CN108474031A - Rna酶h用于选择性扩增病毒dna的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸,并通过RNA酶H和具有反转录活性的聚合酶而具有存在于所述样品中的RNA核酸的共扩增的减少或消除。
Description
发明领域
本发明属于体外诊断的领域。在该领域内,具体地涉及可能存在于样品中的DNA靶核酸的特异性扩增,并减少或消除存在于所述样品中的RNA核酸的共扩增。
发明背景
在分子诊断领域中,从众多来源扩增核酸具有相当大的重要性。核酸扩增和检测的诊断应用的例子是检测病毒诸如人***瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV),或者针对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)的存在对献血的常规筛查。此外,所述扩增技术适用于细菌细菌诸如分枝杆菌属,或肿瘤标志物的分析。
最突出的且广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应尤其包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增。
用于基于PCR的分析的自动化***经常利用在同一个反应容器中对PCR过程中的产物扩增的实时检测。这样的方法的关键是使用携带报告基团或标记的经修饰的寡核苷酸。
已经证实,在同一个容器中对超过一种靶核酸的扩增和检测是可能的。该方法通常被称作“多路”扩增,并且如果执行实时检测,那么需要不同的标记进行区别。
在临床核酸诊断领域中最合乎需要的或甚至强制性的是,为了定性(性能控制)和/或定量(使用所述对照作为参考,确定靶核酸的量)目的,使用具有已知序列的对照核酸控制各个扩增。鉴于特别是诊断靶标(包含原核、真核以及病毒核酸)的多样性,且鉴于不同类型的核酸(诸如RNA和DNA)之间的多样性,经常以特异性的方式设计对照核酸。简而言之,这些对照经常类似于它们可以充当其对照的靶核酸,以便在所述过程中模仿它们的性能。该情况适用于定性和定量测定。在要在单个或平行实验中检测多个参数的情况下,经常采用类似于不同靶核酸的不同对照,例如在Swanson等人(J. Clin. Microbiol., (2004),42, 第1863-1868页)中。Stöcher等人(J. Virol. Meth. (2003), 108, 第1-8页)公开了对照核酸,其中将多种病毒特异性的竞争性对照包含在相同DNA分子上。
本发明提供了使用表现出多个优点的不同方案的受控扩增方法。
发明概述
在一个方面,本发明涉及一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸的方法,所述方法包括下述步骤:使所述来自样品的DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶接触,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的寡核苷酸引物;在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间;和在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间。在某些实施方案中,所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。在某些实施方案中,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自选自CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶、栖热菌属种(Thermus sp.)sps17 DNA聚合酶、栖热菌属种Z05 DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶、非洲栖热腔菌(Termosipho africanus)DNA聚合酶和Thermus caldophilus DNA聚合酶的聚合酶。在某些实施方案中,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自栖热菌属种Z05 DNA聚合酶。在某些实施方案中,所述方法还包括扩增可能存在于所述样品中的RNA靶核酸。在某些实施方案中,所述DNA靶核酸源自乙型肝炎病毒(HBV)。在某些实施方案中,所述样品是流体样品。在某些实施方案中,所述扩增试剂还包含以下任一种:适合用于执行扩增反应的包含盐的缓冲溶液、单核苷酸诸如核苷三磷酸、寡核苷酸引物、寡核苷酸检测探针和/或染料。在一个实施方案中,所述方法是自动化的方法。
在另一个方面,本发明涉及一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸并确定其量的方法,所述方法包括下述步骤:在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述来自样品的DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶一起温育一段时间,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的寡核苷酸引物;在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述扩增试剂包含对所述DNA靶核酸特异性的所述寡核苷酸引物;和通过参考外部校准或通过执行内部定量标准品,确定所述DNA靶核酸的量。在某些实施方案中,所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。在某些实施方案中,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶选自:CS5DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海栖热袍菌DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、黄栖热菌DNA聚合酶、丝状栖热菌DNA聚合酶、栖热菌属种sps17 DNA聚合酶、栖热菌属种Z05 DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶、非洲栖热腔菌DNA聚合酶和Thermuscaldophilus DNA聚合酶。在某些实施方案中,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶来自栖热菌属种Z05 DNA聚合酶。在某些实施方案中,所述方法还包括扩增可能存在于所述样品中的RNA靶核酸。在某些实施方案中,所述DNA靶核酸是乙型肝炎病毒(HBV)。在某些实施方案中,所述样品是流体样品。在某些实施方案中,所述扩增试剂还包含以下任一种:适合用于执行扩增反应的包含盐的缓冲溶液、单核苷酸诸如核苷三磷酸、至少一种另外的寡核苷酸引物、至少一种寡核苷酸检测探针和/或染料。在一个实施方案中,所述方法是自动化的方法。
发明详述
在可能存在于生物样品中的DNA核酸的某些扩增反应中,可能发生RNA核酸的共扩增,由此造成所述DNA核酸的假阳性信号确定和/或所述DNA核酸的错误定量的风险。因此,在体外诊断应用中需要减少或消除存在于所述样品中的RNA核酸的共扩增以改善生物样品中的DNA靶核酸的定量和/或定性确定的准确度。
因此,本发明解决的问题在于,通过利用具有逆转录酶活性的聚合酶和将RNA酶H加入用于执行扩增反应的反应混合物中,减少或消除“不希望的”从DNA靶核酸衍生出的RNA核酸的共扩增(例如当仅希望扩增病毒DNA时,也存在于含有病毒DNA的样品中的病毒RNA的扩增)。在本文中,使所述反应混合物处于适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA模板的转录的条件,从而导致所述RNA模板的反转录和RNA-DNA杂交物的形成。并行地,存在于所述反应混合物中的RNA酶H会降解这样的RNA-DNA杂交物,使得这些杂交物不再作为扩增模板存在,且仅将扩增“纯的”DNA靶标。因而,极大地减少或完全地消除所述DNA靶核酸的假阳性信号确定和/或所述DNA靶核酸的错误定量的风险。
在一个方面,提供了一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸的方法,所述方法包括下述步骤:使所述来自样品的DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶接触,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的独特寡核苷酸引物;在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间;和在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间。
在另一个方面,提供了一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸并确定其量的方法,所述方法包括以下步骤:在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述来自样品的DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶一起温育一段时间,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的独特寡核苷酸引物;在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述扩增试剂包含对所述DNA靶核酸特异性的所述独特寡核苷酸引物;和通过参考外部校准或通过执行内部定量标准品,确定所述DNA靶核酸的量。
在另一个方面,提供了一种用于分离和扩增可能存在于样品中的至少一种靶核酸的方法,所述方法包括下述步骤:在允许包含所述靶核酸的核酸固定化在所述固体支持材料上的合适条件下在反应容器中将固体支持材料和所述样品组合在一起一段时间;将所述固体支持材料与存在于所述样品中的其它材料分离;纯化与所述固体支持材料结合的核酸和将所述固体支持材料用洗涤缓冲液洗涤1次或多次;在反应容器中使纯化的靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶接触以形成反应混合物,所述扩增试剂包含针对所述靶核酸的至少一组独特寡核苷酸引物;在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下将所述反应混合物在所述反应容器中温育一段时间;在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下将所述反应混合物在所述反应容器中温育一段时间;检测和测量由所述靶核酸的扩增产物产生的信号,所述信号指示所述靶核酸在所述样品中的存在或不存在。在某些方面,所述方法可以是自动化的方法。在本文中,在某些方面,在分离站中执行所述分离步骤。
在另一个方面,提供了一种用于分离和扩增可能存在于样品中的至少一种靶核酸的方法,所述方法包括下述步骤:将内部对照核酸加入所述样品中;在允许包含所述靶核酸和所述内部对照核酸的核酸固定化在所述固体支持材料上的合适条件下在反应容器中将固体支持材料和所述样品组合在一起一段时间;将所述固体支持材料与存在于所述样品中的其它材料分离;纯化与所述固体支持材料结合的核酸和将所述固体支持材料用洗涤缓冲液洗涤1次或多次;在反应容器中使所述纯化的靶核酸和所述纯化的内部对照核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶接触以形成反应混合物,所述扩增试剂包含针对所述靶核酸的至少一组独特寡核苷酸引物和针对所述反应容器中的所述内部对照核酸的一组寡核苷酸引物;在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下将所述反应混合物在所述反应容器中温育一段时间;在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下将所述反应混合物在所述反应容器中温育一段时间;检测和测量由所述靶核酸的扩增产物产生且与所述靶核酸的浓度成比例的信号,和检测和测量由所述内部对照核酸产生的信号。在某些方面,所述方法还可以包括通过将所述靶核酸的扩增产物的测量信号与所述内部对照核酸的测量信号进行参照,确定所述靶核酸的量。在某些方面,所述方法可以是自动化的方法。在本文中,在某些方面,在分离站中执行所述分离步骤。
在另一个方面,提供了一种用于分离和同时扩增可能存在于一个或多个样品中的至少第一和第二靶核酸的方法,所述方法包括以下自动化步骤:
a. 将内部对照核酸加入所述样品中的每一个中;
b. 在允许包含所述靶核酸和所述内部对照核酸的核酸固定化在所述固体支持材料上的合适条件下在一个或多个容器中将固体支持材料和所述一个或多个样品组合在一起一段时间;
c. 在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述样品中的其它材料分离;
d. 在所述分离站中纯化所述核酸和将所述固体支持材料用洗涤缓冲液洗涤1次或多次;
e. 在至少两个反应容器中使所述纯化的靶核酸和所述纯化的内部对照核酸与扩增试剂接触,所述扩增试剂包含RNA酶H、具有逆转录酶活性的聚合酶以及针对所述靶核酸中的每一种和针对所述内部对照核酸的至少一个独特寡核苷酸引物集合,其中至少第一反应容器包含至少所述第一靶核酸,且至少第二反应容器包含至少所述第二靶核酸,且其中所述第二靶核酸在所述第一反应容器中不存在;
f. 在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在所述反应容器中将所述纯化的靶核酸和所述纯化的内部对照核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间;
g. 在适合发生指示所述靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述纯化的靶核酸和所述纯化的内部对照核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间;
h. 检测和测量由所述靶核酸的扩增产物产生且与所述靶核酸的浓度成比例的信号,和检测和测量由所述内部对照核酸产生的信号,
其中在步骤d.至h. 中的扩增和检测的条件对于所述至少第一和第二纯化的靶核酸和所述内部对照核酸而言是相同的,且其中所述内部对照核酸的序列对于所述至少第一和第二纯化的靶核酸而言是相同的。
在以上方法的某些方面,所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。在某些方面,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自选自CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海栖热袍菌DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、黄栖热菌DNA聚合酶、丝状栖热菌DNA聚合酶、栖热菌属种sps17 DNA聚合酶、栖热菌属种Z05 DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶、非洲栖热腔菌DNA聚合酶和Thermus caldophilus DNA聚合酶的聚合酶。在某些方面,所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自栖热菌属种Z05 DNA聚合酶。在某些方面,所述方法还包括扩增可能存在于所述样品中的RNA靶核酸。在某些方面,所述DNA靶核酸源自乙型肝炎病毒(HBV)。在某些方面,所述样品是流体样品。在某些方面,所述扩增试剂还包含以下任一种:适合用于执行扩增反应的包含盐的缓冲溶液、单核苷酸诸如核苷三磷酸、寡核苷酸引物、寡核苷酸检测探针和/或染料。在某些方面,所述方法是自动化的方法。
本发明进一步允许开发在多个参数和/或核酸类型上的同时测定,同时为所述不同参数和/或核酸类型使用相同内部对照核酸序列。因此,它促成在多种水平上降低相应实验的总体复杂性:例如,必须设计仅一种内部对照核酸序列并且添加至各种扩增混合物,由此节省用于设计和合成或购买多种对照核酸序列的时间和成本。可以将测定流线化(streamline),并且降低操作错误的风险。另外,在相同条件下同时实施的一个测定或平行测定中采用的不同对照核酸序列越多,调节各种条件可能产生的结果越复杂。此外,凭借适合用于多种核酸的单一对照,可以将所述对照从单一来源分配进例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本发明的范围内,单一对照核酸序列也可以充当定性对照和定量对照。
作为上述方法的另一个优点,在可能的后续实验中针对其它核酸的特定生物样品的测试不需要涉及添加不同内部对照核酸的另一个样品制备操作,因为可以使用所用的对照来控制不同核酸的扩增。因此,一旦已经添加内部对照核酸,可以在相同条件下在相同样品中测试其它参数。
所述内部对照核酸可以是竞争性的、非竞争性的或部分地竞争性的。
竞争性内部对照核酸携带与靶标基本上相同的引物结合位点,并且由此与靶标竞争相同的引物。虽然此原理允许对各种靶核酸的良好模拟(由于它们的类似结构),但是它可以降低就一种或多种靶核酸而言的扩增效率,并且由此导致不太灵敏的测定。
非竞争性内部对照核酸具有不同于靶标的引物结合位点,并且因而结合不同的引物。这样的方案的优点尤其包括以下事实:反应混合物中不同核酸的单个扩增事件可以在没有任何竞争效应的情况下彼此独立地发生。因此,没有发生关于该测定的检测限度的不利影响,在竞争性方案中也是如此。
最后,在使用部分地竞争性的方案的扩增中,各种对照核酸和至少一种靶核酸竞争相同的引物,而至少一种其它靶核酸结合不同的引物。
以下事实使所述方法具有相当大的灵活性:上述方法涉及针对所述靶核酸中的每一种和针对所述内部对照核酸的独特引物集合。在该非竞争性方案中,没有必要将靶标特异性的结合位点引入对照核酸中(正如在竞争性方案的情况下),并且避免如上文提及的竞争性方案的缺点。在非竞争性方案中,内部对照核酸具有不同于任何靶序列的序列,从而不竞争它们的引物和/或探针。例如,内部对照核酸的序列可以不同于流体样品中的其它核酸序列。作为一个例子,如果流体样品源自人,那么所述内部对照核酸可以不具有也在人类中内源性地产生的序列。序列中的差异因而应当至少足够显著以不允许引物和/或探针在严谨条件下结合各自的一种或多种内源性核酸,并从而使所述方案具有竞争性。为了避免这样的干扰,使用的内部对照核酸的可以源自与流体样品的起源不同的来源。例如,它源自天然存在的基因组,例如植物基因组,或源自葡萄基因组。在一个实施方案中,源自天然存在的基因组的核酸是合成的(scrambled)。如本领域已知的,“合成的”是指在序列中以某种程度引入碱基突变。例如,使用的内部对照核酸的序列相对于衍生出它的天然存在的基因发生实质改变。
包括上文提及的自动化步骤的方法还展示出多种另外的优点:
在现有技术中已经存在的一项挑战是,在单个反应容器中实施的多路测定中的不同靶核酸的数目受限于适当标记的数目。在实时PCR测定中,例如,荧光染料波谱的潜在重叠对测定性能(假阳性结果的风险、较低的精确度,等等)具有重大影响。因此,各种荧光团必须经过仔细选择并且在光谱上较好地分离,以便确保诊断测试的期望性能。通常,不同的可用荧光团的数目对应于PCR仪荧光通道的单数位数目。
相反,在上述的方法中,在至少两个不同的反应容器中发生至少第一和第二靶核酸的内部受控扩增,从而允许较高数目的不同靶核酸的同时扩增,因为可以彼此独立地检测到在不同反应容器中的信号。还公开了这样的实施方案,其中在多个反应容器的一个或多个中实施多路反应,由此使可以同时且在相同条件下扩增的靶标的数目倍增。在这样的实施方案中,内部对照核酸充当一个容器内的不同靶核酸以及不同容器内的不同靶核酸的对照。
因而,本发明的一个方面涉及上述的方法,其中在相同反应容器中扩增至少两种靶核酸。
例如,可能优选的是,在第一反应容器中扩增第一靶核酸,但是不扩增第二靶核酸,且在第二反应容器中仅扩增第二靶核酸,但是不扩增第一靶核酸,例如取决于样品和/或一种或多种目标靶核酸。
因此,还公开了上述的方法,其中所述第一靶核酸不存在于所述第二反应容器中。
特别地,如果怀疑流体样品含有来自不同生物体的靶核酸或者甚至不同生物体本身,或者如果不清楚哪些不同的核酸或生物体可能存在于所述样品中,那么本发明的一个有利的实施方案是上述的方法,其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸来自不同生物体。
本发明的另一个方面是上述的方法,其中所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸是非病毒核酸。
并且,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸是细菌核酸。
如前所述,上述的方法可用于定性地或定量地控制至少第一和第二靶核酸的扩增。
生物样品中核酸的定性检测对于例如识别个体的感染而言是至关重要的。由此,用于检测微生物感染的测定的一个重要的要求是避免假阴性或假阳性结果,因为这样的结果几乎不可避免地导致就各个患者的治疗而言的严重后果。因而,特别是在基于PCR的方法中,将定性内部对照核酸加入检测混合物中。所述对照对于证实测试结果的有效性而言是特别重要的:至少在就各种靶核酸而言阴性结果的情况下,定性内部对照反应在给定的背景内必须表现为反应性的,即必须检测到定性内部对照,否则认为该测试本身是无效的。但是,在定性方案中,在阳性结果的情况下不一定必须检测到所述定性内部对照。对于定性测试,特别重要的是,保证反应的灵敏度,并且因此对其严格控制。因此,定性内部对照的浓度必须是相对低的,使得即使在例如稍微抑制的情况下,没有检测到定性内部对照,并且因此该测试是无效的。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述内部对照核酸的扩增产物的存在指示,即使在没有一种或多种所述靶核酸的扩增产物存在下在反应混合物中发生扩增。
另一方面,并且除了仅检测核酸在样品中的存在或不存在以外,确定所述核酸的量也经常是重要的。作为一个例子,基于病毒载量可以评估病毒性疾病的阶段和严重程度。此外,任何疗法的监测需要关于个体中存在的病原体的量的信息,以便评价所述疗法的成功。对于定量测定,引入充当参照的定量标准品核酸来确定靶核酸的绝对量是必要的。通过参考外部校准或通过执行内部定量标准品,可以实现定量。
在外部校准的情况下,使用已知量的相同的或可比较的核酸在分开的反应中创建标准曲线。随后,通过将用分析样品得到的结果与所述标准函数的对比,确定靶核酸的绝对量。但是,外部校准具有以下缺点:在对照中没有反映可能的提取操作、其变化的效力、以及抑制扩增和/或检测反应的试剂的可能且经常不可预测的存在。
该情况适用于任何样品相关的效应。因此,可能的情况是,由于不成功的提取操作或其它基于样品的因素,样品被判断为阴性,而要检测和定量的靶核酸实际上存在于该样品中。
由于这些和其它原因,向测试反应本身添加的内部对照核酸具有优点。在充当定量标准品时,所述内部对照核酸在定量测试中具有至少以下两项功能:
i)它监测反应的有效性。
ii)它在滴度计算中充当参照,由此补偿抑制效应,并且控制制备和扩增过程以允许更准确的定量。因此,不同于定性测试中的定性内部对照核酸(其必须仅在靶标阴性反应中是阳性的),定量测试中的定量对照核酸具有两项功能:反应控制和反应校准。因此,它在靶标阴性的和靶标阳性的反应中都必须是阳性的和有效的。
此外,它必须适合为高核酸浓度的计算提供可靠的参照值。因此,内部定量对照核酸的浓度需要是相对高的。
因此,在另一个方面,上述的方法还包括以下步骤:
i. 确定所述靶核酸中的一种或多种的量。
上述的内部受控的方法需要相当少的动手时间,并且比现有技术中使用的实时PCR方法简单得多地实施测试。该方法在例如临床病毒学领域中提供一项重大优点,因为它允许在平行实验中平行扩增数种病毒。该方法在需要频繁病毒监测的移植后患者的管理中是特别有用的。由此,所述方法促进有成本效益的诊断,并且促成抗病毒剂的使用和病毒性并发症以及住院治疗的减少。这同样适用于临床微生物学领域。一般而言,会在更快的出报告时间和改善的测试灵活性方面得到效率。因此,这导致为了做出诊断对患者要求的测试的数目的减少,和潜在地更短的住院期(例如如果可以更快地提供诊断,那么需要抗微生物疗法的患者将更快地接受它,并且因此更早地恢复)。另外,患者表现出更少的发病率,并且因此造成更少的与支持疗法有关的成本(例如,与脓毒症的诊断延迟有关的加强监护)。更快地提供阴性结果对于抗生素的开药过量可以具有重要的含义。例如,如果通过根据本发明的方法得到的测试结果能够比用标准实时PCR方法更快地排除病原体,那么就不会迫使临床医生经验性使用抗生素。可替换地,如果经验性使用抗生素,那么可以缩短各种治疗的持续时间。
关于设计基于根据本发明的方法的特定测试,熟练的技术人员会特别地但不仅仅受益于下列优点:
●软件复杂性的降低(导致降低的编程错误风险)
●将测定开发努力集中于化学优化,而非化学以及仪器控制参数
●远远更可靠的***,因为总是使用单一方法,并且可以最佳地设计硬件来执行该方案
●给执行上述的内部受控方法的熟练的技术人员提供灵活性以平行运行多个不同测定作为同一方法的部分
●成本降低。
在本发明的意义上,核酸的“纯化”、“分离”或“提取”涉及以下:在可以在诊断测定中分析核酸(例如通过扩增)以前,通常必须从含有不同组分的复杂混合物的生物样品中纯化、分离或提取它们。对于第一步,经常使用允许核酸富集的方法。为了释放细胞或病毒颗粒的内容物,可以将它们用酶或用化学物质处理以将细胞壁或病毒颗粒溶解、降解或变性。该过程通常被称作裂解。得到的含有这样的被裂解的物质的溶液被称作裂解物。在裂解过程中经常遇到的一个问题是,降解目标组分的其它酶(例如降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)在裂解操作过程中与目标组分发生接触。这些降解酶也可能存在于细胞外或在裂解之前可能已经在不同细胞隔室中在空间上分离。随着裂解发生,目标组分变得暴露于所述降解酶。在此过程中释放的其它组分可能例如是属于对细胞有毒的脂多糖家族的内毒素,并且可以对意图用在人或动物疗法中的产品造成问题。
有多种手段来处理上述问题。当意图释放核酸时,通常使用离液剂诸如硫氰酸胍或阴离子的、阳离子的、两性离子的或非离子的去污剂。使用快速地降解先前描述的酶或不希望的蛋白质的蛋白酶也是一个优点。但是,这可能产生另一个问题,因为所述物质或酶可以在随后步骤中干扰试剂或组分。
在上文提及的这样的裂解或样品制备方法中可以有利地使用的酶是这样的酶:其切割蛋白底物中的酰胺键,并且其被归类为蛋白酶或(可互换地)肽酶(参见Walsh, 1979,Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, 第3章)。在现有技术中使用的蛋白酶包含碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(US 5,386,024)。在现有技术中已经在核酸分离中广泛用于样品制备的蛋白酶是来自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白水解酶K (参见例如Sambrook J. 等人, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York, 1989),其在中性pH左右是有活性的,并且属于本领域技术人员称为枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶家族。对于在上文提及的裂解或样品制备方法中的应用特别有利的是酶esperase,即一种在高碱度和高温都保留其活性的稳健蛋白酶(EP 1 201753)。
在裂解步骤后的样品制备步骤中,进一步富集目标组分。如果目标非蛋白性组分是例如核酸,那么通常在将它们用在基于探针的测定中以前从复杂的裂解混合物中提取它们。
有几种用于纯化核酸的方法:
- 序列依赖性的或生物特异性的方法,如例如:
• 亲和色谱法
• 与固定化的探针杂交
- 不依赖于序列的或物理化学的方法,如例如:
• 用例如苯酚-氯仿的液-液萃取
• 用例如纯乙醇的沉淀
• 用滤纸的提取
• 用胶束形成剂如鲸蜡基-三甲基-溴化铵的提取
• 结合至固定化的嵌入染料,例如吖啶衍生物
• 吸附至硅胶或硅藻土(diatomic earth)
• 在离液序列高的条件下吸附至磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒。
对于纯化目的特别有趣是将核酸吸附至玻璃表面,尽管其它表面也是可能的。近年来已经提出了许多通过使用核酸对玻璃表面的结合行为来将核酸与其天然环境分离的操作。如果未修饰的核酸是靶标,那么将所述核酸直接结合至具有硅胶表面的材料可以是优选的,因为除了其它原因以外,不必修饰所述核酸,而且甚至可以结合天然核酸。这些方法被不同的文件详细地描述。例如,在Vogelstein B. 等人, Proc. Natl. Acad. USA 76(1979) 615-9中,提出了一种在有碘化钠存在下将来自琼脂糖凝胶的核酸结合至研磨过的火石玻璃的操作。在Marko M. A. 等人, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387中描述了在有高氯酸钠存在下在玻璃粉上从细菌纯化质粒DNA。在DE-A 37 34 442中,描述了在玻璃纤维过滤器上分离单链M13噬菌体DNA,其中使用乙酸沉淀噬菌体颗粒,并用高氯酸盐裂解噬菌体颗粒。将结合至玻璃纤维过滤器的核酸洗涤,并然后用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。在Jakobi R. 等人, Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201中描述了从λ噬菌体纯化DNA的类似操作。该操作需要在离液盐溶液中使核酸选择性地结合玻璃表面,并将所述核酸与污染物诸如琼脂糖、蛋白或细胞残余物分离。为了将玻璃颗粒与污染物分离,可以将所述颗粒离心或者将流体穿过玻璃纤维过滤器抽出。但是,这是一个限制步骤,其阻止该操作被用于处理大量样品。在通过添加盐和乙醇沉淀以后使用磁性颗粒来固定化核酸是更有利的,并且描述在例如Alderton R. P. 等人, S., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169和PCT GB 91/00212中。在该操作中,将所述核酸与磁性颗粒一起凝集。通过施加磁场并执行洗涤步骤,将凝集物与初始溶剂分离。在一个洗涤步骤以后,将所述核酸溶解在Tris缓冲液中。但是,该操作具有以下缺点:所述沉淀对于核酸而言不是选择性的。相反,也将多种固体和溶解的物质凝集。因此,不可以使用该操作除去大量的可能存在的特定酶反应的任何抑制剂。磁性多孔玻璃也是商购可得的,其含有在多孔特定玻璃基质中的磁性颗粒,并且用含有抗生蛋白链菌素的层覆盖。如果生物学材料例如蛋白或核酸在复杂的制备步骤中被修饰使得它们共价地结合生物素,那么可以使用此产品来分离所述生物学材料。可磁化的特定吸附剂被证实对于自动样品制备而言是非常有效的和合适的。为此目的,使用亚铁磁性的和铁磁性的以及超顺磁的颜料。在WO 01/37291中描述了磁性玻璃颗粒和使用它们的方法。对于在本发明的上下文中的核酸分离特别有用的是根据R. Boom等人(J Clin Microbiol.28 (1990), 495-503)的方法。
术语“固体支持材料”包含在上面关于核酸的固定化提及的固体材料中的任一种,例如磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维过滤器、滤纸等,尽管固体支持材料不限于这些材料。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述固体支持材料包含选自二氧化硅、金属、金属氧化物、塑料、聚合物和核酸的材料中的一种或多种。在本发明的一个实施方案中,所述固体支持材料是磁性玻璃颗粒。
在本发明的上下文中,“固定化”是指以可逆的或不可逆的方式捕获对象例如核酸。具体地,“固定化在固体支持材料上”是指,为了将其与任何周围介质分离的目的,使一个或多个对象与固体支持材料结合,并且可以回收,例如通过在以后的时点与固体支持材料分离。在该背景下,“固定化”可以例如包括将核酸吸附至玻璃或如上所述的固体材料的其它合适表面。此外,可以通过结合捕获探针而特异性地“固定化”核酸,其中核酸通过碱基配对而结合附着于固体支持物的、基本上互补的核酸。在后一种情况下,这样的特异性的固定化会导致靶核酸的优势结合。
在将核酸(包括靶核酸)从其天然环境纯化或分离以后,可以执行分析,例如经由上述的同时扩增。
“同时”在本发明的意义上是指,在同时且在相同物理条件下实施两个行为,诸如扩增第一和第二或更多核酸。在一个实施方案中,在一个容器中实施至少第一和第二靶核酸的同时扩增。在另一个实施方案中,在一个容器中用至少一种核酸并在第二容器中用至少第二核酸同时且在相同物理条件下(特别就温度和温育时间而言)实施同时扩增,其中上文提及的内部对照核酸存在于每个所述容器中。
所述“第一靶核酸”和所述“第二靶核酸”是不同的核酸。
“流体样品”是可以进行靶向核酸的诊断测定的任何流体材料,并且可以源自生物学来源。例如,所述流体样品源自人,并且是体液。在本发明的一个实施方案中,所述流体样品是人血液、尿、痰、汗液、拭子、可移液的粪便或脊髓液。
术语“反应容器”包含、但不限于,试管或平板(诸如微孔、深孔或其它类型的多孔板)的孔,在其中发生用于分析流体样品的反应例如反转录或聚合酶链式反应。这样的容器的外部界限或壁是化学惰性的,使得它们不会干扰在内部发生的分析反应。例如,如上所述的核酸的分离也在多孔板中实施。
在该背景下,分析***中的多孔板允许多个样品的平行分离和分析或贮存。可以为了最大液体摄取或为了最大热转移优化多孔板。为了在自动化分析仪中温育或分离分析物,可以优化用于本发明的上下文中的用途的多孔板。例如,将所述多孔板构建和排列成接触磁性装置和/或加热装置。
所述多孔板(其在本发明的上下文中可互换地称作“加工板”)包含:
-顶表面,其包含成行排列的在顶部有开口的多个容器。所述容器包含上部部分、中心部分和底部部分。所述上部部分与所述多孔板的顶表面连接,并且包含两个较长侧和两个较短侧。所述中心部分具有基本上矩形的横截面,其具有两个较长侧和两个较短侧;
-两个相向的较短的侧壁和两个相向的较长的侧壁,和
-基部,其中所述基部包含开口,所述开口被构建和排列为将所述多孔板放置成与所述磁性装置和/或加热装置接触。
在所述多孔板的一个实施方案中,在所述几乎矩形形状的较长侧上连接一行内的相邻容器。
例如,所述多孔板包含位于容器的相邻行之间的连续空间。所述连续空间被构建和排列为容纳板状磁性装置。在一个实施方案中,所述容器的底部部分包含球形底部。在一个实施方案中,所述容器的底部部分包含位于所述中心部分和所述球形底部之间的圆锥部分。
在一个实施方案中,所述顶表面包含圆拱(rib),其中所述圆拱包围所述容器的开口。例如,所述容器的所述上部部分的一个较短侧包含凹口(recess),所述凹口包含从圆拱延伸至所述容器内侧的弯曲表面。
此外,在一个实施方案中,所述容器包含圆形内侧形状。
为了固定至加工或温育站,所述基部可以包含含有凹口的边框。分析仪站上的闩锁夹(latch clip)可以衔接所述凹口以将所述板固定在站上。
在一个实施方案中,所述容器包含基本上恒定的壁厚度。
例如,加工板(101)在本发明的上下文中是1-组件板。其顶表面(110)包含多个容器(103)(图5、图6)。每个容器具有在顶部的开口(108),并且在底部末端(112)封闭。顶表面(110)包含圆拱(104),其可以相对于顶表面(110)升高并且包围容器(103)的开口(108)。这会防止可能落到板(101)的顶表面(110)上的液体微滴污染容器(103)的内容物。在图3-8中显示了一个示例性加工板的视图。
加工板(101)的覆盖区可以包含与ANSI SBS覆盖区形式对应的基部的长度和宽度。例如,长度为127.76 mm±0.25 mm,宽度为85.48 mm±0.25 mm。因此,该板(101)具有两个相向的较短侧壁(109)和两个相向的较长侧壁(118)。加工板(101)包含用于与处理机(500, 图12)相互作用的形式锁定元件(106)。可以将加工板(101)在维持正确取向和位置的同时以高速快速地和安全地夹紧、运输并定位。例如,用于夹紧的形式锁定元件(106)位于加工板(101)的上部中心部分(例如上部中心三分之一)内。这具有以下优点:加工板(101)的潜在扭曲对形式锁定元件(106)仅具有微小影响,而且板(101)的操作是更稳健的。
加工板(101)可以包含硬件标识符(102)和(115)。硬件标识符(102)和(115)是加工板(101)独有的,并且不同于在相同***中使用的其它消耗品的硬件标识符。硬件标识符(102、115)可以包含在所述消耗品的侧壁上的***部(119)和/或凹口(125),其中所述***部(119)和/或凹口(125)的模式对于特定消耗品类型例如加工板(101)而言是独特的。此独特模式在本文中也被称作独特的“表面几何学”。硬件标识符(102、115)确保用户仅可以将加工板(101)以适当取向加载到分析仪器的适当堆垛机(stacker)位置中。在加工板(101)的侧面,包含导引元件(116)和(117)(图3、图4)。它们防止加工板(101)倾斜。导引元件(116、117)允许用户将具有导引元件(116、117)的加工板(101)作为堆垛(stack)加载到分析仪器中,然后将其在不使板倾斜的情况下在堆垛机中在该仪器内垂直转移。
容器(103)的中心部分(120)具有几乎矩形的横截面(图6、图7)。它们沿着几乎矩形形状的较长侧(118)被共用壁(113)隔开(图3)。由此形成的容器(103)的行(row)具有以下优点:尽管可用有限的空间,但是它们具有大体积,例如4 ml。另一个优点是,因为基本上恒定的壁厚度,生产是非常经济的。另一个优点是,容器(103)彼此强化,并且因此可以获得形状的高稳定性。
连续空间(121)位于容器(103)的行之间(图6、图7)。该空间(121)可以容纳磁体(202、203)或加热装置(128)(图11)。这些磁体(202、203)和加热装置(128)是例如固体装置。因此,通过在使磁体(202、203)接近容器(103)时对容器(103)施加磁场,可以将可容纳在容器(103)中的被液体(215)包含的磁性颗粒(216)与该液体(215)分离。或者,在将加工板(101)置于加热装置(128)上时,可以以升高的、受控的温度温育容器(103)的内容物。由于磁体(202、203)或加热装置(128)可以是固体,因此可以实现高能量密度。容器(103)的中心部分(120)的几乎矩形的形状(图10)还如下优化容器壁(109)和扁平形状的磁体(202)或加热装置(128)之间的接触:优化容器(103)和磁体(202)或加热装置(128)之间的接触表面,并且因此增强向容器(103)中的能量转移。
在容器的圆锥底部(111)的区域中,空间(121)甚至更为明显,并且可以容纳更多磁体(203)。容器的上部区域中的大磁体(202)和圆锥区域中的较小磁体(203)的组合允许较大或小体积的液体(215)中的磁性颗粒(216)的分离。因此,小磁体(203)使得在洗脱液移液过程中隔离磁性颗粒(216)更简单。这使得通过减小磁性颗粒(216)沉淀物的死体积来以最小损失转移洗脱液成为可能。此外,使磁性颗粒(216)在转移的洗脱液中的存在最小化。
在容器(103)的,容器(103)的较短侧壁(109)之一包含延伸至圆周圆拱(104)的试剂入口通道(105)(图3、4、7)。将试剂转移至试剂入口通道(105)上并且从所述通道(105)排入容器(103)中。因此,防止移液管针头或尖部(3、4)和在容器中所含的液体之间的接触。此外,防止由将液体直接分配进容器(103)所含的另一种液体(215)中引起的飞溅,其可能造成移液管针头或尖部(3、4)或相邻容器(103)的污染。先后将小体积的试剂和最大体积的另一种试剂连续转移至试剂入口通道(105)上会确保将仅以少量添加的试剂完全排入容器(103)中。因此,在不损失要实施的测试的准确度的情况下转移小体积的试剂是可能的。
在内侧,在容器的底部(111、112),形状变成圆锥形(111),并且以球形底部(112)为末端(图6、图7)。容器的内侧形状(114)(包括矩形中心部分(120))是圆形的。球形底部(112)、圆形内侧形状(114)、圆锥部分(111)和容器(103)的精细表面的组合会产生有利的流体学,其促进加工板(101)中的分析物的有效分离和纯化。球形底部(112)允许分离的洗脱液的基本上完全使用和死体积的减小,这会减少试剂的遗留或样品交叉污染。
加工板(101)的基部(129)上的边框包含用于衔接加工站(201)或加热装置(128)或分析仪器(126)上的闩锁夹(124)的凹口(107)(图5、图9)。闩锁夹(124)与凹口(107)的衔接允许加工板(101)在加工站(201)上的定位和固定。凹口(107)的存在允许闩锁力与基部(129)几乎垂直地作用于加工板(101)。因此,仅可以发生横向起作用的小力。这会减少应变的发生,并因此减少加工板(101)的变形。垂直闩锁力也可以中和加工板(101)的任何变形,从而导致加工站(201)内的球形底部(111)的更精确定位。一般而言,加工板(101)和分析仪内的加工站(201)或加热装置(128)之间的精确界面会减小死体积,而且还减小样品交叉污染的风险。
“分离站”是分析***的允许固体支持材料与流体样品中存在的其它材料分离的装置或组件。这样的分离站可以例如包含、但不限于离心机、具有过滤管的支架、磁体、或其它合适的组件。在本发明的一个实施方案中,分离站包含一个或多个磁体。例如,将一个或多个磁体用于分离作为固体支持物的磁性颗粒,例如磁性玻璃颗粒。例如,如果将流体样品和固体支持材料在多孔板的孔中组合在一起,那么分离站所包含的一个或多个磁体可以例如通过将磁体引入孔中来与流体样品自身接触,或者可以使所述一个或多个磁体靠近孔的外壁以便吸引磁性颗粒,并随后将它们与周围液体分离。
在一个实施方案中,所述分离站是包含多孔板的装置,所述多孔板包含具有在多孔板的顶表面处的开口和封闭底部的容器。所述容器包含上部部分、中心部分和底部部分,其中所述上部部分与多孔板的顶表面连接,并且可以包含两个较长侧和两个较短侧。所述中心部分具有含两个较长侧的基本上矩形的横截面,其中所述容器成行排列。连续空间位于两个相邻行之间用于使安放在夹持机构上的至少一个磁体与处于至少两个Z位置的侧壁选择性接触。该装置进一步包含磁性分离站,所述磁性分离站包含至少一个夹持机构。所述夹持机构包含至少一个产生磁场的磁体。存在移动机构,其相对于多孔板的容器至少在第一和第二位置之间垂直移动包含至少一个磁体的所述至少一个夹持机构。例如,容器的所述至少两个Z位置包含所述容器的侧壁和底部部分。在所述至少一个磁体处于所述第一位置时,所述至少一个磁体的磁场将磁性颗粒拉到容器的邻近所述至少一个磁体的内表面。所述磁场的效应在所述至少一个磁体处于所述第二位置时小于在所述至少一个磁体处于所述第一位置时。例如,包含所述至少一个磁体的夹持机构包含框。容器具有如上文在多孔板/加工板的背景下描述的特征。一种这样的特征是。所述容器的至少一部分具有与所述容器的轴正交的基本上矩形的横截面。
在所述第一位置,所述至少一个磁体邻近所述容器的所述部分。邻近被理解为是指,紧密靠近诸如以对容器的内容物施加磁场,或者与容器发生物理接触。
分离站包含用于接受多孔板的框和用于附着多孔板的闩锁夹。例如,分离站包含两类磁体。在下面进一步描述该实施方案。
在下面描述了第二个实施方案,其包含弹簧,所述弹簧对包含磁体的框施加压力,使得所述磁体被压靠在多孔板的容器上。
可以将第一磁体构建和排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中所容纳的包含磁性颗粒的大体积液体施加磁场。可以将所述第二磁体构建和排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中所容纳的包含磁性颗粒的小体积液体施加磁场。所述第一和第二磁体可以移动至不同的Z位置。
此外,分离和纯化核酸的方法在本发明的上下文和所述分离站中是有用的。所述方法包括在多孔板的容器中使核酸与磁性颗粒结合的步骤。所述容器包含上部开口、中心部分和底部部分。然后,当液体的主要部分位于容器中圆锥部分被具有矩形形状的中心部分替换的截面之上时,如下将结合的材料与液体中所含的未结合的材料分离:将磁体从第二位置移动到第一位置,并且在所述第一位置,对中心部分施加磁场,以及任选地,另外对所述容器的底部部分施加磁场。可以任选地用洗涤溶液洗涤磁性颗粒。通过对所述容器的底部部分选择性地施加磁场,从所述磁性颗粒分离小体积的液体,其中所述液体的主要部分位于容器的圆锥部分被具有矩形形状的中心部分替换的截面之下。
用于分离与磁性颗粒结合的核酸的磁性分离站在本发明的上下文中也是有用的,所述分离站包含第一磁体和第二磁体,所述第一磁体被构建和排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中所容纳的包含磁性颗粒的大体积液体施加磁场,所述第二种磁体被构建和排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中所容纳的包含磁性颗粒的小体积液体施加磁场,且其中所述第一和第二磁体可以移动到不同的Z位置。在本文中描述了磁性分离站的实施方案。
在下面描述了分离站(201)的第一个实施方案。所述分离站(201)的第一个实施方案包含至少两类磁体(202、203)。第一长型磁体(202)被构建和排列为配合进加工板(101)的空间(121)。因而,磁体(202)对容器(103)中的液体(215)施加磁场以将磁性颗粒(216)隔离在容器壁的内侧上。当存在大体积液体(215)时,这允许磁性颗粒(216)和任何与其结合的材料与在容器(103)内侧的液体(215)的分离。磁体(202)具有长形结构,并且被构建和排列为与容器的基本上矩形的中心部分(120)相互作用。因此,当液体(215)的主要部分位于容器(103)的圆锥部分(111)被具有矩形形状的中心部分(120)替换的截面之上时使用磁体(202)。如在图40中所示,磁体(202)的构造包含夹持机构(204、204a),所述夹持机构包含配合进加工板(101)中的容器(103)行之间的空间(121)的磁体(202)。磁体(202)的另一个实施方案包含排列在夹持机构(204、204a)上的磁体(202)。分离站(201)的磁体(203)是更小的,并且可以与容器(103)的圆锥部分(111)相互作用。这显示在图10中。磁体(203)排列在基部(205)上,所述基部可以移动进加工板(101)的空间(121)中。每个磁体(202、203)被构建为与两个相邻行中的两个容器(103)相互作用。在一个实施方案中,所述加工板(101)具有每行8个容器(103)的6行。可以与加工板(101)相互作用的分离站(201)具有3个包含磁体(202)的夹持机构(204、204a)和4个包含磁体(203)的基部(205)。还包括一个实施方案,其中所述分离站具有4个包含磁体(202)的磁性夹持机构(204、204a)和3个包含磁体(203)的磁性基部(205)。
所述磁体(202、203)是可移动的。所述分离站(201)包含用于移动夹持机构(204、204a)和基部(205)的机构。所有夹持机构(204、204a)通过基部(217)相互连接,并且因此协调地移动。所有磁体(203)与一个基部(218)连接,并且因此协调地移动。用于移动磁性板(202)和(203)的机构被构建和排列为将两类磁性板(202、203)移动至总共4个末端位置:
在图40 a-c中,所述磁体(203)位于加工板(101)的容器(103)的圆锥部分附近。这是磁体(203)的最高位置,并且是分离位置。在此图中,所述磁体(202)位于最低位置。当它们在此位置时,它们不参与分离。
在图10所示的一个实施方案中,磁体(202)的基部(217)与定位轮(206)连接。所述基部(217)包含通过移动元件(209)与连接元件(208)柔性地接触的底部末端(207)。所述移动元件被构建和排列为将连接元件(208)沿着轨道(212)从一侧向另一侧移动。所述移动元件(209)用销(220)固定至连接元件(208)。所述连接元件(208)通过螺钉(210)固定至定位轮(206)。连接元件(208)也与轴(211)连接。所述连接元件(208)是矩形板。随着定位轮(206)围绕轴(211)偏心地移动使得螺钉(210)从高于偏心轴的点移动到低于偏心轴的点,使移动元件(209)和具有与其附着的磁体(202)的基部(204)的底部末端(207)从最高位置移动到最低位置。基部(218)安放在底部部分(219)上,并且在其较低末端用销(213)与移动元件(214)连接,所述移动元件可以是轮,其与定位轮(206)相互作用。当定位轮(206)围绕轴(211)旋转时,轮(214)沿着定位轮(206)移动。如果轮(214)位于定位轮(206)的离轴(211)的距离较短的截面上,那么磁体(203)处于其最低位置。当轮(214)位于定位轮(206)的离轴(211)的距离最大的截面上时,磁体(203)处于其最高位置。因此,在分离站的第一个实施方案的一个实施方案中,磁体(203)的位置受定位轮(206)形状控制。当移动元件(209)沿着轨道(212)的中心、圆形的上部或下部部分(212a)移动时,小型磁体(203)上下移动。当移动元件(209)位于底部末端(207)的侧面(212b)上并且向上或向下移动时,磁体(202)向上或向下移动。所述定位轮可以由任何电动机(224)旋转。
在一个实施方案中,弹簧(225)附着于分离站的基部(222)和磁体(203)的基部(218)以确保磁体(203)在其向下移动时移动至最低位置。
本文中使用的术语“销”指任何固定元件,包括螺钉或销。
在第二个实施方案中,所述分离站(230)包含至少一个夹持机构(231),所述夹持机构包含至少一个磁体(232),与行(123)中的容器(103)的数目相等的数目的磁体。所述分离站(230)包含与上文中描述的多孔板(101)的行(123)的数目相等的数目的夹持机构(231)。例如,6个夹持机构(231)安放在分离站(230)上。至少一个磁体(232)安放在一个夹持机构(231)上。例如,磁体(232)的数目等于一行(123)中的容器(103)的数目。例如,8个磁体(232)安放在一个夹持机构上(231)。例如,在所述夹持机构(231)上包含一类磁体(232)。例如,磁体(232)安放在取向朝向与磁体相互作用的容器的一侧。
夹持机构(231)安放在基部(233)上。例如,所述安放是柔性的。基部(233)包含安放于其上的弹簧(234)。弹簧(234)的数目是安放在所述基部(233)上的每个夹持机构(231)至少一个弹簧。该基部进一步包含斜面(236),其限制弹簧的移动,并因此限制包含磁体(232)的夹持机构(231)的移动。例如,所述弹簧(234)中的任一个被构建和排列为与夹持机构(231)相互作用。例如,所述弹簧(234)是轭式弹簧(yoke spring)。所述相互作用控制夹持机构(231)的水平移动。此外,分离站(230)包含框(235)。具有夹持机构(231)的基部(233)通过如在上文中关于第一个实施方案的磁体(232)描述的移动机构与框(235)连接。
例如,所述基部(233)和夹持机构(231)被构建和排列为(在Z方向)垂直移动。
将上文中描述的多孔板(101)***分离站(230)中。使包含磁体(232)的夹持机构(231)垂直移动。如此,将任一个夹持机构(232)移动进容器(103)的两行(123)之间的空间(121)中。所述垂直移动使安放在夹持机构(231)上的磁体(232)与容器(103)接触。根据容器(103)内侧的液体(215)的体积选择Z位置。对于大体积,磁体(232)接触在中心位置(120)的容器(103),在那里容器(103)具有近似矩形的形状。对于小体积的液体(215)(其中液体(215)的主要部分位于容器(103)的中心部分(120)以下),磁体(232)接触容器(103)的圆锥部分(111)。
弹簧附着于任一个框(231)的基部(233) (图9 a)、b))。该弹簧使磁体(232)压靠在容器(103)上。这会确保在磁性分离过程中磁体(232)和容器(103)之间的接触。例如,磁体(232)在位于入口(105)下面的侧壁(109)上接触容器(103)。这具有以下优点:通过移液添加的液体在隔离的磁性颗粒上面流过,并且确保将颗粒重新悬浮,而且相同地处理所有容器中的所有样品。
该实施方案特别适合用于在所述多孔板(101)的容器(103)中含有不同水平的液体(215)时将如上文中描述的多孔板(101)中所包含的液体(215)与磁性颗粒(216)分离。
“洗涤缓冲液”是被设计为除去不希望的组分(特别是在纯化操作中)的流体。这样的缓冲液是本领域众所周知的。在核酸的纯化的上下文中,洗涤缓冲液适于洗涤固体支持材料以将固定化的核酸与任何不希望的组分分离。所述洗涤缓冲液可以例如在如上所述的具有酸性pH且不含乙醇和/或离液剂的一种或多种缓冲溶液中含有乙醇和/或离液剂。经常将洗涤溶液或其它溶液提供为储备溶液,所述储备溶液在使用前必须稀释。
在根据本发明的方法中的洗涤需要使固体支持材料及固定化在其上面的核酸与洗涤缓冲液大致上密集接触。不同的方法可能实现这点,例如在各个容器中或与各个容器一起摇动洗涤缓冲液及固体支持材料。另一种有利的方法是将包含洗涤缓冲液和固体支持材料的悬浮液抽吸并分配一次或多次。可以使用移液管实施此方法,其中所述移液管包含一次用弃的移液管尖部,在其中抽吸所述悬浮液并将它再次分配。这样的移液管尖部在抛弃和替换前可以使用数次。一次用弃的移液管尖部可以具有至少10µl、或至少15µl、或至少100µl、或至少500µl、或至少1 ml、或约1 ml的体积。移液管还可以是移液针头。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中在步骤d.中的所述洗涤包含抽吸和分配包含固体支持材料的洗涤缓冲液。
对于分离的核酸的下游加工,在将它们进行扩增前将它们与固体支持材料分离可以是有利的。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述方法在步骤d.中进一步包括以下步骤:在洗涤所述固体支持材料以后,用洗脱缓冲液将纯化的核酸从固体支持材料洗脱。
“洗脱缓冲液”在本发明的上下文中是适合用于将核酸与固体支持物分离的液体。这样的液体可以是例如蒸馏水或水性盐溶液,例如Tris缓冲液如Tris HCl或HEPES,或熟练的技术人员已知的其它合适的缓冲液。这样的洗脱缓冲液的pH值可以是碱性的或中性的。所述洗脱缓冲液可以含有其它组分例如螯合剂如EDTA,其通过灭活降解酶来稳定分离的核酸。
可以在升高的温度实施所述洗脱,使得本发明的一个实施方案是上述的方法,其中在70℃和90℃之间的温度或在80℃的温度实施步骤d.。
“扩增试剂”在本发明的上下文中是能够实现核酸的扩增的化学或生化组分。这样的试剂包含、但不限于核酸聚合酶、缓冲液、单核苷酸诸如核苷三磷酸、寡核苷酸例如如寡核苷酸引物、盐和它们各自的溶液、检测探针、染料,等。
如本领域已知的,“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。两类最常见的这样的杂环碱基是嘌呤和嘧啶。
“核苷酸”是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸酯基团的核苷。对于包含呋喃型戊糖基糖的那些核苷,磷酸酯基团可以连接至所述糖的2'-、3'-或5'-羟基部分。核苷酸是“寡核苷酸”(其可以更一般地称为“寡聚化合物”),或“多核苷酸”(更一般称为“多聚化合物”)的单体单元。前述物质的另一种一般表述是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
根据本发明,“寡聚化合物”是由“单体单元”组成的化合物,所述“单体单元”可以是单独的核苷酸或单独的非天然化合物(见下文),更具体地是经修饰的核苷酸(或核苷酸类似物)或非核苷酸化合物,或其组合。
“寡核苷酸”和“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是寡聚化合物的亚组。在本发明的上下文中,术语“寡核苷酸”表示从多个作为其单体单元的核苷酸形成的组分。磷酸酯基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常连接或主链是3'至5'磷酸二酯键。如基本上在本领域中描述的和本领域的专家已知的,可以合成寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸(见下文)。用于制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的,并且包括例如合适序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如由NarangS. A. 等人, Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98描述的磷酸三酯方法、由BrownE. L., 等人, Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151公开的磷酸二酯方法、在Beaucage等人, Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859中公开的氨基亚磷酸酯方法、在Garegg等人, Chem. Scr. 25 (1985) 280-282中公开的H-膦酸酯方法以及在US 4,458,066中公开的固体支持物方法。
在上述的方法中,寡核苷酸可以经过化学修饰,即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后,探针或引物是经修饰的寡核苷酸。
“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然核苷酸相差某种修饰,但是仍然由碱基、呋喃型戊糖基糖、磷酸酯部分、碱基样、呋喃型戊糖基糖样和磷酸酯样部分或其组合组成。例如,可以将标记附着于核苷酸的碱基部分,由此获得经修饰的核苷酸。核苷酸中的天然碱基也可以用例如7-脱氮嘌呤替换,由此也获得经修饰的核苷酸。
属于寡聚化合物的另一个特定亚组的“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)具有一个或多个核苷酸和一个或多个经修饰的核苷酸作为单体单元。因而,术语“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)表示以与寡核苷酸基本上相似的方式起作用的结构,并且可以互换使用。从合成的观点看,例如通过对磷酸酯主链、核糖单元或核苷酸碱基的适当修饰来化学修饰寡核苷酸,可以制备经修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)(Uhlmann和Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S., 和Eckstein F.,Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134)。代表性修饰包括用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷间键替代磷酸二酯核苷间键;用脱氮或氮杂嘌呤和嘧啶替代天然的嘌呤和嘧啶碱基,在第5位或第6位具有取代基基团的嘧啶碱基;在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脱氮嘌呤)具有改变的取代基基团的嘌呤碱基;携带烷基-、烯基-、炔基或芳基-部分(例如低级烷基诸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基或芳基基团如苯基、苄基、萘基)的碱基;在例如其2’位置具有取代基基团的糖;或碳环或无环糖类似物。其它修饰是本领域技术人员已知的。这样的经修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)最好被描述为与天然寡核苷酸在功能上可互换,但是在结构上不同。更详细地,示例性的修饰公开在Verma S., 和Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67(1998) 99-134或WO 02/12263中。另外,可以做出这样的修饰,其中核苷单元经由取代核苷间磷酸酯或糖磷酸酯键的基团连接。这样的键包括在Verma S., 和Eckstein F., Annu.Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134中公开的那些。当利用磷酸酯以外的键来连接核苷单元时,这样的结构也已经被描述为“寡核苷”。
“核酸”以及“靶核酸”是如本领域的熟练技术人员已知的核苷酸的多聚化合物。“靶核酸”在本文中用于表示样品中将要分析(即将要确定其在样品中的存在、不存在和/或量)的核酸。
术语“引物”在本文中如本领域的熟练技术人员已知的那样使用,且指能够引发模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成的寡聚化合物,主要指寡核苷酸,但也指经修饰的寡核苷酸,即例如引物的3’端提供游离的3’-OH基团,可以通过建立3'-至5'-磷酸二酯键的模板依赖性DNA聚合酶向其连接其它核苷酸,其中使用脱氧核苷三磷酸且其中释放焦磷酸盐。
“探针”也表示天然的或经修饰的寡核苷酸。如本领域已知的,探针用于检测分析物或扩增物的目的。在上述的方法的情况下,可以使用探针来检测靶核酸的扩增物。为此目的,探针通常携带标记。
“标记”经常被称作“报告基团”,通常是这样的基团:其使核酸、特别是寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸、以及与其结合的任何核酸与样品的剩余部分可区分开(已经附着标记的核酸也可以被称作经标记的核酸结合化合物、经标记的探针或仅探针)。示例性的标记是荧光标记,其是例如荧光染料诸如荧光素染料、罗丹明染料、花青染料和香豆素染料。示例性的荧光染料是FAM、HEX、JA270、CAL635、香豆素343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-Red640、LC-Red 705。
在本发明的上下文中,任何引物和/或探针都可以经过化学修饰,即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后,所述探针或引物是经修饰的寡核苷酸。
一种核酸扩增方法是聚合酶链式反应(PCR),其尤其公开在美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188中。PCR通常采用两种或更多种结合选择的核酸模板(例如DNA或RNA)的寡核苷酸引物。对核酸分析有用的引物包括能够在靶核酸的核酸序列内充当核酸合成的起始点的寡核苷酸。通过常规方法可以从限制酶切消化纯化引物,或可以合成地生产它。所述引物可以是单链的以在扩增中实现最大效率,但是所述引物可以是双链的。首先将双链引物变性,即,处理以分离所述链。一种使双链核酸变性的方法是通过加热。“热稳定的聚合酶”是对热稳定的聚合酶,即它是这样的酶:其催化与模板互补的引物延伸产物的形成,并且当遭受升高的温度持续实现双链模板核酸的变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常,合成在每种引物的3’末端处开始,并且沿着模板链在5’至3’方向前进。热稳定的聚合酶已经例如分离自黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)。尽管如此,非热稳定的聚合酶也可以用在PCR测定中,只要补充所述酶即可。
如果模板核酸是双链的,在可以将它用作PCR中的模板之前必须分离两条链。链分离可以通过任意合适的变性方法完成,所述方法包括物理方式、化学方式或酶促方式。一种分离核酸链的方法包括加热核酸直到它显著地变性(例如,大于50%、60%、70%、80%、90%或95%发生变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及正在变性的核酸的长度和核苷酸组成,但是通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间,所述时间取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。通常将变性执行约5秒至9分钟。为了不使各种聚合酶如例如Z05 DNA聚合酶暴露于这样的高温太久和因而产生损失功能性酶的风险,使用短变性步骤可以是优选的。
在本发明的一个实施方案中,所述变性步骤是长至30秒,或长至20秒,或长至10秒,或长至5秒,或约5秒。
如果通过加热使双链模板核酸变性,那么允许反应混合物冷却至这样的温度:其促进每条引物与它在靶核酸上的靶序列退火。
用于退火的温度可以是约35℃至约70℃,或约45℃至约65℃;或约50℃至约60℃,或约55℃至约58℃。退火时间可以是约10秒至约1分钟(例如约20秒至约50秒;约30秒至约40秒)。在该背景下,可以有利的是,使用不同的退火温度以便增加各个测定的包容性。简而言之,这意味着,在相对低的退火温度,引物也可以结合具有单一错配的靶标,所以也可以扩增某个序列的变体。如果例如某种生物体具有也要检测的已知或未知的遗传变体,那么这可以是合乎需要的。另一方面,相对高的退火温度具有提供更高特异性的优点,因为朝向更高的温度,引物结合不完全匹配的靶序列的可能性不断下降。为了受益于这两种现象,在本发明的某些实施方案中,上述的方法包括在不同温度(例如,首先在较低温度,然后在较高温度)退火。如果例如第一温育在55℃发生约5个循环,那么可以(预)扩增不完全匹配的靶序列。这之后可以是例如在58℃的约45个循环,从而贯穿实验的主要部分提供较高的特异性。这样,不会遗漏潜在重要的遗传变体,同时保持相对高的特异性。
然后将反应混合物调至促进或优化聚合酶活性的温度,即,这样的温度:其适合从退火引物发生延伸以生成与要分析的核酸互补的产物。所述温度应该适合从与核酸模板退火的每条引物合成延伸产物,但是不应当高至使来自它的互补模板的延伸产物变性(例如,用于延伸的温度通常范围为约40℃至80℃;例如,约50℃至约70℃;约60℃)。延伸时间可以是约10秒至约5分钟,或约15秒至2分钟,或约20秒至约1分钟,或约25秒至约35秒。新合成的链形成可以用在反应的后续步骤中的双链分子。可以根据需要经常重复链分离、退火和延伸的步骤以产生期望的量的与靶核酸对应的扩增产物。在反应中的限制因素是存在于反应中的引物、热稳定的酶和核苷三磷酸的量。可以将所述循环步骤(即,变性、退火和延伸)重复至少一次。对于在检测中的应用,循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,那么将需要更多的循环步骤来扩增适合检测的靶序列。通常,将循环步骤重复至少约20次,但是可以重复多达40、60或甚至100次。
可以实施PCR,其中退火和延伸的步骤在同一步骤中实施(一步PCR),或者如上所述,在分开的步骤中实施(两步PCR)。将退火和延伸一起(并因而)在相同的物理和化学条件下用合适的酶(例如,Z05 DNA聚合酶)实施具有以下优点:节省每个循环中用于额外步骤的时间,并且还消除对退火和延伸之间的额外温度调节的需要。因而,一步PCR会降低各个测定的总体复杂性。
一般而言,总扩增的较短时间可以是优选的,因为达到结果的时间缩短并导致可能更早的诊断。
要使用的其它核酸扩增方法包括连接酶链式反应(LCR; Wu D. Y. 和Wallace R.B., Genomics 4 (1989) 560-69;和Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991)189-193);聚合酶连接酶链式反应(Barany F., PCR Methods and Applic. 1(1991) 5-16); Gap-LCR (WO 90/01069);修复链式反应(EP 0439182 A2), 3SR (KwohD.Y. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli J.C., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808), 和NASBA (US5,130,238)。此外,存在链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qb-扩增(关于综述,参见例如Whelen A. C.和Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50(1996) 349-373;Abramson R. D.和Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47)。
内部对照核酸可能表现出以下与其序列有关的性质:
- 从55℃至90℃、或从65℃至85℃、或从70℃至80℃、或约75℃的解链温度
- 多达500个碱基或碱基对、或50-300个碱基或碱基对、或100-200个碱基或碱基对、或约180个碱基或碱基对的长度
- 30%至70%、或40%至60%、或约50%的GC含量。
在本发明的上下文中,“序列”是核酸的一级结构,即组成各个核酸的单个核苷碱基的特定排列。必须理解,术语“序列”不表示特定类型的核酸诸如RNA或DNA,而是适用于这两者以及其它类型的核酸例如PNA或其它。如相关领域中众所周知的,在核苷碱基彼此对应的情况下,特别是在尿嘧啶(存在于RNA中)和胸腺嘧啶(存在于DNA中)的情况下,可以认为这些碱基在RNA和DNA序列之间是等同的。
临床上有关的核酸经常是DNA,其可以源自例如DNA病毒如例如乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)等,或细菌如例如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)(NG)等。在这样的情况下,为了反映靶核酸特性,使用由DNA组成的内部对照核酸可以是有利的。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述内部对照核酸是DNA。
可以将内部对照DNA提供为装甲颗粒。装甲DNA可用作内部对照核酸。在另一个实施方案中,使用λ噬菌体GT11将DNA对照核酸装甲化。因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述内部对照核酸是装甲核酸。
“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板而合成DNA的核酸聚合酶。在本发明的一个实施方案中,所述具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。
根据本发明的方法包括:在有至少所有4种天然的或经修饰的脱氧核糖核苷三磷酸存在下,在合适的缓冲液中,将含有RNA核酸的样品与寡核苷酸引物和热稳定的DNA聚合酶一起温育,所述寡核苷酸引物与所述RNA核酸充分互补以与后者杂交,所述缓冲液包含金属离子缓冲液,其在一个实施方案中缓冲pH和金属离子浓度。在特定温度实施此温育,所述温度适合使所述引物与所述RNA模板杂交,并且使所述DNA聚合酶催化所述脱氧核糖核苷三磷酸的聚合以形成与所述RNA模板的序列互补的cDNA序列。
本文中使用的术语“cDNA”表示使用核糖核酸链(RNA)作为模板合成的互补DNA分子。所述RNA可以是例如mRNA、tRNA、rRNA、或另一种形式的RNA,诸如病毒RNA。所述cDNA可以是单链的、双链的,或者可以与互补RNA分子氢键键合,如在RNA/cDNA杂合物中。
适合用于与RNA核酸退火的引物也可以适合用于通过PCR扩增。对于PCR,与逆转录的cDNA链互补的第二引物为延伸产物的合成提供起始位点。
热稳定的DNA聚合酶可以用在偶联的单酶反转录/扩增反应中。术语“同质的”在该背景下表示用于RNA靶标的反转录和扩增的两步骤单一加成反应。同质的意指在反转录(RT)步骤以后,不需要在扩增步骤之前打开反应容器或以其它方式调节反应组分。在非同质RT/PCR反应中,在反转录以后且在扩增以前,例如调节、添加或稀释一种或多种反应组分诸如扩增试剂,为此不得不打开反应容器,或者至少不得不操作其内容物。本发明的范围包括同质性和非同质性实施方案。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中在从30℃至75℃、或从45℃至70℃、或从55℃至65℃的不同温度进行具有逆转录酶活性的聚合酶的所述温育。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中用于温育具有逆转录酶活性的聚合酶的时间段是长至30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。
本发明的另一个方面是上述的方法,其中所述具有逆转录酶活性且包含突变的聚合酶选自:
a)CS5 DNA聚合酶
b)CS6 DNA聚合酶
c)海栖热袍菌DNA聚合酶
d)水生栖热菌DNA聚合酶
e)嗜热栖热菌DNA聚合酶
f)黄栖热菌DNA聚合酶
g)丝状栖热菌DNA聚合酶
h)栖热菌属种sps17 DNA聚合酶
i)栖热菌属种Z05 DNA聚合酶
j)那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶
k)非洲栖热腔菌DNA聚合酶
l)Thermus caldophilus DNA聚合酶。
特别适合于这些要求的是携带在聚合酶结构域中的突变的酶,所述突变以更快延伸速率的方式增强它们的逆转录效率。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。
在一个实施方案中,在上述的方法中,所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。
在WO 2008/046612中公开了携带使其在本发明的上下文中特别有用的的点突变的聚合酶。具体地,聚合酶可以是在聚合酶结构域中至少包含下述基序的突变DNA聚合酶:
T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N;其中Xb7是选自S或T的氨基酸,且其中Xb8是选自G、T、R、K或L的氨基酸,其中所述聚合酶包含3’-5’外切核酸酶活性且具有与野生型DNA聚合酶相比改善的核酸延伸速率和/或改善的反转录效率,其中在所述野生型DNA聚合酶中,Xb8是选自D、E或N的氨基酸。
一个实施例是来自栖热菌属种Z05的热稳定的DNA聚合酶的突变体(描述在例如US5,455,170中),与相应野生型酶Z05相比,所述变异包含在聚合酶结构域中的突变。根据本发明的方法的一个实施方案是突变体Z05 DNA聚合酶,其中在第580位处的氨基酸选自G、T、R、K和L。
对于使用热稳定的聚合酶的反转录,Mn2+可以是二价阳离子,并且通常作为盐例如氯化锰(MnCl2)、乙酸锰(Mn(OAc)2)、或硫酸锰(MnSO4)被包括。如果在含有50mM Tricine缓冲液的反应中包括MnCl2,例如那么MnCl2通常以0.5-7.0 mM的浓度存在;当利用各200 mM的dGTP、dATP、dUTP和dCTP时,0.8-1.4 mM是优选的;且2.5-3.5 mM MnCl2是最优选的。此外,也可以使用Mg2+ 作为二价阳离子进行反转录。
本文中使用的“生物体”意指任何活的单细胞或多细胞生命形式。本文中使用的病毒是生物体。
特别由于适当的最适温度,酶如Tth聚合酶或例如上文提及的突变体Z05 DNA聚合酶适合实施随后的扩增靶核酸的步骤。为逆转录和扩增利用同一种酶会促成实施该方法的容易度并且促进它的自动化,因为不必在RT和扩增步骤之间操作流体样品。
因此,在上述的方法中,使用相同的具有逆转录酶活性的聚合酶进行步骤g中的逆转录和扩增。例如,所述酶是上述的突变体Z05 DNA聚合酶。
为了不使反应混合物的聚合酶或其它组分暴露于升高的温度超过必要的时间,在一个实施方案中,高于90℃的步骤是至多20秒、或至多15秒、或至多10秒、或至多5秒或5秒长。这也会缩短达到结果的时间并且缩短测定的总体需要时间。
在这样的同质方案中,可以具有相当大的优点的是,在启动逆转录和扩增以前将反应容器密封,由此降低污染的风险。可以例如如下实现密封:应用箔(其可以是透明的)、盖,或者向反应容器添加油并在流体顶部形成亲脂相作为密封层。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,所述方法还在步骤e以后包括将至少两个反应容器密封的步骤。
为了易于操作并促进自动化,可以将至少两个反应容器在整体排列中组合,使得可以一起操作它们。
结果,本发明的一个方面是上述的方法,其中在同一个整体排列中组合所述至少两个反应容器。
整体排列可以是例如可逆地或不可逆地彼此附着或在架中排列的小瓶或试管。例如,所述整体排列是多孔板。
由于核酸扩增(特别是、但不仅仅是在PCR的情况下)在作为循环反应实施时是非常有效的,本发明的一个方面是上述的方法,其中在步骤g中的扩增反应由多个循环步骤组成。
合适的核酸检测方法是本领域技术人员已知的,并且描述在标准教科书如Sambrook J. 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989和Ausubel F. 等人.:Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY中。在实施核酸检测步骤前也可以存在其它纯化步骤,如例如沉淀步骤。所述检测方法可以包括、但不限于结合或***特定的染料如溴化乙啶,其***双链DNA中并在此后改变它的荧光。也可以任选地在限制酶切消化以后通过电泳方法分离纯化的核酸,此后将其显影。还存在基于探针的测定,其采用寡核苷酸与特定序列的杂交并随后检测杂交物。
可以在扩增反应期间或之后检测扩增的靶核酸以便评价分析的结果。特别对于实时检测,使用核酸探针是有利的。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤,所述杂交步骤包括使扩增的核酸与探针杂交。
可以有利的是,实时监测扩增反应,即在扩增本身期间检测靶核酸和/或其扩增物。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记所述探针。
上述的方法可以基于供体荧光部分和an受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)。一种代表性的供体荧光部分是荧光素,且代表性的对应的受体荧光部分包括LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5。通常,检测包括在供体荧光部分吸收的波长激发样品,并显现和/或测量由对应的受体荧光部分发射的波长。在根据本发明的方法中,检测以后可以定量FRET。例如,在每个循环步骤以后执行检测。例如,实时执行检测。通过使用商购可得的实时PCR仪器(例如,LightCycler™或TaqMan®),可以在单个封闭容器中组合扩增产物的PCR扩增和检测,并显著地减小循环时间。由于检测与扩增并行地发生,实时PCR方法会避免对扩增产物的操作的需要,并减小扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR会极大地减小出报告时间,并且是临床实验室中的常规PCR技术的有吸引力的替代方案。
下列专利申请描述了如在LightCycler™技术中使用的实时PCR:WO 97/46707、WO97/46714和WO 97/46712。LightCycler™仪器是一种与利用高质量光学部件的微体积荧光计组合的快速热循环仪。该快速热循环技术使用薄玻璃容器作为反应容器。通过交替加热的空气和环境空气来控制反应室的加热和冷却。由于空气的低质量以及容器的表面积与体积的高比率,可以在热室内实现非常快速的温度交换速率。
TaqMan®技术利用被两个荧光部分标记的单链杂交探针。当第一荧光部分被合适波长的光激发时,所吸收的能量根据FRET原理被转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。以该形式使用的典型荧光染料是例如,尤其是,FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5.5。在PCR反应的退火步骤中,经标记的杂交探针会结合靶核酸(即,扩增产物)并在随后的延伸阶段中通过Taq或熟练的技术人员已知的另一种合适聚合酶(诸如突变体Z05聚合酶)的5’至3’外切核酸酶活性而降解。所以,激发的荧光部分和猝灭剂部分变成在空间上彼此分离。结果,在没有猝灭剂存在下激发第一荧光部分后,可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。
在上述的两种检测形式中,发射的信号的强度可以与原始靶核酸分子的数目相关联。
作为FRET的替代,使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如,SYBRGREENI®或SYBRGOLD®(Molecular Probes)),可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用后,这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时,通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
使用本发明的实时PCR方法,也可以使用与FRET结合的分子信标来检测扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。所述第二荧光部分通常是猝灭剂,且所述荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。由于在探针内的二级结构形成,当探针在溶液中时,两个荧光部分处于空间接近。在与扩增产物杂交以后,探针的二级结构被破坏,并且荧光部分变得彼此分离,使得在用合适波长的光激发后,可以检测第一荧光部分的发射。
因而,使用FRET的上述方法是在根据本发明的方法中,其中所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列,其中所述二级结构形成导致所述第一和第二荧光部分之间的空间接近。
只有当荧光部分处于直接局部接近时,并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时,有效的FRET才发生。
因而,在一个实施方案中,所述供体和受体荧光部分是在所述探针上在彼此的不超过5个核苷酸内。
在另一个实施方案中,所述受体荧光部分是猝灭剂。
如上所述,在TaqMan形式中,在PCR反应的退火步骤中,经标记的杂交探针结合靶核酸(即扩增产物),并且在随后的延伸阶段中通过Taq或熟练的技术人员已知的另一种合适聚合酶(诸如突变体Z05聚合酶)的5’至3’外切核酸酶活性而降解。
因而,在一个实施方案中,在上述的方法中,扩增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶。
进一步有利的是,小心地选择由上述的方法产生的扩增子的长度。通常,相对短的扩增子会增加扩增反应的效率。因而,本发明的一个方面是上述的方法,其中扩增的片段包含至多450个碱基、至多300个碱基、至多200个碱基或至多150个碱基。
在本发明中使用的内部对照核酸可以充当“定量标准品核酸”,其倾向于是参照物并且被用作参照物以便定量靶核酸,即确定靶核酸的量。为此目的,一种或多种定量标准品核酸与靶核酸一起经历所有可能的样品制备步骤。此外,贯穿整个方法在相同反应混合物内处理定量标准品核酸。它必须在有或没有靶核酸存在下直接地或间接地产生可检测信号。为此目的,在每个测试中必须小心地优化定量标准品核酸的浓度,以便不干扰灵敏度,但是以便还产生可检测信号,例如在非常高的靶标浓度。就各个测定的检测限度(LOD,见下文)而言,“定量标准品核酸”的浓度范围是20-5000x LOD、20-1000x LOD或20-5000x LOD。反应混合物中的定量标准品核酸的终浓度取决于实现的定量测量范围。
“检测限度”或“LOD”意指样品中的核酸的最低的可检测的量或浓度。低“LOD”对应于高灵敏度,反之亦然。“LOD”通常借助于单位“cp/ml”来表达(特别是在核酸为病毒核酸时),或者表达为IU/ml。“cp/ml”意指“每毫升的拷贝”,其中“拷贝”是各个核酸的拷贝。IU/ml代表“国际单位/ml”,指WHO标准。
一种广泛使用的用于计算LOD的方法是“Probit(概率单位)分析”,它是一种分析刺激(剂量)和量子(全有或全无)应答之间的关联的方法。在典型的量子应答实验中,给动物组施用不同剂量的药物。记录在每个剂量水平的濒死百分比。然后,可以使用Probit分析来分析这些数据。Probit模型假定,应答百分比与对数剂量的关系为累积正态分布。也就是说,可以使用对数剂量作为变量来从累积法线(cumulative normal)读出濒死百分比。使用正态分布而不是其它概率分布,会影响在可能剂量的高和低末端处的预测应答率,但是在中间附近几乎没有影响。
PROBIT分析可以以独特的“命中率”应用。如本领域已知的,“命中率”通常以百分比[%]表示,并且指示在特定浓度的分析物时阳性结果的百分比。因此例如,可以以95%命中率确定LOD,这意味着为其中95%的有效结果呈阳性的设置计算LOD。
在一个实施方案中,上述的方法提供了1-100 cp/ml或0.5-50 IU/ml、或1-75 cp/ml或0.5-30 IU/ml、或1-25 cp/ml或1-20 IU/ml的LOD。
就来自某些病毒的可能靶核酸的一些例子而言,上述的方法提供了下述LOD:
● HIV: 至多60 cp/ml、至多50 cp/ml、至多40 cp/ml、至多30 cp/ml、至多20 cp/ml、或至多15 cp/ml
● HBV: 至多10 IU/ml、至多7.5 IU/ml、或至多5 IU/ml
● HCV: 至多10 IU/ml、至多7.5 IU/ml、或至多5 IU/ml
● WNV I: 至多20 cp/ml、至多15 cp/ml、或至多10 cp/ml
● WNV II: 至多20 cp/ml、至多15 cp/ml、至多10 cp/ml、或至多5 cp/ml
● JEV: 至多100 cp/ml、至多75 cp/ml、至多50 cp/ml、或至多30 cp/ml
● SLEV: 至多100 cp/ml、至多75 cp/ml、至多50 cp/ml、至多25 cp/ml、或至多10cp/ml。
在下文中描述了如何基于充当定量标准品核酸的内部对照核酸以TaqMan形式执行定量结果的计算的一个例子:从来自整个PCR运行的、经仪器校正的荧光值的输入数据计算滴度。含有靶核酸和充当定量标准品核酸的内部对照核酸的一组样品在使用规定温度概况的热循环仪上经历PCR。在PCR概况中的选定温度和时间,用过滤过的光照射样品,并且为每份样品针对靶核酸和内部对照核酸收集过滤过的荧光数据。在PCR运行结束以后,处理荧光读数以产生内部对照核酸的一组染料浓度数据和靶核酸的一组染料浓度数据。以相同方式处理每组染料浓度数据。在数次真实性检查以后,针对内部对照核酸和靶核酸计算肘值(elbow value)(CT)。将肘值定义为靶核酸或内部对照核酸的荧光与预定阈值(荧光浓度)相交处的点。滴度确定是基于以下假定:靶核酸和内部对照核酸以相同的效率扩增,且在计算的肘值,扩增并检测等量的靶核酸和内部对照核酸的扩增子拷贝。因此,(CTQS–CT靶标)与对数(靶标浓度/QS浓度)呈线性。在该背景下,QS表示充当定量标准品核酸的内部对照核酸。然后,可以例如通过使用如下述方程式中的多项式校准式计算滴度T:
T’=10(a(CTQS–CT靶标)2+b(CTQS–CT靶标)+c)
多项式常数和定量标准品核酸的浓度是已知的,因此该方程式中的唯一变量是差(CTQS–CT靶标)。
此外,内部对照核酸可以充当“定性内部对照核酸”。“定性内部对照核酸”对于证实定性检测测定的测试结果的有效性而言是特别有用的:即使在阴性结果的情况下,也必须检测定性内部对照,否则认为测试自身是无效的。但是,在定性方案中,在阳性结果的情况下不一定必须检测。因此,其浓度必须是相对低的。必须小心地使它适应各种测定及其灵敏度。例如,定性内部核酸(即第二对照核酸)的浓度范围会包含每个反应1个拷贝至每个反应1000个拷贝的范围。关于各个测定的检测限度(LOD),其浓度是在测定的LOD和LOD的25倍值之间,或在LOD和10倍LOD之间。或者,它是在2倍和10倍LOD之间。或者,它是在5倍和10倍LOD之间。或者,它是5倍或10倍LOD。
在本文中,所述内部对照核酸不限于特定序列。可以有利的是,向流体样品添加不同的内部对照核酸,但是仅使用其中一种进行扩增,例如通过仅添加针对所述内部对照核酸之一的引物。在这样的实施方案中,本领域技术人员可以选择要在某个实验中扩增的内部对照核酸,由此增加要实施的分析的灵活性。在特别有利的实施方案中,所述不同的内部对照核酸可以被单个核酸构建体(例如质粒或不同的合适核酸分子)包含。
因此,本发明的一个方面是上述的方法,其中在步骤a中添加超过一种内部对照核酸,但是在步骤g中仅扩增所述内部对照核酸中的一种。
上述结果可以是掺杂的,并且例如包含假阳性(在与来自流体样品以外的来源的核酸交叉污染的情况下)。具体地,前者实验的扩增物可以促成这样的不希望的效果。一种用于使核酸扩增的交叉污染的效应最小化的特定方法描述在美国专利号5,035,996中。所述方法包括:将非常规核苷酸碱基(诸如dUTP)引入扩增产物中,并将遗留产物暴露于酶和/或物理化学处理以使产物DNA不能充当后续扩增的模板。用于这样的处理的酶是本领域已知的。例如,尿嘧啶-DNA糖基化酶(也被称作尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG)会从含有所述碱基的PCR产物中除去尿嘧啶残基。所述酶处理导致污染性遗留PCR产物的降解,并且用来使扩增反应“停止(sterilize)”。
因而,本发明的一个方面是上述的方法,所述方法还包括在步骤d)和步骤e)之间的以下步骤
● 在一定条件下用酶处理流体样品,其中将来自其它样品的交叉污染性核酸的扩增产物酶促降解;
● 将所述酶灭活。
例如,所述酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。
在如上所述的方法中,所有步骤可以是自动化的。“自动化”意味着,方法的步骤适合于用仪器或机器实施,所述仪器或机器能够在很少或没有人工外部控制或影响的情况下运行。仅可能必须手工完成该方法的制备步骤,例如必须将贮存容器填充和放置就位,样品的选择必须人工实施,以及本领域技术人员已知的其它步骤,例如控制计算机的操作。仪器或机器可以例如自动地添加液体,混合样品或在特定温度实施温育步骤。通常,这样的机器或仪器是由计算机控制的机器人,所述计算机实施程序,在其中规定单个步骤和命令。
本发明的另一个方面是用于分离和同时扩增可能存在于流体样品中的至少两种靶核酸的分析***(440),所述分析***包含下列模块:
●包含固体支持材料的分离站(230),所述分离站被构建和排列为分离并纯化在流体样品中包含的靶核酸
●包含至少两个反应容器的扩增站(405),所述反应容器包含扩增试剂、在至少第一反应容器中的至少第一纯化的靶核酸和在至少第二反应容器中的至少第二纯化的靶核酸(其中所述第二靶核酸在所述第一反应容器中不存在)、内部对照核酸和具有逆转录酶活性的聚合酶,所述聚合酶还包含突变,该突变赋予相对于相应野生型聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。
“分析***”是以分析给定的样品为最终目的的、彼此相互作用的组件(诸如仪器)的排列。所述分析***的优点与上文关于所述方法描述的优点相同。
在本文中,分析***(440,图11)可以是包含用于分离和/或纯化分析物的模块(401)的***(440)。此外,***(440)可以另外包含用于分析所述分析物以获得可检测信号的模块(403)。可以在相同模块(401、402、403)中或者可替换地在分开的模块中检测可检测信号。本文中使用的术语“模块”指分析仪(400)内的任何在空间上确定的位置。两个模块(401、403)可以被壁分开,或者可以处于开放关系。任一个模块(401、402、403)可以被自主地控制,或者模块(401、402、403)的控制可以与其它模块共享。例如,在中央控制所有模块。模块(401、402、403)之间的转移可以是手工的或自动化的。因而,公开了自动化分析仪(400)的许多不同实施方案。
在上文描述了“分离站”。
“扩增站”包含用于温育至少两个反应容器的内容物的控温培养箱。它进一步包含多个反应容器如管或板,在其中发生用于分析样品的反应诸如PCR。这样的容器的外部界限或壁是化学惰性的,使得它们不会干扰在内部发生的扩增反应。为了易于操作并促进自动化,可以将至少两个反应容器在整体排列中组合,所以可以一起操作它们。
结果,本发明的一个方面是上述的分析***,其中将所述至少两个反应容器在整体排列中组合。
整体排列可以是例如可逆地或不可逆地彼此附着或在架中排列的小瓶或管。例如,所述整体排列是多孔板。
例如,所述多孔板被容纳在保持站中。在一个实施方案中,一个处理机将多孔容器从保持站运输到气锁(460),第二处理机将所述多孔板从所述气锁运输到所述扩增站,其中两个处理机通过形式锁定相互作用与所述多孔板相互作用。
在一个实施方案中,所述分析***是全自动化的。
在一个实施方案中,在所述***的站之间运输在整体排列中组合的至少两个反应容器。
在第二个实施方案中,将纯化的靶核酸从所述分离站转移至所述扩增站。例如,用包含附有移液管尖部的移液管的移液器转移包含纯化的核酸的液体。
在第三个实施方案中,将纯化的核酸从所述分离站转移至在保持站中容纳的整体排列中的反应容器。例如,然后将整体排列中的所述反应容器从所述保持站转移至所述扩增站。
所述分析***可以进一步包含移液单元。所述移液单元可以包含至少一个移液管,或多个移液管。在一个实施方案中,所述多个移液管在一个或多个整体排列中组合,在所述整体排列内可以个别地操作移液管。移液管可以是如上所述的包含移液管尖部的移液管。在另一个实施方案中,所述移液管是移液针头。
可替换地,可以将用于分离站中的样品制备并含有包含纯化的靶核酸的流体的反应容器或反应容器排列从分离站转移至扩增站。
为此目的,所述分析***可以进一步包含转移单元,所述转移单元包含机器人装置,所述装置包含处理机。
例如,上述的分析***(440)进一步包含一个或多个选自以下的元件:
●用于检测由分析物引起的信号的检测模块(403)
●密封器(410)
●用于试剂和/或一次性用品的贮存模块(1008)。
●用于控制***组件的控制单元(1006)。
“检测模块”(403)可以是例如用于检测扩增操作的结果或效果的光学检测单元。光学检测单元可以包含光源,例如氙灯,用于引导和过滤光的光学器件诸如镜、透镜、滤光片、纤维光学器件,一个或多个参照通道,或CCD照相机或不同的照相机。
“密封器”(410)被构建和排列为密封与所述分析***结合使用的任何容器。这样的密封器可以例如用合适的盖密封管,或用箔或其它合适的密封材料密封多孔板。
“贮存模块”(1008)贮存必要的试剂以实现对于流体样品的分析而言重要的化学或生物学反应。它还可以包含其它组件,例如一次性用品诸如移液管尖部或要在分离站和/或扩增站内用作反应容器的容器。
例如,所述分析***可以进一步包含用于控制***组件的控制单元。
这样的“控制单元”(1006)可以包含软件,所述软件用于确保所述分析***的不同组件正确地且在正确的时机工作并相互作用,例如以协调方式移动并操作组件诸如移液管。所述控制单元还可以包含运行实时操作***(RTOS)(其是意图用于实时应用的多任务操作***)的处理器。换而言之,该***处理器能够管理实时约束,即从事件到***应答的操作最后期限(与***加载无关)。其实时控制***内的不同单元根据给定的指令正确地运行并应答。
在一个实施方案中,本发明涉及用于处理分析物的分析***(440),其包含
a.第一位置,该第一位置包含以线性排列且包含流体样品(1010)的第一插座(1001)、包含以nxm排列且用于容纳流体样品(1011)的插座(103)的加工板(101)、包含线性排列的至少两个移液单元(702)的第一移液装置(700)(其中所述移液单元(702)与移液管尖部(3、4)偶联)、以及包含以ax(nxm)排列的移液管尖部(3、4)的尖部架(70);
b.第二位置,该第二位置包含用于所述加工板(101)的托架(201、128)、用于多孔板的托架(330)、用于所述尖部架(70)的托架(470)和第二移液装置(35),所述第二移液装置(35)包含以nxm排列且与移液管尖部(3、4)偶联的移液单元(702)(图12)。本文中使用的术语“托架”指能够接受支架或加工板的任何排列。
分析***(440)的优点如上面关于所述方法所述。
例如,第一移液装置(700)的所述移液单元(702)的位置是可变的。所述第一移液装置(700)的示例性实施方案在下文中描述。
在一个实施方案中,所述尖部架(70)包含以ax(nxm)排列的移液管尖部(3、4)。例如,在尖部架(70)中包含第一类(4)和第二类(3)移液管尖部。在该实施方案中,第一类移液管尖部(4)以nxm排列形式排列,且第二类移液管尖部(3)以nxm排列形式排列。在该背景下,“n”指行数且m指列数,其中n是6且m是8。例如,第一类移液管尖部(4)具有与第二类移液管尖部(3)不同的体积,或者,第一类移液管尖部(4)的体积超过500 ul,且第二类移液管尖部(3)的体积小于500 ul。在该实施方案中,a=2。但是,可以存在超过两类移液管尖部,且因此a>2。
在一个方面,分析***(440)包含用于向所述加工板(101)的各个位置分配样品类型和各个测试的控制单元(1006)。例如,所述位置是分开的室(401、402)。
在一个方面,所述***另外包含转移***(480),其用于在第一(402)和第二(401)位置之间转移所述加工板(101)和所述架(70)。所述转移***(480)的实施方案是传送带,或一个或多个处理机。
此外,例如,所述第二移液装置(35)的所述移液器单元与在第一位置(402)使用的移液管尖部(3、4)衔接。
***(440)的一个实施方案另外包含第三站(403),所述第三站包含控温培养箱,其用于将所述分析物与获得可检测信号所必需的试剂一起温育。此***的另外实施方案在下文中描述。
用第一处理器(1004)和第二处理器(1005)实现样品和测试对nxm排列的定位的更加优化控制,所述第一处理器(1004)被包含在所述第一位置(402)中且所述控制单元(1006)向其转移指令,所述指令用于将样品类型和各个测试分配到加工板(101)的容器(103)的nxm排列中的特定位置,所述第二处理器(1005)被包含在所述第二位置(401)中且所述控制单元(1006)向其转移指令,所述指令用于将样品类型和各个测试分配到加工板的容器(103)的nxm排列中的特定位置。
例如,所述***另外包含位于所述第一位置的第一处理器和位于所述第二位置的第二处理器。
例如,所述第一处理器(1004)控制所述第一移液装置(700),且所述第二处理器(1005)控制所述第二移液装置(35)。
附图说明
图1:
如在本发明的一个实施方案中使用的样品制备工作流的示意图。
朝下的箭头表示向上文提及的深孔板的每个相应孔添加组分或试剂,朝上的箭头表示它们各自的除去。这些动作在步骤2、3、4、21和22中手工实施,在步骤10、14、16、18和24中通过仪器的处理头(process head)实施,以及在步骤5、6、7、11、15和19中通过仪器的试剂头(reagent head)实施。
必须理解,可以在本发明的精神内灵活地调节使用的体积,例如,至少约多至公开值的30%。具体地,在步骤2的情况下,例如,样品体积可以是可变的,以便考虑流体样品的不同类型,其可以需要或多或少的起始材料来获得正确的结果,如技术人员已知的。例如,所述范围是约100 ul至约850 ul。或者,它是约100 ul、约500 ul或约850 ul。例如,在步骤3中用稀释剂将各个容器中的体积调至相同的总体积。例如,如在图1所示的方案中,总体积合计多至约850 ul。
图2:
如实施例1中描述的,在LightCycler480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,DE)上实施从HIV、HBV和CT衍生的靶核酸的扩增的生长曲线。在y轴上标示的“信号”是标准化的荧光信号。x轴显示了各个PCR循环的数目。
与相应的内部对照核酸的生长曲线一起显示了HIV和HBV的生长曲线。各靶核酸曲线用直线表示,对照核酸曲线用虚线表示。
图2a: 定性HIV测定,其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2b: 定性HIV测定,其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2c: 定量HIV测定,其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2d: 定量HIV测定,其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2e: 定量HBV测定,其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2f: 定量HBV测定,其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2g: CT测定,其在用于检测靶探针的通道中测量。
图3:加工板的透视图。
图4: 从对角看,加工板的透视图。
图5:加工板的顶视图。
图6:沿加工板较长侧的横截面视图。
图7:横截面视图的部分视图。
图8: 加工板较长侧的透视图。
图9:a)至d)显示磁性分离站的第二个实施方案的不同视图。
图10:(a)至(c)显示容纳加工板的磁性分离站的第一个实施方案的视图,第一类磁体在最高的Z位置,第二类磁体在最低的Z位置。
图11:包含不同站、模块或室的分析仪的示意图。
图12:显示本发明的分析***。
图13:根据实施例2中的数据,EDTA血浆中的定量HBV测定的线性。
图14:根据实施例2中的数据,血清中的定量HBV测定的线性。
图15:根据实施例2中的数据,EDTA血浆中的定量HCV测定的线性。
图16:根据实施例2中的数据,血清中的定量HCV测定的线性。
图17:根据实施例2中的数据,EDTA血浆中的定量HIV测定的线性。
实施例
提供下述实施例来解释、而不是限制要求保护的发明。
实施例1:
本实施例描述了一种用于分离和同时扩增至少第一和第二靶核酸的方法,其使用单一通用内部对照核酸。
简而言之,在描述的实施方案中,对一组数种不同靶标同时且在相同条件下实施实时PCR,所述靶标包含细菌(砂眼衣原体,CT)以及DNA病毒(HBV)和RNA病毒(HIV)。将所有样品分别在相同实验内即在相同深孔板(用于样品制备)或多孔板(用于扩增和检测)上加工并分析。
制备下列样品并随后分析:
试剂 | 生产商: |
HIV-1M二级标准品, 50'000 cp/ML | Roche |
HBV二级标准品, 400 IU/ml | Roche |
CT (DNA POS CTL pCHL-1) | Roche |
技术人员可获得合适的标准品或其它类型的靶标。
根据各个生产商的说明书使用在下表中列出的仪器:
仪器 | 生产商 |
Hamilton Star | Hamilton Medical AG (Bonaduz, CH) |
Light Cycler 480 | Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, DE) |
Chameleon Sealer | K biosystems (Essex, UK) |
Compressor | K biosystems (Essex, UK) |
对于样品制备,使用下列试剂作为稀释剂:
试剂 | 生产商: |
PreservCyt | Thin Prep |
K3 EDTA血浆,PCR阴性 | Roche |
预先制备下列稀释物,并贮存过夜(血浆稀释物在-60至-90℃,PreservCyt稀释物在2-8℃):
将每份相应的样品(500 ul)和每份相应的样本稀释剂(350 ul)手工地移入深孔板中,其中将每份样品添加至三个不同的孔用于一式三份分析。向每个含有HIV或HBV样品的孔手工地添加50 ul内部对照核酸。对于定性HIV测定,添加充当定性对照的RNA(100个装甲颗粒/样品)。对于定量HIV测定,添加充当定量标准品的RNA(500个装甲颗粒/样品)。对于定量HBV测定,添加充当定量标准品的DNA(1E4个拷贝/样品)。所述对照核酸的序列在所有情况下是相同的,并且选自SEQ ID NO 45-48的组。
将各种对照核酸在下列缓冲液中贮存:
IC/IQS - 贮存缓冲液 | 浓度或pH |
Tris (mM) | 10 |
EDTA (mM) | 0.1 |
叠氮化钠(w/v,%) | 0.05 |
聚rA RNA (mg/l) | 20 |
pH | 8 |
遵循根据图1所示方案的工作流并使用下列试剂,在Hamilton Star (Hamilton,Bonaduz, CH)上实施样品制备:
蛋白酶试剂 | 浓度或pH |
Tris (mM) | 10 |
EDTA (mM) | 1 |
氯化钙(mM) | 5 |
醋酸钙(mM) | 5 |
Esperase (mg/ml) | 80 |
甘油(w/v,%) | 50 |
pH | 5.5 |
MGP试剂 | 浓度或pH |
MPG粉末(mg/ml) | 60 |
Tris (mM) | 30 |
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) | 0.1 |
叠氮化钠(w/v,%) | 0.095 |
pH | 8.5 |
裂解试剂 | 浓度或pH |
硫氰酸胍(M) | 4 |
柠檬酸钠(mM) | 50 |
Polydocanol (w/v,%) | 5 |
二硫苏糖醇(w/v,%) | 2 |
pH | 5.8 |
洗涤缓冲液 | 浓度或pH |
柠檬酸钠(mM) | 7.5 |
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) | 0.1 |
pH | 4.1 |
洗脱缓冲液 | 浓度或pH |
Tris (mM) | 30 |
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) | 0.2 |
pH | 8.5 |
在最终的步骤以后,Hamilton Star仪器的处理头将含有扩增试剂的各主混合物(Mmx)添加至每孔,将含有分离的核酸的流体与Mmx混合,并将每种所得的混合物转移至在其中实施扩增的微孔板的相应孔。
使用下列主混合物(各由两种试剂R1和R2组成):
对于HIV:
R1试剂 | 浓度/50µl-PCR [µM] |
水(PCR级) | |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'000 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲[%] | 0.018 |
R2试剂 | 浓度/50µl-PCR [µM] |
DMSO [%] | 5.000% |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲[%] | 0.027% |
乙酸钾pH 7.0 | 110'000 |
甘油[%] | 3.000% |
Tricine pH 8.0 | 50'000 |
Igepal [%] | 0.024% |
dGTP | 337.5 |
dATP | 337.5 |
dCTP | 337.5 |
dUTP | 675 |
选自SEQ ID NO 1-35的引物/探针 | 0.1-0.15 |
SEQ ID NO 42 | 0.1 |
SEQ ID NO 43 | 0.1 |
SEQ ID NO 44 | 0.1 |
尿嘧啶-N-糖基化酶 | 10 (U/反应) |
Z05-D聚合酶 | 40 (U/反应) |
NTQ21-46A - 适体 | 0.222 |
水 |
对于HBV:
对于CT:
R1试剂 | 浓度/50µl-PCR |
水(PCR级) | |
Mn(Ac)2 (pH 6.5在0.002%(V/V)冰醋酸中) | 2.7 mM |
NaN3 | 0.0135%(W/V) |
R2试剂 | 浓度/50µl-PCR |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲[%] | 0.0315% |
乙酸钾 | 112.4 mM |
甘油[%] | 3.5% |
Tricine | 61 mM |
氢氧化钾 | 28.4 mM |
dGTP | 525 uM |
dATP | 525 uM |
dCTP | 525 uM |
dUTP | 1.05 mM |
SEQ ID NO 39 | 750 nM |
SEQ ID NO 40 | 600 nM |
SEQ ID NO 41 | 116 nM |
适体NTQ-46A | 175 nM |
尿嘧啶-N-糖基化酶 | 5 U/反应 |
Z05-D聚合酶 | 31 U/反应 |
对于扩增和检测,将微孔板用自动化的板密封器(参见上面)密封,并将板转移至LightCycler 480 (参见上面)。
使用下列PCR概况:
热循环概况
检测形式(手工地)
预PCR程序包含初步变性和在55、60和65℃温育以反转录RNA模板。在三个温度温育会组合以下有利效果:在较低的温度,也转录轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体),而在较高的温度,抑制RNA二级结构的形成,由此导致更有效的转录。
将PCR循环分成两次测量,其中两次测量都应用一步方案(组合退火和延伸)。在55℃的前5个循环通过预扩增轻微错配的靶序列而允许增加的包容性,而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供增加的特异性。
对在上文提及的微孔板上包含的所有样品使用此概况,在所有样品中都实现了扩增和检测,如在图2中描绘的。这表明,也成功地实施了扩增前的样品制备。
为了清楚,在图2中分别描绘了定性和定量HIV内部对照以及定量HBV内部对照的结果。可以看出,在所有情况下也成功地扩增了对照。通过与充当定量标准品的内部对照核酸对比,计算定量方案中的HIV和HBV靶标的定量。
实施例2:
在单独的实验中但是在相同的条件下对多种不同靶核酸实施在上文中描述的通用扩增方法。如在实施例1下所述,实施各种核酸的分离。
各种通用内部对照核酸选自SEQ ID NO 45-49,并且是装甲RNA(对于RNA靶标)和λ包装的DNA(对于DNA靶标)。对于定性RNA测定,每份样品添加300个颗粒,对于定量RNA测定,每份样品添加3000个颗粒,且对于所有DNA测定,每份样品添加500个颗粒。
对所有靶标使用下列PCR概况:
名称 | 循环数 |
预-PCR | 1 |
第1次测量 | 5 |
第2次测量 | 45 |
冷却 | 1 |
详细地,实施以下实验:
1. HBV、HCV和HIV的定性多路分析
a. 主混合物
R1:
试剂 | 在50 ul-PCR中的浓度(uM) |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'300 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.018 |
pH | 6.41 |
R2:
试剂 | 在50 ul-PCR中的浓度(uM) |
DMSO (%) | 5.4 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.027 |
KOAc (pH 7.0) | 120'000 |
甘油(%) | 3 |
吐温20 (%) | 0.015 |
Tricine pH 8.0 | 60'000 |
NTQ21-46A - 适体 | 0.2222 |
尿嘧啶-N-糖基化酶(U/uL) | 0.2 |
dGTP | 400.0 |
dATP | 400.0 |
dCTP | 400.0 |
dUTP | 800.0 |
ZO5-D聚合酶(U/ul)* | 0.9 |
选自SEQ ID NO 1-35的引物/探针 | 0.125-0.3 |
SEQ ID NO 36 | 0.100 |
SEQ ID NO 37 | 0.100 |
SEQ ID NO 38 | 0.150 |
选自SEQ ID NO 60-76的引物/探针 | 0.050-0.250 |
SEQ ID NO 42 | 0.200 |
SEQ ID NO 43 | 0.200 |
SEQ ID NO 44 | 0.100 |
分析灵敏度/LOD
对于每种检测的病毒(HIV-1组M、HIV-1组O、HIV-2、HBV和HCV),针对EDTA-血浆,在处于预期LOD及其附近的数个浓度/水平。以每个浓度至少20个有效重复,将每个病毒和浓度测试一组。通过PROBIT分析来确定LOD(参见表1-5)。
HIV
表1: 来自单个组的HIV-1组M命中率和Probit LOD
将HIV-1组M的WHO标准的滴度转化成IU/mL。
因此,以IU/mL为单位的HIV-1组M LOD是
通过PROBIT分析(95%命中率)确定的LOD :6.77 IU/mL
通过PROBIT分析确定的LOD的95%置信区间:4.75 - 15.4 IU/mL。
表2: 来自单个组的HIV-1组O命中率和Probit LOD
将HIV-1组O的一级标准品的滴度再分配给CBER HIV-1组O小组;计算因子是0.586。
因此,HIV-1组O LOD是
通过PROBIT分析(95%命中率)确定的LOD :8.8 cp/mL
通过PROBIT分析确定的LOD的95%置信区间:6.4 - 18.5 cp/mL。
表3: 来自单个组的HIV-2命中率和Probit LOD
将HIV-2的一级标准品的滴度再分配给CBER HIV-2小组;计算因子是26.7。
因此,HIV-2 LOD是
通过PROBIT分析(95%命中率)确定的LOD :34.44 cp/mL
通过PROBIT分析确定的LOD的95%置信区间:21.89 - 83.04 cp/mL。
HBV
表4: 来自单个组的HBV命中率和Probit LOD
HCV
表5: 来自单个组的HCV命中率和Probit LOD
2. WNV的定性分析
主混合物
R1:
试剂 | 在50 ul-PCR中的浓度(uM) |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'300 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.018 |
pH | 6.41 |
R2:
试剂 | 在50 ul-PCR中的浓度(uM) |
DMSO (%) | 5.4 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.027 |
乙酸钾pH 7.0 | 120'000 |
甘油(%) | 3 |
吐温20 (%) | 0.015 |
Tricine pH 8.0 | 60'000 |
NTQ21-46A - 适体 | 0.2222 |
尿嘧啶-N-糖基化酶(U/uL) | 0.2 |
dGTP | 400.0 |
dATP | 400.0 |
dCTP | 400.0 |
dUTP | 800.0 |
ZO5-D聚合酶(U/ul)* | 0.9 |
选自SEQ ID NO 53-59的引物/探针 | 0.08-0.4 |
SEQ ID NO 42 | 0.150 |
SEQ ID NO 43 | 0.150 |
SEQ ID NO 44 | 0.100 |
分析灵敏度/LOD
对于病毒(WNV、SLEV和JEV),将独立的小组制备为各个标准品的稀释系列,包括处于预期LOD及其附近的数种浓度/水平。以每个浓度至少20个有效重复,将每种病毒和浓度测试一个小组。通过PROBIT分析来确定LOD。
表6: 来自单个组的WNV命中率和Probit LOD
表7: 来自单个组的SLEV命中率和Probit LOD
表8: 来自单个组的JEV命中率和Probit LOD
3. HBV的定量分析
主混合物
R1:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度(uM) |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'300 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.018 |
pH | 6.41 |
R2:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度(uM) |
甘油(%, w/v) | 3% |
Tricine | 60 mM |
DMSO (%, v/v) | 5.4% |
KOAc | 120 mM |
吐温20 (v/v) | 0.015% |
适体NTQ21-46 A | 0.222µM |
ZO5D聚合酶 | 0.9 U/µL (45 U/rxn) |
尿嘧啶-N-糖基化酶 | 0.2 U/µL (10 U/rxn) |
叠氮化钠(w/v) | 0.027% |
dCTP | 400µM |
dGTP | 400µM |
dATP | 400µM |
dUTP | 800µM |
SEQ ID NO 36 | 1.2µM |
SEQ ID NO 37 | 1.2µM |
SEQ ID NO 50 | 0.6µM |
SEQ ID NO 51 | 0.6µM |
SEQ ID NO 38 | 0.1µM |
SEQ ID NO 52 | M |
分析灵敏度/LOD
用HBV二级标准品(代表基因型A)制备四个稀释小组,即在HBV阴性血清中的两个(对于200 μL和500 μL的样品输入体积)和在HBV阴性EDTA-血浆中的两个(对于200 μL和500 μL的样品输入体积)。每个小组包括处于预期LOD及其附近的7个浓度水平。以每个浓度水平≥21个重复,每种基质测试一个小组。需要至少20个重复是有效的。通过在95%命中率的PROBIT分析以及通过≥95%命中率分析来确定LOD。
表9: 对EDTA-血浆中200 μL输入体积的LOD分析. *
*测试额外的重复以使观察的95%置信区间变窄。
表10: 对EDTA血浆中500 μL输入体积的LOD分析
表11: 对血清中200 μL输入体积的LOD分析
表12: 对血清中500 μL输入体积的LOD分析
总结LOD:
EDTA-血浆:对于EDTA血浆,在95%命中率的PROBIT分析产生8.2 IU/mL (对于200 μL样品输入体积)和2.3 IU/mL (对于500 μL样品输入体积)的LOD。
这些浓度的95%置信区间范围是4.8 - 26.0 IU/mL (对于200 μL样品输入体积)和1.6 - 4.2 IU/mL (对于500 μL样品输入体积)。
血清:对于血清,在95%命中率的PROBIT分析产生9.02 IU/mL (对于200 μL样品输入体积)和4.1 IU/mL (对于500 μL样品输入体积)的LOD。
这些浓度的95%置信区间范围是6.2 - 19.0 IU/mL (对于200 μL样品输入体积)和2.4 - 10.0 IU/mL (对于500 μL样品输入体积)。
线性
通过使用HBV基因型A (由RMD Research Pleasanton提供,线性化的质粒, pHBV-PC_ADW2)制备一个EDTA-血浆小组和一个血清小组。在12个浓度水平分析每个小组以确定所述测定的预期动态范围(4 - 2E+09 IU/mL)。在21个重复中测试所有浓度水平/小组成员(PM)。
用500 μL的样品输入体积完成该研究。如下选择浓度水平:一个水平低于预期的定量下限(LLOQ),一个处于预期的LLOQ,一个高于预期的LLOQ,数个浓度处于中间水平,处于预期的定量上限(ULOQ),和一个高于预期的ULOQ:
PM 12 - 2.0E+09 IU/mL - 高于预期的ULOQ
PM 11 - 1.0E+09 IU/mL - 处于预期的ULOQ
PM 10 - 1.0E+08 IU/mL - 低于预期的ULOQ
PM 9 - 1.0E+07 IU/mL - 中间浓度水平
PM 8 - 1.0E+06 IU/mL - 中间浓度水平
PM 7 - 1.0E+05 IU/mL - 中间浓度水平
PM 6 - 1.0E+04 IU/mL - 中间浓度水平
PM 5 - 1.0E+03 IU/mL - 中间浓度水平
PM 6a - 2.0E+02 IU/mL - 中间浓度水平(将PM6稀释至2.0E+02 IU/mL, 用于血清小组的滴度分配)
PM 4 - 1.0E+02 IU/mL - 中间浓度水平(也用于血浆小组的滴度分配)
PM 3 - 5.0E+01 IU/mL - 高于预期的LLOQ
PM 2 - 1.0E+01 IU/mL - 处于预期的LLOQ
PM 1 - 4.0E+00 IU/mL低于预期的LLOQ。
对于线性小组的每份有效样品,将观察到的HBV DNA滴度转化为log10滴度,并且为每个浓度水平计算平均log10滴度。
表13:EDTA血浆中的线性
名义滴度(IU/mL) | 分配的滴度(IU/mL) | 分配的Log10滴度 | 平均Log 10观察到的滴度 | 重复 |
4.00E+00 | 3.50E+00 | 0.54 | 0.52 | 17 |
1.00E+01 | 8.70E+00 | 0.94 | 0.91 | 21 |
5.00E+01 | 4.40E+01 | 1.64 | 1.69 | 21 |
1.00E+02 | 8.70E+01 | 1.94 | 2.04 | 21 |
1.00E+03 | 8.70E+02 | 2.94 | 3.01 | 21 |
1.00E+04 | 8.70E+03 | 3.94 | 3.9 | 21 |
1.00E+05 | 8.70E+04 | 4.94 | 4.88 | 21 |
1.00E+06 | 8.70E+05 | 5.94 | 5.87 | 21 |
1.00E+07 | 8.70E+06 | 6.94 | 6.92 | 21 |
1.00E+08 | 8.70E+07 | 7.94 | 8.01 | 21 |
1.00E+09 | 8.70E+08 | 8.94 | 9.04 | 21 |
2.00E+09 | 1.70E+09 | 9.24 | 9.38 | 21 |
在图13中显示了该结果的图解描绘。
表14: 血清中的线性
名义滴度(IU/mL) | 分配的滴度(IU/mL) | 分配的Log10滴度 | 平均Log 10观察到的滴度 | 重复 |
4.00E+00 | 3.30E+00 | 0.52 | 0.7 | 21 |
1.00E+01 | 8.30E+00 | 0.92 | 0.99 | 21 |
5.00E+01 | 4.10E+01 | 1.62 | 1.73 | 21 |
1.00E+02 | 8.30E+01 | 1.92 | 2.03 | 21 |
1.00E+03 | 8.30E+02 | 2.92 | 2.93 | 21 |
1.00E+04 | 8.30E+03 | 3.92 | 3.8 | 21 |
1.00E+05 | 8.30E+04 | 4.92 | 4.78 | 21 |
1.00E+06 | 8.30E+05 | 5.92 | 5.75 | 21 |
1.00E+07 | 8.30E+06 | 6.92 | 6.73 | 21 |
1.00E+08 | 8.30E+07 | 7.92 | 7.78 | 21 |
1.00E+09 | 8.30E+08 | 8.92 | 8.92 | 21 |
2.00E+09 | 1.70E+09 | 9.22 | 9.22 | 21 |
在图14中显示了该结果的图解描绘。
总结线性:
将线性范围(定义为平均Log 10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴度±0.3内的浓度范围)确定为:对于EDTA-血浆而言的3.5E+00 IU/mL - 1.7E+09 IU/mL,和对于血清而言的3.3E+00 IU/mL - 1.7E+09 IU/mL。发现定量下限为:对于EDTA-血浆和血清而言的4.0E+00 IU/mL。
4. HCV的定量分析
主混合物
R1:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度(uM) |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'300 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.018 |
pH | 6.41 |
R2:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度 |
甘油(%, w/v) | 3% |
Tricine | 60 mM |
DMSO (%, v/v) | 5.4% |
KOAc | 120 mM |
吐温20 (v/v) | 0.015% |
NTQ21-46 A | 0.222µM |
ZO5D | 0.9 U/µL (45 U/rxn) |
UNG | 0.2 U/µL (10 U/rxn) |
叠氮化钠(w/v) | 0.027 |
dCTP | 400µM |
dGTP | 400µM |
dATP | 400µM |
dUTP | 800µM |
选自SEQ ID NO 60-76的引物/探针 | 0.1µM |
SEQ ID NO 42 | 0.3µM |
SEQ ID NO 43 | 0.3µM |
SEQ ID NO 44 | µM |
分析灵敏度/LOD
使用200 μL和500 μL的样品输入体积,在HCV阴性EDTA血浆和血清中用Roche HCV二级标准品制备稀释小组。用21个重复测试每个浓度水平。至少≥20个重复必须是有效的。通过在95%命中率的PROBIT分析及通过≥95%命中率分析来确定LOD。
表15: 对于EDTA-血浆而言使用200 μL样品处理输入体积的命中率和Probit
表16: 对于EDTA-血浆而言使用500 μL样品处理输入体积的命中率和Probit
表17: 对于血清而言使用200 μL样品处理输入体积的命中率和Probit
表18: 对于血清而言使用500 μL样品处理输入体积的命中率和Probit
总结LOD:
1.对于EDTA血浆,在95%命中率的PROBIT分析产生17.4 IU/mL (对于200 μL样品处理输入体积)和9.0 IU/mL (对于500 μL样品处理输入体积)的LOD。这些浓度的95%置信区间是12.1 - 34.3 IU/mL (对于200 μL样品处理输入体积)和5.5 - 25.4 IU/mL (对于500 μL样品处理输入体积)。
2. 对于血清,在95%命中率的PROBIT分析的值是20.2 IU/mL(对于200 μL样品处理输入体积)和8.2 IU/mL (对于500 μL样品处理输入体积)。这些浓度的95%置信区间是14.0 -39.3 IU/mL (对于200 μL样品处理输入体积)和5.8 - 15.0 IU/mL (对于500 μL样品处理输入体积)。
线性
分析起源于HCV WHO标准的HCV aRNA的EDTA-血浆小组的1个制备物和血清小组的一个制备物。通过系列稀释制备线性小组,并在10个不同浓度分析。用500 μL样品处理输入体积完成该研究。如下选择浓度:一个水平低于预期的定量下限(LLoQ),一个处于LLoQ,一个高于LLoQ,数个浓度处于中间水平,处于预期的定量上限(ULoQ),一个处于或高于ULoQ。对于所有浓度,测试21个重复。
PM 1 - 2.0E+08 IU/mL - 高于预期的ULoQ
PM 2 - 1.0E+08 IU/mL - 处于预期的ULoQ
PM 3 - 1.0E+07 IU/mL - 低于预期的ULoQ
PM 4 - 1.0E+06 IU/mL - 中间浓度水平
PM 5 1.0E+05 IU/mL - 中间浓度水平
PM 6 - 1.0E+04 IU/mL–用于滴度分配的中间浓度水平
PM 7 - 1.0E+03 IU/mL - 中间浓度水平
PM 8 - 1.0E+02 IU/mL - 高于预期的LLoQ
PM 9 - 1.0E+01 IU/mL - 处于预期的LLoQ
PM 10 - 8.0E+00 IU/mL - 低于预期的LloQ。
表19: 在EDTA血浆中的线性
名义滴度(IU/mL) | 分配的滴度(IU/mL) | 分配的Log10滴度 | 平均Log 10观察到的滴度 | 重复 |
8.00E+00 | 4.87E+00 | 0.7 | 0.6 | 15 |
1.00E+01 | 6.09E+00 | 0.8 | 0.8 | 17 |
1.00E+02 | 6.09E+01 | 1.8 | 1.7 | 21 |
1.00E+03 | 6.09E+02 | 2.8 | 2.8 | 21 |
1.00E+04 | 6.09E+03 | 3.8 | 3.8 | 21 |
1.00E+05 | 6.09E+04 | 4.8 | 4.7 | 21/20 |
1.00E+06 | 6.09E+05 | 5.8 | 5.6 | 21/20 |
1.00E+07 | 6.09E+06 | 6.8 | 6.7 | 21 |
1.00E+08 | 6.09E+07 | 7.8 | 7.8/7.7 | 21/18 |
2.00E+08 | 1.22E+08 | 8.1 | 8 | 21/20 |
在图15中显示了该结果的图解描绘。
表20:血清中的线性
名义滴度(IU/mL) | 分配的滴度(IU/mL) | 分配的Log10滴度 | 平均Log 10观察到的滴度 | 重复 |
8.00E+00 | 3.90E+00 | 0.6 | 0.7 | 10 |
1.00E+01 | 4.96E+00 | 0.7 | 0.7 | 14 |
1.00E+02 | 4.96E+01 | 1.7 | 1.6 | 21 |
1.00E+03 | 4.96E+02 | 2.7 | 2.8 | 21 |
1.00E+04 | 4.96E+03 | 3.7 | 3.7 | 21 |
1.00E+05 | 4.96E+04 | 4.7 | 4.7 | 21 |
1.00E+06 | 4.96E+05 | 5.7 | 5.7 | 21 |
1.00E+07 | 4.96E+06 | 6.7 | 6.7 | 21 |
1.00E+08 | 4.96E+07 | 7.7 | 7.7 | 21 |
2.00E+08 | 9.92E+07 | 8 | 8.1 | 21 |
在图16中显示了该结果的图解描绘。
总结线性:
将线性范围(定义为平均Log 10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴度±0.3内的浓度范围)确定为:对于EDTA-血浆而言的4.87E+00 IU/mL - 1.22E+08 IU/mL,和对于血清而言的3.90E+00 IU/mL - 9.92E+07 IU/mL。
5. HIV的定量分析
主混合物
R1:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度(uM) |
Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6.1,用乙酸调节) | 3'300 |
NaN3/Ri,用pH7的10 mM Tris缓冲 | 0.018 |
pH | 6.41 |
R2:
试剂 | 在50 ul-PCR中的最终浓度 |
甘油(%, w/v) | 3% |
Tricine | 60 mM |
DMSO (%, v/v) | 5.4% |
KOAc | 120 mM |
吐温20 (v/v) | 0.02% |
适体NTQ21-46 A | 0.222µM |
ZO5D聚合酶 | 0.9 U/µL (45 U/rxn) |
UNG | 0.2 U/µL (10 U/rxn) |
叠氮化钠(w/v) | 0.027 |
dCTP | 400µM |
dGTP | 400µM |
dATP | 400µM |
dUTP | 800µM |
选自SEQ ID NO 1-35的引物/探针 | 0.1µM-0.3µM |
SEQ ID NO 50 | 0.3µM |
SEQ ID NO 51 | 0.3µM |
SEQ ID NO 52 | µM |
分析灵敏度/LOD
对于200 μL和500 μL的样品输入体积,在HIV-1阴性EDTA血浆中用HIV-1M二级标准品制备稀释小组。用21个重复测试每个浓度水平。至少≥20个重复必须是有效的。通过在95%命中率的PROBIT分析及通过≥95%命中率分析来确定LOD。
表21:对EDTA-血浆中200 μL输入体积的LOD分析
表22: 500 μL输入体积的LOD分析
总结LOD
1. 在95%命中率的PROBIT分析产生41.8 cp/mL (对于200 μL输入体积)和18.9 cp/mL(对于500 μL输入体积)的LOD。
2. 这些浓度的95%置信区间是30.9 - 74.9 cp/mL (对于200 μL输入体积)和14.9 -29.4 cp/mL (对于500 μL输入体积)。
线性
在线性/动态范围/准确度研究中使用的样品由HIV-1细胞培养物上清液材料HIV-1组M亚型B的稀释小组组成。
通过系列稀释制备线性小组。在10个浓度水平分析此小组。
如下选择浓度:一个水平低于预期的定量下限(LLoQ),一个处于LLoQ,一个高于LLoQ,数个浓度处于中间水平,处于预期的定量上限(ULoQ),和一个高于ULoQ。对于所有浓度,测试21个重复。用500 μL输入体积完成该线性研究:
PM 1 - 2.0E+07 cp/mL - 高于预期的ULoQ
PM 2 - 1.0E+07 cp/mL - 处于预期的ULoQ
PM 3 - 1.0E+06 cp/mL - 低于预期的ULoQ
PM 4 - 1.0E+05 cp/mL - 中间浓度水平
PM 5 3.0E+04 cp/mL - 用于滴度分配的中间浓度水平
PM 6 - 1.0E+04 cp/mL - 中间浓度水平
PM 7 - 1.0E+03 cp/mL - 中间浓度水平
PM 8 - 1.0E+02 cp/mL - 中间浓度水平
PM 9 - 5.0E+01 cp/mL - 高于预期的LLoQ
PM 10 - 2.0E+01 cp/mL - 处于预期的LLoQ
PM 11 - 1.5E+01 cp/mL低于预期的LloQ。
表23:EDTA血浆中的线性
名义滴度(cp/mL) | 分配的滴度(cp/mL) | 分配的Log10滴度 | 平均Log 10观察到的滴度 | 重复 |
1.50E+01 | 1.50E+01 | 1.2 | 1.3 | 21 |
2.00E+01 | 2.00E+01 | 1.3 | 1.5 | 21 |
5.00E+01 | 5.10E+01 | 1.7 | 1.8 | 21 |
1.00E+02 | 1.00E+02 | 2 | 2 | 21 |
1.00E+03 | 1.00E+03 | 3 | 3 | 21 |
1.00E+04 | 1.00E+04 | 4 | 4 | 21 |
1.00E+05 | 1.00E+05 | 5 | 5 | 21 |
1.00E+06 | 1.00E+06 | 6 | 6 | 21 |
1.00E+07 | 1.00E+07 | 7 | 7 | 21 |
2.00E+07 | 2.00E+07 | 7.3 | 7.4 | 21 |
在图17中显示了该结果的图解描绘。
总结线性
将线性范围(定义为平均Log 10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴度±0.3内的浓度范围)确定为1.5E+01 cp/mL - 2.0E+07 cp/mL。
实施例3:
在以下情况下,使用在上文中关于核酸(RNA和DNA)的扩增描述的通用扩增方法可以导致过度定量:如果期望的靶核酸是DNA,但是存在显著量的RNA,使得不希望的RNA的扩增可以发生。一种消除不希望的RNA扩增的方法是采用RNA酶H,其降解存在于RNA-DNA杂交复合物中的RNA。因此为实施例2、部分3中描述的HBV的定量分析执行一个实验,例外是,在R2主混合物试剂中加入1个单元(每个50 μl PCR反应)的Hybridase™热稳定的RNA酶H(Epicentre, Madison, WI)或重组大肠杆菌RNA酶H (New England Biolabs, Ipswich,MA)。在RNA模板上(在每个反应30,000至3,000,000个拷贝之间)或在DNA模板上(在每个反应30-3000个拷贝之间)执行扩增。实验的结果显示在表24上。在有任一种RNA酶H酶存在下与DNA模板的反应未表明与在没有RNA酶H存在下的反应相比扩增效率的差异。相反,RNA模板的扩增被严重延迟或甚至缺失(对于HybridaseTM),清楚地表明在扩增之前加入的RNA酶H酶会降解RNA模板。
表24: RNA酶H对RNA和DNA扩增的影响
应当理解,本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的,并且提示本领域技术人员可以以此为依据做出各种变型或改变。
Claims (14)
1.一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸的方法,所述方法包括下述步骤:
- 使来自样品的所述DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶接触,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的寡核苷酸引物;
- 在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间;和
- 在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自选自CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶、栖热菌属种(Thermus sp.)sps17 DNA聚合酶、栖热菌属种Z05 DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶、非洲栖热腔菌(Termosipho africanus)DNA聚合酶和Thermus caldophilus DNA聚合酶的聚合酶。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶源自栖热菌属种Z05 DNA聚合酶。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法,所述方法还包括:扩增可能存在于所述样品中的RNA靶核酸。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法,其中所述DNA靶核酸源自乙型肝炎病毒(HBV)。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法,其中所述样品是流体样品。
8.一种用于扩增可能存在于样品中的DNA靶核酸并确定其量的方法,所述方法包括下述步骤:
- 在适合发生所述具有逆转录酶活性的聚合酶对RNA的转录的条件下在反应容器中将所述来自样品的DNA靶核酸与扩增试剂、RNA酶H和具有逆转录酶活性的聚合酶一起温育一段时间,所述扩增试剂包含至少一对在合适条件下与所述DNA靶核酸特异性地杂交的寡核苷酸引物;
- 在适合发生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的扩增反应的条件下在所述反应容器中将所述DNA靶核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述扩增试剂包含对所述DNA靶核酸特异性的所述寡核苷酸引物;
- 通过参考外部校准或通过执行内部定量标准品,确定所述DNA靶核酸的量。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶,所述突变赋予与相应野生型聚合酶相比改善的逆转录酶活性。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶选自:CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海栖热袍菌DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、黄栖热菌DNA聚合酶、丝状栖热菌DNA聚合酶、栖热菌属种sps17 DNA聚合酶、栖热菌属种Z05 DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶、非洲栖热腔菌DNA聚合酶和Thermus caldophilus DNA聚合酶。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述包含突变的具有逆转录酶活性的聚合酶来自栖热菌属种Z05 DNA聚合酶。
12.根据权利要求8-11中的任一项所述的方法,所述方法还包括:扩增可能存在于所述样品中的RNA靶核酸。
13.根据权利要求8-12中的任一项所述的方法,其中所述DNA靶核酸是乙型肝炎病毒(HBV)。
14.根据权利要求8-13中的任一项所述的方法,其中所述样品是流体样品。
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