(反转录试剂盒)，按照500ng/10μl的体系反转录成50μl的cDNA，用SYBRPremix Ex Taq(荧光定量PCR试剂盒)以20μl体系在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测miR-21相对表达量。用β-actin基因表达水平作为内参，计算miR-21/β-actin基因的比值代表miR-21的相对表达水平，基因表达相对定量计算采用仪器自带软件。
5、统计学分析
数据处理采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，组间比较用LSD法，结果以均数±标准差表示，P＜0.05认为有统计学差异。
三、实验结果
1、泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
与对照组相比，阳性组骨髓间充质干细胞的成骨分化率显著升高(P＜0.05)；与对照组相比，各给药组骨髓间充质干细胞的成骨分化率显著升高(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。
结果如表1和图1-6所示。
表1各组骨髓间充质干细胞成骨分化比较(n＝3)
组别 钙结节面积(％) 组别 钙结节面积(％)
对照组 4.58±1.74 岩大戟内酯B-高浓度 34.69±3.99
阳性组 17.21±3.52 17-羟基岩大戟内酯B-低浓度 24.08±3.28
泽漆内酯A-低浓度 22.38±3.04 17-羟基岩大戟内酯B-高浓度 35.80±4.09
泽漆内酯A-高浓度 34.65±3.57 17-乙酰基岩大戟内酯B-低浓度 25.25±3.14
泽漆内酯B-低浓度 21.90±3.42 17-乙酰基岩大戟内酯B-高浓度 37.13±3.53
泽漆内酯B-高浓度 33.41±3.95 岩大戟内酯A-低浓度 28.13±3.61
EuphoranginC-低浓度 25.35±4.03 岩大戟内酯A-高浓度 41.04±4.38
EuphoranginC-高浓度 37.05±3.86 月腺大戟甲素-低浓度 30.05±3.77
EuphoranginD-低浓度 27.12±3.75 月腺大戟甲素-高浓度 43.29±3.90
EuphoranginD-高浓度 39.42±4.14 月腺大戟乙素-低浓度 27.12±3.08
岩大戟内酯B-低浓度 23.34±3.62 月腺大戟乙素-高浓度 40.24±4.29
2、泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素对骨髓间充质干细胞中miR-21相对表达量的影响
与对照组相比，阳性组骨髓间充质干细胞中miR-21相对表达量显著升高(P＜0.05)；与对照组相比，各给药组骨髓间充质干细胞中miR-21相对表达量显著升高(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。结果如表2和图1-6所示。
表2各组骨髓间充质干细胞成骨分化率(n＝3)
组别 相对表达量 组别 相对表达量
对照组 1.00±0.09 岩大戟内酯B-高浓度 4.29±0.35
阳性组 2.84±0.25 17-羟基岩大戟内酯B-低浓度 3.22±0.30
泽漆内酯A-低浓度 3.14±0.31 17-羟基岩大戟内酯B-高浓度 4.37±0.29
泽漆内酯A-高浓度 4.35±0.38 17-乙酰基岩大戟内酯B-低浓度 3.17±0.27
泽漆内酯B-低浓度 3.21±0.29 17-乙酰基岩大戟内酯B-高浓度 4.41±0.34
泽漆内酯B-高浓度 4.32±0.35 岩大戟内酯A-低浓度 3.73±0.25
EuphoranginC-低浓度 3.19±0.31 岩大戟内酯A-高浓度 4.89±0.28
EuphoranginC-高浓度 4.28±0.36 月腺大戟甲素-低浓度 3.65±0.34
EuphoranginD-低浓度 3.43±0.28 月腺大戟甲素-高浓度 4.96±0.37
EuphoranginD-高浓度 4.49±0.29 月腺大戟乙素-低浓度 3.78±0.29
岩大戟内酯B-低浓度 3.05±0.32 月腺大戟乙素-高浓度 4.99±0.32
上述结果表明，泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素可以显著提高骨髓间充质干细胞中miR-21的表达，进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。泽漆内酯A和B、Euphorangin C和D、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B和17-乙酰基岩大戟内酯B、岩大戟内酯A、月腺大戟甲素、月腺大戟乙素可以制备成miR-21激活剂和骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂。激活miR-21表达或促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂可以含有泽漆内酯A或B，或Euphorangin C或D，或岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯B或17-乙酰基岩大戟内酯B，或岩大戟内酯A，或月腺大戟甲素，或月腺大戟乙素，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等；所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (1)

1.Euphorangin C或Euphorangin D用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的用途。
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