CN108469526A - 双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108469526A CN108469526A CN201810127235.5A CN201810127235A CN108469526A CN 108469526 A CN108469526 A CN 108469526A CN 201810127235 A CN201810127235 A CN 201810127235A CN 108469526 A CN108469526 A CN 108469526A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- double
- antigen
- stranded dna
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种双链DNA抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用。该制备方法包括提取双链DNA;采用蛋白酶及RNA酶去除双链DNA中的组蛋白和RNA成分得到第一纯化DNA;将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段得到剪切DNA;采用核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶消除剪切DNA中的单链和甲基化修饰的DNA分子得到第二纯化DNA;以及对第二纯化DNA进行纯化回收得到双链DNA抗原。采用各种酶对所提取的双链DNA中可能存在的蛋白、RNA、操作过程中产生的单链DNA以及修饰过的DNA分子进行降解消化,使得所得双链DNA抗原的纯度相对更高,因而使检测结果特异性高更准确。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,具体而言,涉及一种双链DNA抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
自身免疫病是由于免疫功能紊乱,机体产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应而引起器官或***损伤的一类疾病。目前,对于自身免疫病的发病机制尚不完全清楚。一般认为自身免疫病是遗传易感个体在环境因素如感染、紫外线、肿瘤及药物等多种因素共同作用下发生的。高滴度的自身抗体和致敏性淋巴细胞的出现是自身免疫病的基本特征,其中抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)又称抗核酸抗原抗体,是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取性核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,抗核抗体针对的靶抗原主要是细胞内的核酸及核蛋白成分,在细胞周期的转录和翻译过程中起重要作用,对ANA的特异性检测对疾病的明确诊断具有重要的参考价值,尤其对***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、混合性结蹄组织病(mixedconnective tissue disease,MCTD)、干燥综合征(Sjogren syndrome,SS)、***性硬化症(systemic sclerosis,SSc)、多肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)和原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)等疾病的诊断具有较高的特异性。
其中***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病,主要侵犯***并影响多个器官***。在世界范围内,在欧洲,SLE每年的新增发病率约为25/10万,而北美地区发病率更高。SLE易发于年轻女性,病程中往往复发与缓解交替出现。患者体内可产生针对核酸、核蛋白和组蛋白的抗核抗体及其他自身抗体,这些自身抗体与相应抗原结合形成免疫复合物,可沉积在心血管***、肾小球基底膜、浆膜、关节滑膜和多种脏器小血管壁上,免疫复合物在局部激活补体,吸引中性粒细胞浸润,造成局部组织的慢性炎性损伤。故SLE患者常患有多***、多器官的损害。根据损害的器官不同,患者可出现发热、皮疹、关节痛、肾损害,心血管病变、浆膜炎、贫血、精神症状等多种临床表现。美国风湿协会与1997年修订了关于SLE诊断的11项ARA标准(ARA,美国风湿病协会)。该11项标准分别为:1.蝶形红斑;2.身体其他部位出现红色、鳞屑状、局限的、***的皮肤疹;3.光敏现象;4.口腔粘膜疼痛或溃疡;5.关节疼痛或关节渗出;6.浆膜炎;7.肾脏疾病;8.神经***疾病;9.血液***症状如伴网状细胞增多、白细胞减少、淋巴细胞减少的出血性贫血;10.免疫学方法检出抗dsDNA抗体、Sm抗体、抗心磷脂抗体;11.间接免疫荧光法检出ANA。若11项标准中出现4项,诊断SLE的可能性超过80%。
抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性标志抗体,该抗体阳性为SLE的重要诊断标准之一。1967年Arana在SLE患者血清中发现了一种能与天然DNA结合的自身抗体,称为天然DNA抗体或dsDNA抗体。随着研究的深入,人们发现抗dsDNA抗体几乎仅存在于SLE患者血清中,是SLE的特异性抗体,且抗体的滴度与SLE的活动性存在相关性。
SLE患者体内抗DNA抗体又分为抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体,抗dsDNA抗体主要识别位点是位于DNA双螺旋结构上的核糖核酸骨架结构,主要见于SLE中,阳性率为40%~90%,特异性超过90%,在其他自身免疫疾病和正常人中极少出现,一般阳性率均低于10%,且抗体滴度也低,而且此类病人一般认为是SLE重叠综合征。抗ssDNA抗体的主要识别位点是双链DNA解螺旋后暴露出来的嘌呤和嘧啶碱基多聚体结构,而抗ssDNA抗体的测定结果缺乏疾病特异性,除SLE患者有较高检出率(50%-60%)外,其他风湿病如混合性***病、药物诱导的狼疮、硬皮病、皮肌炎、干燥综合征,类风湿性关节炎等也都有10%-70%的检出率。因此,抗dsDNA抗体在自身免疫疾病特别是SLE临床诊断方面的意义明显高于抗ssDNA抗体,而临床应用上抗dsDNA抗体的检测非常容易受抗ssDNA抗体结果干扰,因而抗dsDNA抗体高灵敏度、高特异性的检测对于辅助SLE疾病的明确诊断至关重要,而对于抗dsDNA抗体的检测,首先需要解决的问题是制备得到高度纯化和完整的双链DNA分子。
双链DNA是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的双螺旋结构;DNA的外侧由脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架,内侧是碱基通过氢键连接形成的碱基对,碱基之间的配对遵循碱基互补配对原则(A-T、C-G)。在正常细胞内,碱基对间的氢键被打开,需要解旋酶的作用。DNA中G和C形成的碱基对的比例越高,结构越稳定,完全解旋成单链所需的温度越高。
一般情况下,DNA双螺旋结构是很稳定的,主要有两种作用力使DNA双螺旋结构维持稳定,一种作用力是A-T、C-G互补碱基间形成的氢键,第二种作用力是DNA分子中的碱基堆积力,碱基之间层层堆积,在DNA内部形成一个疏水核心,而且疏水核心区内几乎没有游离的水分子,这更有利于互补碱基间形成氢键。而双链DNA分子在生物体外时,极易受环境因素影响,如各种物理(高温、紫外照射)、化学(pH改变、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等)、机械等因素微弱的变化,就会使其发生损伤或断裂,DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则的、不平整的单链线性结构,变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,使位于内部的嘌呤嘧啶碱基暴露出来。碱基具有吸收紫外线的功能,单链DNA的碱基外露,使得变性后的体系对波长260nm处紫外线的吸收增强,该过程被称为增色效应,这也成为目前检测DNA变性的最主要的手段。DNA的变性温度Tm是指当体系有50%的双链DNA变性时对应的温度。因而,当双链DNA分子所处的体系使双链DNA分子的Tm越高时,双链DNA分子结构越稳定。而dsDNA分子在包被处理过程以及后续保存运输及使用过程中均可能存在双链DNA分子降解和破坏形成单链,因此,优化抗原-磁性微球包被缓冲液和磁性微球偶联物保存液对于提高双链DNA分子所处体系的Tm和稳定维持DNA分子的双链结构至关重要。
目前在检测方法方面,检测抗dsDNA抗体的方法主要是放射免疫分析、间接免疫荧光法、胶体金法、免疫印迹法和酶联免疫吸附法,其中放射免疫分析因有放射污染而趋于淘汰,间接免疫荧光法结果判读需要荧光显微镜,并且需要操作者具有一定的形态学基础,受人为主观因素影响较大,且难定量,胶体金法只适合定性检测,灵敏度较差,易受干扰,而免疫印迹法在转印过程中有可能出现抗原丢失或者变性,故而影响抗原抗体的结合,此外,IBT条带不显色或不清晰,导致结果不易观察,酶联免疫吸附法可用于定量检测,但是由于dsDNA较难包被于固相载体上,因而检测范围较窄,检测灵敏度和准确性无法得到保障。
因此,目前在针对抗dsDNA抗体的检测方面存在的检测特异性差、灵敏度和准确性相对较低的缺陷,尚无有效的解决方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种双链DNA抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用,以解决现有技术中的双链DNA抗原存在纯度低而导致检测结果受影响的问题。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种双链DNA抗原的制备方法,该制备方法包括:提取双链DNA;采用蛋白酶及RNA酶去除双链DNA中的组蛋白和RNA成分,得到第一纯化DNA;将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到剪切DNA;采用核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶消除剪切DNA中的单链和甲基化修饰的DNA分子,得到第二纯化DNA;以及对第二纯化DNA进行纯化回收,得到双链DNA抗原。
进一步地,从小牛胸腺组织、鲑鱼精、Hela细胞、人血液或唾液中提取双链DNA;优选地,采用4.5号皮下注射器针头对第一纯化DNA进行吹吸的方式将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到剪切DNA;优选地,吹吸的频率为10~30次/min,吹吸的次数为90~120次;更优选地,在对第一纯化DNA剪切之前,还包括对第一纯化DNA进行浓缩的步骤,进一步优选将第一纯化DNA浓缩至浓度为1.8~3mg/mL。
根据本发明的第二个方面,提供了一种双链DNA抗原,该双链DNA抗原采用上述任一种制备方法制备而成。
根据本发明的第三个方面,提供了一种检测抗dsDNA抗体的试剂,试剂包括双链DNA抗原,双链DNA抗原采用上述任一种制备方法制备而成。
进一步地,试剂还包括用于负载双链DNA抗原的固相载体,优选固相载体为磁性微球或微孔板。
进一步地,固相载体为磁性微球,试剂还包括用于将双链DNA抗原包被至磁性微球的包被缓冲液,优选包被缓冲液包括:Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐以及酶抑制剂,包被缓冲液的pH为7.5~8.5;更优选地,包被缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.3M的NaCl和/或KCl;以及0.5~2mM的EDTA。
进一步地,试剂还包括pH为7.5~8.5的存储缓冲液,存储缓冲液包括:基础缓冲液,基础缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐及防腐剂,优选基础缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.5M的NaCl和/或KCl,以及0.05~0.2wt%的防腐剂,更优选地,防腐剂为Proclin300或硫柳汞;存储稳定液,存储稳定液包括DNA分子保护剂、酶抑制剂、表面活性剂、DNA双链结构稳定剂及封闭剂以中的任意一种或多种;优选地,DNA分子保护剂为β-环状糊精、α-环状糊精或γ-环状糊精;更优选存储稳定液中,DNA分子保护剂的含量为1~3wt%;优选地,表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂,更优选阴离子表面活性剂为SDS或SLS;非离子表面活性剂为PEG6000、聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20;进一步优选地,存储稳定液中,阴离子表面活性剂的含量为0.02~0.05wt%,非离子表面活性剂的含量为0.05~0.1wt%;优选地,DNA双链结构稳定剂为含Al3+、Co3+或Ce3+的化合物;更优选存储稳定液中,DNA双链结构稳定剂的浓度为5~10mM;优选地,酶抑制剂为0.5~2mM的EDTA;优选地,封闭剂为0.5~2wt%的BSA、酪蛋白或明胶。
进一步地,试剂还包括检测缓冲液,检测缓冲液中含有核酸酶S1,更优选检测缓冲液中核酸酶S1的浓度为0.5~2μg/L,进一步优选地,检测缓冲液还包括:10~50mM磷酸盐缓冲液、0.5~2wt%BSA、0.1~0.3M氯化钠及0.05~0.2wt%Proclin300。
根据本发明的第四个方面,提供了一种检测抗双链DNA抗体的试剂盒,试剂盒包括上述任一种试剂。
进一步地,试剂盒还包括发光标记物、定标品及质控品中的任意一种或多种;优选发光标记为抗人IgG、IgA或IgM标记的ABEI,定标品和质控品各自独立地为人源性的抗双链DNA的抗体。
进一步地,试剂盒中的双链DNA抗原以抗原-固相载体偶联物的形式存在,固相载体为磁性微球。
进一步地,试剂盒还包括用于盛放抗原-固相载体偶联物的磁性微球管,磁性微球管采用避光材料制成。
根据本发明的第五个方面,提供了一种抗双链DNA抗体的检测方法,检测方法包括利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤,抗双链DNA抗体的靶抗原为上述任一种制备方法制备而成的双链DNA抗原。
进一步地,利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤中,反应温度为25~30℃。
根据本发明的第六个方面,提供了上述任一种制备方法制备而成的双链DNA抗原或上述任一种检测抗dsDNA抗体的试剂或上述任一种试剂盒在抗双链DNA抗体筛查临床检测中的应用。
进一步地,该应用包括对***性红斑狼疮的临床辅助诊断。
根据本发明的第六个方面,提供了上述任一种试剂盒在抗核抗体检测中的应用,该应用包括:将试剂盒应用于半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪。
在双链DNA抗原提取纯化方面,一般以去除RNA和组蛋白为主,极少考虑单链DNA的影响,但本申请的上述双链DNA抗原的制备方法通过采用各种酶对所提取的双链DNA中可能存在的蛋白、RNA、操作过程中产生的单链DNA以及修饰过的DNA分子进行降解消化,使得所得双链DNA抗原的纯度相对更高,在用于检测样本中的双链DNA抗体时具有特异性高,检测结果更准确的优势。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释:
ANA:抗核抗体。
靶抗原:能与对应抗体特异性反应的物质(包括核酸或核蛋白)。
抗dsDNA抗体:抗双链DNA抗体。
抗ssDNA抗体:抗单链DNA抗体。
***性红斑狼疮:(systemic lupus erythematosus,SLE)。
ABEI:N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺。
SDS:十二烷基硫酸钠。
SLS:月桂醇醚硫酸钠。
EDC:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
DCC:二环己基碳二亚胺。
如背景技术所提到的,现有技术中的用于抗双链DNA抗体检测的抗原存在特异性差而难以准确检测样本中的双链DNA抗体的缺陷,为了改善这一状况,在本申请一种典型的实施方式中,提供了一种双链DNA抗原的制备方法,该制备方法包括:提取双链DNA;采用蛋白酶及RNA酶去除对双链DNA中的组蛋白和RNA成分,得到第一纯化DNA;将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到剪切DNA;采用核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶消除剪切DNA中的单链或甲基化修饰的DNA分子,得到第二纯化DNA;以及对第二纯化DNA进行纯化回收,得到双链DNA抗原。
本申请的上述双链DNA抗原的制备方法,通过采用各种酶对所提取的双链DNA中可能存在的蛋白、RNA、操作过程中产生的单链DNA以及甲基化修饰过的DNA分子进行降解消化,使得所得双链DNA抗原的纯度相对更高,在用于检测样本中的双链DNA抗体时具有特异性相对较高的优势。
上述双链DNA的制备方法中,第一步纯化时DNA片段差异相对较大,使用酚氯仿提纯较好。第二步纯化时DNA片段基本处在一定大小,可以先电泳纯化,再切胶过柱亲和纯化,不仅纯化后所得双链DNA抗原纯度高,而且还能确定片段大小。具体的纯度检测可以通过A280/A260来进行间接检测。
上述所提取的双链DNA的来源包括但不仅限于小牛胸腺组织、鲑鱼精、Hela细胞、人血液或唾液。由于本申请的目的是用于检测人源性抗dsDNA抗体的含量,抗体识别靶抗原主要为人体内的双链DNA分子,因而,选择人或与人DNA同源性更高的种属DNA分子作为靶抗原来检测人血清中抗dsDNA抗体具有更好的抗原抗体亲和力和检测灵敏度。但从原料的可获得性角度考虑,更优选从小牛胸腺组织提取的dsDNA分子作为靶抗原,是因为牛和人基因组大小基本相当,DNA分子序列和空间结构相似度高,因而,能够保证抗原抗体反应具有较高的亲和力和良好的检测灵敏度,避免出现漏检情况。
上述制备方法中的多次纯化的目的是为了尽可能得到不含单链DNA的纯度较高的双链DNA分子,且使双链DNA分子保持在上述适宜长度。由于抗体识别DNA分子的位点大小一般为6~12bp,大于60bp的DNA分子才能与抗体牢固结合,考虑到后续检测时dsDNA抗原包被、空间位阻及后期保存情况,将所制备的双链DNA分子控制在1kb左右,以提高包被效率和重复性,同时促进分散,并更好地维持DNA分子的双链结构。
上述制备方法中,将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段的具体方式并无特殊限定,只要能够在尽可能不破坏双链结构的前提下将DNA剪切至上述大小的片段即可。在本申请一种优选的实施例中,采用4.5号注射器针头对第一纯化DNA进行吹吸的方式将第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到剪切DNA。4.5号注射器针头的孔径大小在吹吸过程中对DNA的机械力剪切损伤较小,能够保证DNA纵向剪切成500~2000bp的片段,同时保证横向碱基之间氢键作用力的稳定。、因而4.5号注射器针头能够减少对双链DNA的破坏。当然,也可以在上述孔径大小的注射器基础上对注射器针头孔径进行优化,从而选择更合适孔径的注射器来进行上述吹吸剪切过程。
上述吹吸过程中,不同规格的注射器针头具有不同的内径和外径,通常用外径来命名,本申请中所使用的4.5号注射器针头的外径为0.45mm。具体吹吸的频率或次数并不特殊限定,以实际获得的DNA片段的大小在上述范围内为准。在一种优选的实施例中,吹吸的频率为10~30次/min,吹吸的次数为90~120次。按照该吹吸频率吹吸上述次数,使得目的DNA片段的大小相对更集中。
上述剪切步骤中,根据所提取的DNA的浓度大小,可以通过浓缩或稀释的方式将待剪切的DNA控制在合适的浓度范围内。采用上述机械力对DNA进行剪切打断时,浓度高点效果会更好。因此,在对第一纯化DNA进行剪切之前,还可以进行浓缩的步骤。通过使用1丁醇(n-butyl alcohol或1-butanol)或2丁醇(2-butanol)多次重复浓缩DNA溶液,这样,可以将待沉淀的DNA样品的体积浓缩到可以用无水乙醇沉淀的体积。在一种更具体的实施例中,浓缩DNA的操作步骤如下:1)加入等体积的2丁醇到DNA溶液中,充分混匀;2)离心1分钟,1600g移去上层有机相;3)重复步骤1)和2),直到所需体积;4)用水饱和的***抽提,去除溶液中的2丁醇;5)真空抽提去除***。
在本申请一种优选的实施例中,在对第一纯化DNA剪切之前,还包括对第一纯化DNA进行浓缩的步骤,进一步优选将第一纯化DNA浓缩至浓度为1.8~3mg/mL,最优选为2mg/mL。将待剪切的DNA浓缩至上述浓度范围,具有剪切效率高的优势。
在本申请第二种典型的实施方式中,提供了一种双链DNA抗原,该双链DNA抗原采用上述任一种制备方法制备而成。上述制备方法制备的双链DNA抗原具有纯度高且长度适宜的优势。
在本申请第三种典型的实施方式中,提供了一种检测抗dsDNA抗体的试剂,该试剂包括双链DNA抗原,双链DNA抗原采用上述任一种制备方法制备而成。由于上述制备方法制备而成的双链DNA抗原具有纯度高且长度适宜的优点,因而采用含有该双链DNA抗原的试剂检测抗dsDNA抗体时,在保障灵敏度的前提下还具有检测特异性高及准确性高的效果。
为了使检测更方便,上述检测抗dsDNA抗体的试剂还包括用于负载双链DNA抗原的固相载体。通过将双链DNA抗原负载到固相载体上,具有连接效率高、空间位阻小、偶联物结构稳定等优势。上述固相载体可以为现有的固相载体,在本申请中包括但不限于磁性微球或微孔板。
为了进一步提高上述检测试剂中双链DNA抗原的双链结构的稳定性以及减少将其负载到固相载体过程中双链DNA的降解或解链成单链DNA,在本申请一种优选的实施例中,上述固相载体为磁性微球,上述试剂还包括用于将双链DNA抗原包被至磁性微球的包被缓冲液,优选包被缓冲液包括:Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐以及酶抑制剂,包被缓冲液的pH为7.5~8.5;更优选地,包被缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.3M的NaCl和/或KCl;以及0.5~2mM的EDTA。
上述优选的实施例中,将包被缓冲液的pH控制在7.5~8.5,以防止DNA分子或RNA的解离。Tris-HCl缓冲液的作用是维持体系在一定pH范围,保护双链DNA的碱基完整性,防止开环或者断裂。EDTA等酶抑制剂是能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂,防止DNA分子降解。由于溶液中的阳离子金属盐如NaCl和KCl的盐形式的阳离子可充当屏蔽剂,从而减少了双链DNA的两股链之间的斥力,增强双链结构的稳定性,提高DNA分子变性温度Tm值。
上述包被缓冲液能够防止或减少在双链DNA抗原包被磁性微球的过程中对双链DNA分子的破坏。此外,包被后形成的双链DNA抗原-磁性微球偶联物在长期保持及运输过程中依然存在产生开环或断裂产生单链DNA的风险,从而造成假阳性结果。为了进一步减少存在或运输过程中的上述损伤,在本申请一种优选的实施例中,上述试剂还包括pH为7.5~8.5的存储缓冲液,该存储缓冲液包括:基础缓冲液和存储稳定液,基础缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐以及防腐剂,优选基础缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.5M的NaCl和/或KCl;以及0.05~0.2wt%的防腐剂,优选地,防腐剂为Proclin300或硫柳汞;存储稳定液包括DNA分子保护剂、表面活性剂、DNA双链结构稳定剂、封闭剂以及酶抑制剂中的任意一种或多种;优选地,β-环状糊精、α-环状糊精或γ-环状糊精;更优选存储稳定液中,DNA分子保护剂的含量为1~3wt%;优选地,表面活性剂包括阴离子表面活性剂及非离子表面活性剂,更优选阴离子表面活性剂为SDS或SLS;非离子表面活性剂为PEG6000、聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20;进一步优选地,存储稳定液中,阴离子表面活性剂的含量为0.02~0.05wt%,非离子表面活性剂的含量为0.05~0.1wt%;优选地,DNA双链结构稳定剂含Al3+、Co3+或Ce3+的化合物;更优选存储稳定液中,DNA双链结构稳定剂的含量为5~10mM;优选地,封闭剂为0.5~2wt%的BSA、酪蛋白或明胶。优选地,酶抑制剂为0.5~2mM的EDTA。
上述存储缓冲液中,基础缓冲液的成分与包被缓冲液成分类似,作用也类似,此处不再赘述。存储缓冲液还包括对DNA分子结构和双螺旋结构起到稳定作用的存储稳定液,任何现有技术中能够对DNA分子结构和双螺旋结构起到稳定作用的物质均可以成为该存储稳定液的组分。
上述优选实施例中,DNA分子保护剂β-环状糊精可排列在DNA分子的周围而减轻对DNA的直接作用从而达到保护的作用,对DNA分子具有较明显的保护作用。其在存储稳定液中的含量可以根据效果进行优化调整。在本申请优选其含量为1~3wt%,该含量范围内对双链DNA分子的保护作用更好。
上述优选实施例中,表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂,其中,阴离子表面活性剂还能够促进磁性微球分散,避免磁性微球团聚,降低DNA分子与磁性微球管之间的吸附。阴离子表面活性剂进入蛋白酶活性中心发生配合反应,使酶失活,防止DNA分子被降解。而非离子表面活性剂能够促进磁性微球分散,避免磁性微球团聚,降低DNA分子与磁性微球管之间的吸附。其具体的含量也可以根据最终的稳定效果进行优化调整。本申请的存储稳定液中优选的阴离子表面活性剂的含量为0.02~0.05wt%,非离子表面活性剂的含量为0.05~0.1wt%,在该含量范围内使双链DNA抗原包被的磁性微球分散性更好,进而降低DNA分子与磁性微球管之间的吸附,保持双链DNA分子的稳定性和分散性。
上述优选实施例中,DNA双链结构稳定剂中,含Al3+、Co3+或Ce3+的化合物(如氯化铝,氯化钴或氯化铈)中三价的金属离子与双链DNA分子中的磷酸酯氧亲和力很高,二者能迅速反应,牢固结合,形成很稳定的络合物,其结果是使DNA的两条链交联起来,双螺旋饶得更紧密,双链结构更稳定,从而提高DNA分子变性温度Tm值。其在存储稳定液中的含量也可以根据稳定效果进行优化调整。而本申请优选将其含量控制在5~10mM范围内,具有使双链DNA分子稳定性更好的效果。
上述优选实施例中,封闭剂如0.5%BSA用于封闭磁性微球中可能的未被包被的位点。而防腐剂Proclin300或硫柳汞的作用是抑制微生物的生长和繁殖,以延长保存时间。
在一种优选的实施例中,上述试剂还包括检测缓冲液,检测缓冲液中含有核酸酶S1,更优选检测缓冲液中核酸酶S1的浓度为0.5~2μg/L,进一步优选地,检测缓冲液还包括:10~50mM磷酸盐缓冲液、0.5~2wt%BSA、0.1~0.3M氯化钠及0.05~0.2wt%Proclin300。
高度纯化的双链DNA分子在包被磁性微球过程会形成一些化学键,不可避免会对双链DNA分子造成一定破坏。另外,包被后的双链DNA抗原-磁性微球偶联物在长期保存以及运输过程中依然存在产生单链DNA的风险,也可能导致假阳性结果。因此,还需将单链DNA分子进一步去除,最直接的方法是在磁性微球悬浮液中添加核酸酶S1,但是磁性微球悬浮液中存在酶抑制剂,两者不能共存。另一方面,双链DNA分子形成的单链很大部分可自然复性恢复双链结构,若是磁性微球悬浮液中存在单链DNA降解酶,单链DNA的产生与降解持续进行,最终可能会导致磁性微球上面大部分的DNA分子被降解,从而影响检测效价,不能给出正确结果。
上述优选实施例通过在试剂盒的检测缓冲液组分中添加适当浓度的核酸酶S1,能够很好地避免上面的两个问题。抗双链DNA抗体的检测一般采用两步间接法,首先是包被双链DNA分子的磁性微球与待测样本(含分析物)及检测缓冲液一起温浴,若是样本中存在抗双链DNA的抗体,则会形成磁性微球-dsDNA-抗dsDNA抗体的复合物,因磁性微球和样本加样量均很小,所以此步骤必须添加较大量的检测缓冲液来提供让磁性微球和样本混匀及充分反应的环境。因反应过程中检测缓冲液添加量较大,所以核酸酶S1的活性受磁性微球悬浮液中酶抑制剂的影响会较小,同时,因核酸酶S1是与包被双链DNA分子的磁性微球和待测样本同时加入反应杯的,而酶催化反应速度极快,能迅速消除其中可能存在的单链DNA分子,同时又避免了核酸酶S1与磁性微球长期共存持续降解DNA分子的问题。
在本申请第四种典型的实施方式中,提供了一种检测抗双链DNA抗体的试剂盒,该试剂盒包括上述任一种试剂。上述试剂中包括双链DNA抗原,而双链DNA抗原采用上述任一种制备方法制备而成。含有本申请上述方法制备而成的双链DNA抗原的试剂盒具有检测特异性高、准确性高的优势。
为了使检测试剂盒使用更方便,在本申请一种优选的实施例中,试剂盒还包括发光标记物、定标品及质控品中的任意一种或多种;优选发光标记为抗人IgG、IgA或IgM标记的ABEI,定标品和质控品各自独立地为人源性的抗双链DNA的抗体。
在本申请一种优选的实施例中,双链DNA抗原以包被固相载体的偶联物的形式存在,包被到固相载体上的双链DNA抗原具有能够定量检测以及连接效率高、空间位阻小、偶联物结构稳定等优势。
在本申请一种优选的实施例中,固相载体为磁性微球,试剂盒还包括用于盛放偶联物的磁性微球管,该磁性微球管采用避光材料制成。在外界环境中,紫外线照射能使DNA分子中相邻的胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体,胸腺嘧啶二聚体通常发生在同一DNA链上两个相邻的胸腺嘧啶之间,也可以发生在两条单链之间,这种二聚体是很稳定的。如果它发生在同一链的两个相邻胸腺嘧啶之间,就会使双螺旋的两链的键减弱,使双链DNA结构局部变形;如果它发生在两链之间,就会由于它的交联而阻碍双链的分开,从而影响磁性微球的分散性,影响实验结果。因而采用避光材料能够避免双链DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体,从而影响检测结果的准确性。
在本申请第五种典型的实施方式中,提供了一种抗双链DNA抗体的检测方法,该检测方法包括利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤,其中抗双链DNA抗体的靶抗原为上述任一种制备方法制备而成的双链DNA抗原。该检测方法具有特异性高和准确性高的优势。
在一种优选的实施例中,利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤中,反应温度为25~30℃。发明人发现,在37℃下反应时,分子之间运动碰撞加剧,可能会出现局部解链结构,暴露出的碱基嘧啶多聚体被抗ssDNA抗体识别,增加假阳性风险。而将反应温度控制在相对较低的25~30℃范围内,能够降低局部解链成单链DNA的概率,进而也能降低被单链DNA抗体识别的概率,从而降低检测结果的假阳性。
在本申请第六种典型的实施方式中,提供了上述任一种制备方法制备而成的双链DNA抗原或上述任一种检测抗dsDNA抗体的试剂或上述任一种检测抗双链DNA抗体的试剂盒在抗双链DNA抗体临床检测中的应用。本申请的应用具有特异性高和准确性高的优势。
在本申请一种优选的实施例中,该应用包括对***性红斑狼疮的临床辅助诊断。该应用能够提高临床检测特异性和准确度,减少假阳性结果,对***性红斑狼疮的临床辅助诊断结果可靠性更高。
在本申请第七种典型的实施方式中,提供了上述任一种检测抗双链DNA抗体的试剂盒在抗核抗体检测中的应用,应用包括:将试剂盒应用于半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪。此处将试剂盒应用于半自动或全自动免疫分析仪中是指将上述试剂盒中的相应试剂对样品进行处理后置于半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪中进行分析,从而得到检测结果。该应用能够实现试剂盒检测的自动化检测和高通量检测,提高临床检测特异性和准确度,减少假阳性结果,提高检测通量和效率。
在本申请一种更优选的实施例中,上述应用包括以下步骤:
1)加5-20μL抗双链DNA抗体校准品或质控品待测标本至检测管中;
2)加10-30μL包被有抗双链DNA抗体靶抗原的磁性微球和100-300μL检测缓冲液至检测管中,混匀后,30±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
3)加入200-400μL清洗液至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
4)重复步骤3)两遍;
5)加100-300μL抗人IgG结合物至步骤4)检测管中,混匀后,37±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
6)加入200-400μL清洗液至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
7)重复步骤6)两遍;
8)加入100-400μL化学发光底物至步骤7)检测管中,混匀,检测发光强度,仪器根据光强度自动计算浓度值。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是,以下实施例及对比例中,如无特殊说明,所用试剂及耗材均为市售产品,比如DNA提取试剂盒,具体DNA的初步提取的步骤可以按照试剂盒的说明进行操作。其中的%均表示质量百分含量,mM表示mmol/L。
检测样本:检测用样本均通过临床诊断及其他商业试剂筛查及单项检测试剂检测确诊。
标本收集:受检者均于早晨空腹抽静脉血:3mL。分离血清,置于-20℃冰箱保存。
临床灵敏度评估样本:选取***性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)患者385例。
临床特异性评估样本:混合型***病(Mixed connective tissue diseases,MCTD)患者142例、***性硬皮症Systemic sclerosis,PSS)患者78例、干燥综合征患者(Sjogren's syndrome,SSc)114例、多肌炎/皮肌炎(Poly/Dermatomyositis,DM)患者45例、原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary liver cirrhosis,PBC)患者66例、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)患者135例、健康体检样本150例,总计730例。
对比例1:
1、抗原制备:
采用Sigma的DNA提取试剂盒从小牛胸腺组织提取双链DNA,添加蛋白酶K及RNA酶A去除组蛋白和RNA成分,制备得到纯化的双链DNA抗原。
2、磁性微球包被及悬浮:
取10-30mg含-NH2的磁性微球,用磷酸盐缓冲液洗3-5遍,加入1mL包被缓冲液,再加入0.1-0.2mL DCC和0.05-0.2mg靶抗原,室温震荡包被3h。
磁性微球包被缓冲液的成分及其浓度如下,其余为水:
醋酸盐缓冲液 20mM
pH值 pH为3.6
磁性微球存储缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
3、试剂盒组分:
1)磁性微球(包被有纯化的双链DNA分子)
纯化的dsDNA分子包被的磁性微球溶液,其中磁性微球的浓度为20mg/mL,包被于磁性微球上的dsDNA的浓度为15μg/mL;
2)ABEI标记的鼠抗人IgG单抗溶液,其中ABEI浓度为50ug/mL,已被ABEI标记的鼠抗人IgG单抗的浓度为1mg/mL;
3)检测缓冲液(不含核酸酶S1)
4)定标品(含有人源性抗双链DNA抗体)
低点定标品:20IU/mL
高点定标品:400IU/mL
5)质控品(含有人源性抗双链DNA抗体)
质控品1:50IU/mL
质控品2:200IU/mL
检测原理:
首先是包被双链DNA分子的磁性微球与待测样本(含分析物)及检测缓冲液一起温浴,若是样本中存在抗双链DNA抗体,则会形成磁性微球-dsDNA-抗dsDNA抗体的复合物,清洗三次,去除样本中未结合的其他IgG成分,添加发光标记物,抗人IgG与第一次温浴形成的复合物中抗dsDNA抗体反应,形成磁性微球-dsDNA-抗dsDNA抗体-抗人IgG抗体-ABEI的复合物,在激发底物作用下,ABEI发光强度与待测样本中抗dsDNA抗体的浓度成比例。
4、检测方法:
该检测方法具体包括如下步骤:
1)加5-20μL抗双链DNA抗体校准品或质控品或待测标本至检测管中;
2)加10-30μL包被有抗双链DNA抗体靶抗原的磁性微球和100-300μL检测缓冲液至检测管中,混匀后,37±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
3)加入200-400μL清洗液(60mM Tris-HCl,0.007%吐温20,180mM氯化钠,pH 7.2~8.8)至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
4)重复步骤3)两遍;
5)加100-300μLABEI标记的鼠抗人IgG单抗至步骤4)检测管中,混匀后,37±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
6)加入200-400μL清洗液至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
7)重复步骤6)两遍;
8)加入100-400μL化学发光底物至步骤7)检测管中,混匀,检测发光强度,仪器根据光强度自动计算浓度值
5、结果统计:
表1:灵敏度:
表2:特异性:
6、结果分析:
抗dsDNA抗体主要识别位点是位于DNA双螺旋结构上的核糖核酸骨架结构,主要见于SLE中,阳性率为40%~90%,特异性超过90%,在其他自身免疫疾病和正常人中极少出现,一般阳性率均低于10%。而抗ssDNA抗体的主要识别位点是双链DNA解螺旋后暴露出来的嘌呤和嘧啶碱基多聚体结构,而抗ssDNA抗体的测定结果缺乏疾病特异性,除SLE患者有较高检出率(50%-60%)外,其他风湿病如混合性***病、药物诱导的狼疮、硬皮病、皮肌炎、干燥综合征,类风湿性关节炎等也都有10%-70%的检出率。
从上述对比例的检测结果中可以看出,双链DNA抗原在提取过程中,存在的单链DNA分子并未消除,也未将DNA分子切断到合适片段。在包被过程中,包被缓冲液中未添加防止双链DNA分子降解的酶抑制剂,pH和离子浓度也不合适,不利于双链DNA分子结构稳定。存储缓冲液中,也未添加防止双链DNA分子降解的酶抑制剂,其中Mg2+还有激活核酸酶的作用,不利于DNA分子的保存,另外,未添加DNA分子保护剂和双链结构稳定剂,长期保存中产生单链风险较高。另外,在后续检测过程中,检测缓冲液组分中也未加入核酸酶S1,因而,磁性微球与双链DNA分子形成的偶联物中存在较大比例的单链DNA分子,在反应过程中磁性微球上的单链DNA分子被样本中的抗单链DNA抗体识别,从而造成假阳性结果较高。因此,在混合型***病、类风湿性关节炎等非SLE疾病中也检出大量阳性结果,与临床研究及实际报道不符,导致试剂盒整体特异性较低(70.14%)。
实施例1:
1、抗原制备:
采用Sigma的DNA提取试剂盒从小牛胸腺组织提取双链DNA,添加蛋白酶K及RNA酶A去除组蛋白和RNA成分,然后用酚氯仿提纯,得到第一纯化DNA;采用2丁醇对第一纯化DNA进行浓缩,得到浓度为2mg/mL双链DNA。然后使用4.5号皮下注射器针头按照20次/min的频率吸打溶液约100次,得到500bp左右的DNA片段,然后添加核酸酶S1和DpnI去甲基化酶消除提取和剪切处理过程中形成的单链结构以及被甲基化修饰过的DNA分子,再进行电泳凝胶纯化及切胶过柱纯化,回收制备得到高度纯化的双链DNA抗原。
2、磁性微球包被及悬浮:
取10-30mg含-NH2的裸磁性微球,用磷酸盐缓冲液洗3-5遍,加入1mL包被缓冲液,再加入0.1-0.2mL EDC和0.05-0.2mg靶抗原,室温震荡包被3h。
磁性微球包被缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
醋酸盐缓冲液 20mM
pH值 pH为3.6
磁性微球存储缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
3、试剂盒组分:
磁性微球(包被有纯化的双链DNA分子)
3)检测缓冲液(不含核酸酶S1)
4)定标品(含有人源性抗双链DNA抗体)
低点定标品:20IU/mL
高点定标品:400IU/mL
5)质控品(含有人源性抗双链DNA抗体)
质控品1:50IU/mL
质控品2:200IU/mL
检测原理(同对比例1)
4、检测方法:
该检测方法具体包括如下步骤::
1)加5-20μL抗双链DNA抗体校准品或质控品或待测标本至检测管中;
2)加10-30μL包被有抗双链DNA抗体靶抗原的磁性微球和100-300μL检测缓冲液至所述检测管中,混匀后,37±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
3)加入200-400μL清洗液至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
4)重复步骤3)两遍;
5)加100-300μL抗人IgG结合物至步骤4)检测管中,混匀后,37±0.5℃溫育5-20min,进行磁分离,去上清;
6)加入200-400μL清洗液至检测管中,混匀,进行磁分离,去上清;
7)重复步骤6)两遍;
8)加入100-400μL化学发光底物至步骤7)检测管中,混匀,检测发光强度,仪器根据光强度自动计算浓度值
5、结果统计:
表3:灵敏度:
表4:特异性:
6、结果分析:
将实施例1的表3和表4与对比例1的表1和表2相比可知,实施例1的试剂盒临床检测特异性从70.14%提高到76.16%。该实施例表明尽管在包被过程中可能会产生一些单链结构、后续的保存过程中也存在产生单链DNA的风险以及当检测缓冲液组分中也未加入核酸酶S1时,也可能导致一些假阳性结果,但制备得到纯度相对较高以及大小适宜的双链DNA分子是检测结果准确可靠的前提条件。
实施例2:
1、抗原制备:
采用Sigma的DNA提取试剂盒提取鲑鱼精双链DNA,添加蛋白酶K及RNA酶A去除组蛋白和RNA成分,得到第一纯化DNA,然后采用1丁醇进行浓缩,得到1.8mg/mL的浓缩DNA,然后使用4.5号皮下注射器针头按照10次/min的频率吸打溶液约90次,得到2000bp左右的DNA片段,然后添加核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶DpnI消除提取和剪切处理过程中形成的单链结构以及被甲基化修饰过的DNA分子,再进行电泳凝胶纯化及切胶过柱纯化,回收制备得到高度纯化的双链DNA抗原。
2、磁性微球包被及悬浮:
取10-30mg含-NH2的裸磁性微球,用磷酸盐缓冲液洗3-5遍,加入1mL包被缓冲液,再加入0.1-0.2mL DCC和0.05-0.2mg靶抗原,室温震荡包被3h。
磁性微球包被缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
磁性微球存储缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
3、试剂盒组分:
1)磁性微球(包被有纯化的双链DNA分子)
2)ABEI标记的鼠抗人IgG单抗溶液,其中ABEI浓度为50ug/mL,已被ABEI标记的鼠抗人IgG单抗的浓度为1mg/mL;
3)检测缓冲液(不含核酸酶S1)
4)定标品(含有人源性抗双链DNA抗体)
低点定标品:20IU/mL
高点定标品:400IU/mL
5)质控品(含有人源性抗双链DNA抗体)
质控品1:50IU/mL
质控品2:200IU/mL
检测原理(同对比例1)
4、检测方法
同实施例1,温育温度改为30℃。
5、结果统计:
表5:灵敏度:
表6:特异性:
6、结果分析:
从表5和表6的数据可以看出,与对比例1相比,实施例2的试剂盒在临床检测方面的特异性从70.14%提高到89.86%,临床检测特异性得到极大的提高。表明纯化的双链DNA分子浓度满足检测要求,且在包被处理及后期保存过程中形成的单链DNA极少,因此,在除SLE的其他疾病样本中很少检测到阳性,具有较高的临床检测特异性。
实施例3:
1、抗原制备:
采用Sigma的DNA提取试剂盒从小牛胸腺组织提取双链DNA,添加蛋白酶K及RNA酶A去除组蛋白和RNA成分,然后用酚氯仿提纯,得到第一纯化DNA;采用2丁醇对第一纯化DNA进行浓缩,得到浓度为3mg/mL双链DNA。然后使用4.5号皮下注射器针头按照30次/min的频率吸打溶液约100次,以切断DNA分子至1000bp左右的DNA片段,然后添加核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶DpnI消除提取和剪切处理过程中形成的单链结构以及被甲基化修饰过的DNA分子,再进行电泳凝胶纯化及切胶过柱纯化,回收制备得到纯化的双链DNA抗原。
2、磁性微球包被及悬浮:
取10-30mg含-NH2的裸磁性微球,用磷酸盐缓冲液洗3-5遍,加入1mL包被缓冲液,再加入0.1-0.2mL DCC和0.05-0.2mg靶抗原,室温震荡包被3h。
磁性微球包被缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
磁性微球存储缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
3、试剂盒组分:
1)磁性微球(包被有纯化的双链DNA分子)
2)ABEI标记的鼠抗人IgG单抗溶液,其中ABEI浓度为50ug/mL,已被ABEI标记的鼠抗人IgG单抗的浓度为1mg/mL;
3)检测缓冲液(含核酸酶S1)
4)定标品(含有人源性抗双链DNA抗体)
低点定标品:20IU/mL
高点定标品:400IU/mL
5)质控品(含有人源性抗双链DNA抗体)
质控品1:50IU/mL
质控品2:200IU/mL
检测原理(同对比例1)
4、检测方法
该检测方法同实施例2
5、结果统计:
表7:灵敏度:
表8:特异性:
6、结果分析:
从表7和表8的数据可以看出,与对比例1相比,实施例3的试剂盒的临床检测特异性从70.14%提高到95.62%。实施例3与实施例2相比,试剂盒临床检测特异性从89.86%提高到95.62%,临床检测特异性得进一步提高。既表明纯化的双链DNA分子浓度(磁性微球:dsDNA比例范围1mg:5~20μg)、纯度及大小满足检测要求,另外,也表明在磁性微球包被处理过程及保存和运输过程中依然不可避免产生了少量单链DNA,但通过在检测缓冲液中添加适量的核酸酶S1,使产生的单链DNA被降解,从而进一步降低了假阳性,因此,利用该实施例的试剂盒在除SLE的其他疾病样本中极少检测到阳性,具有极高的临床检测特异性。
实施例4:
1、抗原制备:
采用Sigma的DNA提取试剂盒从小牛胸腺组织提取双链DNA,添加蛋白酶K及RNA酶A去除组蛋白和RNA成分,然后用酚氯仿提纯,得到第一纯化DNA;采用2丁醇对第一纯化DNA进行浓缩,得到浓度为2mg/mL双链DNA。使用4.5号皮下注射器针头按照20次/min的频率吸打溶液约120次,以切断DNA分子至1000bp左右的DNA片段,添加核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶消除提取和剪切处理过程中形成的单链结构以及被修饰过的DNA分子,再进行电泳凝胶纯化及切胶过柱纯化,回收制备得到纯化的双链DNA抗原。
2、磁性微球包被及悬浮:
取10-30mg含-NH2的裸磁性微球,用磷酸盐缓冲液洗3-5遍,加入1mL包被缓冲液,再加入0.1-0.2mL DCC和0.05-0.2mg靶抗原,室温震荡包被3h。
磁性微球包被缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
磁性微球存储缓冲液的成分及其浓度,其余为水:
3、试剂盒组分:
1)磁性微球(包被有纯化的双链DNA分子)
2)发光标记物:ABEI标记的鼠抗人IgG单抗溶液,其中ABEI浓度为50ug/mL,已被ABEI标记的鼠抗人IgG单抗的浓度为1mg/mL;
3)检测缓冲液(含核酸酶S1)
4)定标品(含有人源性抗双链DNA抗体)
低点定标品:20IU/mL
高点定标品:400IU/mL
5)质控品(含有人源性抗双链DNA抗体)
质控品1:50IU/mL
质控品2:200IU/mL
检测原理(同对比例1)
4、检测方法
(除反应温度为25±0.5℃外,其余步骤同实施例2)
5、结果统计:
表9:灵敏度:
表10:特异性:
6、结果分析:
实施例4与实施例3相比,临床检测灵敏度几乎无差异,临床检测特异性从95.62%提高到96.03%,临床检测特异性得进一步提高,说明在反应过程中降低反应温度也有助于提高抗双链DNA抗体临床检测特异性。
从上述对比例1及实施例1-4可以看出,在灵敏度方面,对比例1检测SLE的阳性率为66.23%,实施例1检测的SLE阳性率为61.04%,实施例2检测的SLE阳性率为56.62%,实施例3检测的SLE阳性率为54.55%,实施例4检测的SLE阳性率为55.06%。可见,随着检测特异性的显著提高,检测灵敏度并无明显降低。
由于抗双链DNA抗体在SLE中的阳性率为40%~90%,另外还有10%~60%的SLE患者体内不存在抗双链DNA抗体。一般情况下,在SLE患者血清中常常同时出现抗双链DNA抗体和抗单链DNA抗体,也有部分SLE患者体内单独存在抗单链DNA抗体而不存在抗双链DNA抗体。因此,从上述对比例1与实施例1~4的检测灵敏度的比对分析可知,对比例1多检出的SLE阳性样本极有可能是由于单链DNA分子的存在而造成的假阳性结果。
另外,从抗双链DNA抗体的临床应用角度考虑,***性红斑狼疮血清中一般存在多种自身抗体,一般对临床症状疑似***性红斑狼疮的患者会进行抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体等多种自身抗体进行检测,同时结合患者各种临床体征和其他检测结果综合考虑,因而,抗双链DNA抗体检测灵敏度的非明显的降低,对SLE的确诊影响较小。但抗双链DNA抗体特异性的降低往往会导致误诊,因***性自身免疫疾病在出现典型临床症状之前都比较相似,而抗双链DNA抗体被报道是SLE的特异性抗体,极少出现在其他自身免疫疾病中。因此,例如,***性红斑狼疮患者和类风湿关节炎患者在早期均可能会出现发热症状,而在早期的类风湿关节炎患者中就有可能因为疾病前期症状不明显,同时由于抗双链DNA抗体试剂盒中存在单链成分,从而得到抗双链DNA抗体阳性的结果,再结合症状容易误诊为SLE的错误诊断,造成误诊和错误用药治疗,可能造成严重后果。因此,抗双链DNA抗体的临床检测特异性尤为重要。
因此,与对比例1相比,本申请的上述实施例1~4的检测灵敏度从66.23%降低到55.06%的降幅对该试剂盒的应用影响较小。在此前提下,实施例1~4的临床检测特异性从70.14%提高到96.03%,特异性极大提高,大大提高了抗双链DNA抗体临床检测的特异性和准确性。
此外,发明人还按照与实施例4类似的操作方法,并按照表10和表11中的制备条件分别进行了实施例5至15,并对实施例5至15的检测结果进行统计,统计结果见表12至表15。其中,实施例5至15中双链DNA的制备步骤中,均添加核酸酶S1、外切核酸酶I和DpnI去甲基化酶进行处理。
表10:
表11:
表12:
表13:
表14:
表15:
从上述表10和11的制备条件以及表12至表15的效果数据可以看出,实施例15与对比例相比,特异性提高10%左右,实施例15与实施例1相比,特异性提高4%左右,说明在双链DNA的制备过程中添加核酸酶S1、外切核酸酶I和DpnI去甲基化酶有利于提高抗双链DNA抗体的临床检测特异性,同时,在检测缓冲液中添加核酸酶S1也有助于提高抗双链DNA抗体的临床检测特异性。从实施例2与实施例3的对比中可以得出,在检测缓冲液中添加核酸酶S1对特异性提高5%左右。实施例3与实施例10相比,说明DNA双链结构稳定剂可提高10%左右的检测特异性。实施例3与实施例7相比检测特异性提高4%左右,说明加入DNA分子保护剂可提高抗双链DNA抗体的临床检测特异性。由实施例11和实施例3相比可知,DNA分子保护剂和DNA双链结构稳定剂可协同提高12%的检测特异性。由实施例12-15与实施例3及相互之间的特异性大小进行比较可知,存储缓冲液的稳定性组分之间存在协同作用,可协同提高检测特异性。
综上,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:本申请通过制备得到高度纯化和长度适宜的平整双链DNA分子,优化抗原-磁性微球包被缓冲液和磁性微球偶联物保存液,用于提高双链DNA分子所处体系的Tm,从而稳定维持DNA分子的双链结构,另外,通过在试剂盒的检测缓冲液组分中添加适当浓度的核酸酶S1,若磁性微球在包被处理,保存及运输过程中依然不可避免产生了少量单链DNA,可在反应过程中通过检测缓冲液中的核酸酶S1将单链DNA降解,降低出现假阳性结果的风险,提高抗双链DNA抗体的临床检测特异性。同时降低反应过程温度,从而提高抗双链DNA抗体的临床检测特异性,最后,磁性微球管采用避光材料,进一步降低产生单链DNA的风险。此外,提供了一种能够保证检测灵敏度的情况下,提高特异性的抗dsDNA抗体测定试剂盒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种双链DNA抗原的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
提取双链DNA;
采用蛋白酶及RNA酶去除所述双链DNA中的组蛋白和RNA成分,得到第一纯化DNA;
将所述第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到剪切DNA;
采用核酸酶S1、外切核酸酶I和去甲基化酶消除所述剪切DNA中的单链和甲基化修饰的DNA分子,得到第二纯化DNA;
对所述第二纯化DNA进行纯化回收,得到所述双链DNA抗原。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,从小牛胸腺组织、鲑鱼精、Hela细胞、人血液或唾液中提取所述双链DNA;
优选地,采用4.5号皮下注射器针头对所述第一纯化DNA进行吹吸的方式将所述第一纯化DNA剪切成500~2000bp的片段,得到所述剪切DNA;
优选地,所述吹吸的频率为10~30次/min,所述吹吸的次数为90~120次;
更优选地,在对所述第一纯化DNA剪切之前,还包括对所述第一纯化DNA进行浓缩的步骤,进一步优选将所述第一纯化DNA浓缩至浓度为1.8~3mg/mL。
3.一种双链DNA抗原,其特征在于,所述双链DNA抗原采用权利要求1或2所述的制备方法制备而成。
4.一种检测抗双链DNA抗体的试剂,所述试剂包括双链DNA抗原,其特征在于,所述双链DNA抗原采用权利要求1或2所述的制备方法制备而成。
5.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括用于负载所述双链DNA抗原的固相载体,优选所述固相载体为磁性微球或微孔板。
6.根据权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述固相载体为磁性微球,所述试剂还包括用于将所述双链DNA抗原包被至所述磁性微球的包被缓冲液,优选所述包被缓冲液包括:
Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐以及酶抑制剂,所述包被缓冲液的pH为7.5~8.5;
更优选地,所述包被缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.3M的NaCl和/或KCl以及0.5~2mM的EDTA。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括pH为7.5~8.5的存储缓冲液,所述存储缓冲液包括:
基础缓冲液,所述基础缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、阳离子金属盐及防腐剂,优选所述基础缓冲液包括:10~50mM的Tris-HCl缓冲液,0.1~0.5M的NaCl和/或KCl,以及0.05~0.2wt%的防腐剂,更优选地,所述防腐剂为Proclin300或硫柳汞;
存储稳定液,所述存储稳定液包括DNA分子保护剂、酶抑制剂、表面活性剂、DNA双链结构稳定剂及封闭剂以中的任意一种或多种;
优选地,所述DNA分子保护剂为β-环状糊精、α-环状糊精或γ-环状糊精;更优选所述存储稳定液中,所述DNA分子保护剂的含量为1~3wt%;
优选地,所述表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂,更优选所述阴离子表面活性剂为SDS或SLS;所述非离子表面活性剂为PEG6000、聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20;进一步优选地,所述存储稳定液中,所述阴离子表面活性剂的含量为0.02~0.05wt%,所述非离子表面活性剂的含量为0.05~0.1wt%;
优选地,所述DNA双链结构稳定剂为含Al3+、Co3+或Ce3+的化合物;更优选所述存储稳定液中,所述DNA双链结构稳定剂的浓度为5~10mM;
优选地,所述酶抑制剂为0.5~2mM的EDTA;
优选地,所述封闭剂为0.5~2wt%的BSA、酪蛋白或明胶。
8.根据权利要求7所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括检测缓冲液,所述检测缓冲液中含有核酸酶S1,更优选所述检测缓冲液中所述核酸酶S1的浓度为0.5~2μg/L,进一步优选地,所述检测缓冲液还包括:10~50mM磷酸盐缓冲液、0.5~2wt%BSA、0.1~0.3M氯化钠及0.05~0.2wt%Proclin300。
9.一种检测抗双链DNA抗体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求4至8中任一项所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括发光标记物、定标品及质控品中的任意一种或多种;优选所述发光标记为抗人IgG、IgA或IgM标记的ABEI,所述定标品和所述质控品各自独立地为人源性的抗双链DNA的抗体。
11.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中的双链DNA抗原以抗原-固相载体偶联物的形式存在,所述固相载体为磁性微球。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于盛放所述抗原-固相载体偶联物的磁性微球管,所述磁性微球管采用避光材料制成。
13.一种抗双链DNA抗体的检测方法,所述检测方法包括利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤,其特征在于,所述抗双链DNA抗体的靶抗原为权利要求1或2所述的制备方法制备而成的双链DNA抗原。
14.根据权利要求13所述的检测方法,其特征在于,所述利用抗双链DNA抗体的靶抗原通过化学发光免疫法检测待测样品中的抗双链DNA抗体的浓度的步骤中,反应温度为25~30℃。
15.权利要求1或2所述的制备方法制备而成的双链DNA抗原或权利要求4至8中任一项所述的检测抗双链DNA抗体的试剂或由权利要求9至12中任一项所述的检测抗双链DNA抗体的试剂盒在抗双链DNA抗体临床检测中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述应用包括对***性红斑狼疮的临床辅助诊断。
17.权利要求9至12中任一项所述的试剂盒在抗核抗体检测中的应用,其特征在于,所述应用包括:将所述试剂盒应用于半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810127235.5A CN108469526B (zh) | 2018-02-08 | 2018-02-08 | 双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810127235.5A CN108469526B (zh) | 2018-02-08 | 2018-02-08 | 双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108469526A true CN108469526A (zh) | 2018-08-31 |
CN108469526B CN108469526B (zh) | 2020-09-11 |
Family
ID=63266354
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810127235.5A Active CN108469526B (zh) | 2018-02-08 | 2018-02-08 | 双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108469526B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112881680A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-06-01 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 连接有dsDNA的磁性微粒的制备方法 |
CN112946253A (zh) * | 2019-12-11 | 2021-06-11 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于免疫诊断试剂中固相载体的封闭阶段处理剂及应用和产品 |
CN112941148A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-11 | 通用生物***(安徽)有限公司 | 一种核酸引物保存液的制备方法 |
CN114076823A (zh) * | 2020-08-13 | 2022-02-22 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 固相组分的制备方法及所制备的固相组分 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4493899A (en) * | 1981-10-16 | 1985-01-15 | City Of Hope | Method of testing for particular antibodies in the serum of a patient |
US5183735A (en) * | 1989-02-27 | 1993-02-02 | Reaads Medical Products, Inc. | Method and diagnostic test kit for detection of anti-dsDNA antibodies |
CN101165491A (zh) * | 2006-10-19 | 2008-04-23 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法 |
CN101776682A (zh) * | 2009-05-20 | 2010-07-14 | 上海富莼科芯生物技术股份有限公司 | 一种双链dna抗原的制备方法和检测人血清抗双链dna抗体的试剂盒 |
CN105929156A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-09-07 | 北京中航赛维生物科技有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法 |
CN106442970A (zh) * | 2016-06-30 | 2017-02-22 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 |
-
2018
- 2018-02-08 CN CN201810127235.5A patent/CN108469526B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4493899A (en) * | 1981-10-16 | 1985-01-15 | City Of Hope | Method of testing for particular antibodies in the serum of a patient |
US5183735A (en) * | 1989-02-27 | 1993-02-02 | Reaads Medical Products, Inc. | Method and diagnostic test kit for detection of anti-dsDNA antibodies |
CN101165491A (zh) * | 2006-10-19 | 2008-04-23 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法 |
CN101776682A (zh) * | 2009-05-20 | 2010-07-14 | 上海富莼科芯生物技术股份有限公司 | 一种双链dna抗原的制备方法和检测人血清抗双链dna抗体的试剂盒 |
CN105929156A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-09-07 | 北京中航赛维生物科技有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法 |
CN106442970A (zh) * | 2016-06-30 | 2017-02-22 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
AMANDA M. GUTH等: "Chromatin specificity of anti-double-stranded DNA antibodies and a role for Arg residues in the third complementarity-determining region of the heavy chain", 《J IMMUNOL》 * |
B.QIAO等: "Induction of systemic lupus erythematosus-like syndrome in syngeneic mice by immunization with activated lymphocyte-derived DNA", 《RHEUMATOLOGY》 * |
唐秋艳等主编: "《免疫诊断试剂实用技术》", 31 August 2009 * |
夏金华: "血清中抗双链DNA抗体的检查及其意义", 《赣南医学院学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112946253A (zh) * | 2019-12-11 | 2021-06-11 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于免疫诊断试剂中固相载体的封闭阶段处理剂及应用和产品 |
CN114076823A (zh) * | 2020-08-13 | 2022-02-22 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 固相组分的制备方法及所制备的固相组分 |
CN114076823B (zh) * | 2020-08-13 | 2024-05-17 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 固相组分的制备方法及所制备的固相组分 |
CN112881680A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-06-01 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 连接有dsDNA的磁性微粒的制备方法 |
CN112941148A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-11 | 通用生物***(安徽)有限公司 | 一种核酸引物保存液的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108469526B (zh) | 2020-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | Neutrophil extracellular traps mediate m6A modification and regulates sepsis-associated acute lung injury by activating ferroptosis in alveolar epithelial cells | |
CN108469526A (zh) | 双链dna抗原、其制备方法、包含其的试剂、试剂盒及应用 | |
Castaman et al. | Diagnosis and treatment of von Willebrand disease and rare bleeding disorders | |
Day et al. | C1r deficiency: an inborn error associated with cutaneous and renal disease | |
Vossenaar et al. | The presence of citrullinated proteins is not specific for rheumatoid synovial tissue | |
Liu et al. | Specific post-translational histone modifications of neutrophil extracellular traps as immunogens and potential targets of lupus autoantibodies | |
Vossenaar et al. | Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis | |
Kalf | Deoxyribonucleic acid in mitochondria and its role in protein synthesis | |
Kuroishi et al. | Biotinylation is a natural, albeit rare, modification of human histones | |
KR970005045B1 (ko) | 리보자임 조성물 및 그 사용방법 | |
Brooks et al. | Ferritin crystal cataracts in hereditary hyperferritinemia cataract syndrome | |
Hernáez et al. | Small peptide inhibitors disrupt a high-affinity interaction between cytoplasmic dynein and a viral cargo protein | |
LUO et al. | Acquired factor XIII inhibitor: clinical features, treatment, fibrin structure and epitope determination | |
Cho et al. | Identification of HnRNP-A2/B1 as a target antigen of anti-endothelial cell IgA antibody in Behçet's disease | |
EP3098602B1 (en) | Distinction of infectious virus based on molecular biomarker and neutralization of virus causing food poisoning | |
Khider et al. | Inherited thrombophilia in the era of direct oral anticoagulants | |
CN104231085A (zh) | 靶向特异性补体***抑制剂、其制备方法及应用 | |
KR20140108718A (ko) | 가와사키 질환용 바이오마커 | |
Liu et al. | N6‐methyladenosine‐modified circRNA RERE modulates osteoarthritis by regulating β‐catenin ubiquitination and degradation | |
Han et al. | Retracted: Effects of FOSL1 silencing on osteosarcoma cell proliferation, invasion and migration through the ERK/AP‐1 signaling pathway | |
Gong et al. | CircZSWIM6 mediates dysregulation of ECM and energy homeostasis in ageing chondrocytes through RPS14 post‐translational modification | |
Hardison et al. | Cigarette smoke enhances chemotaxis via acetylation of proline-glycine-proline | |
Badimon et al. | Vascular Dysfunction in Alzheimer’s Disease: Alterations in the Plasma Contact and Fibrinolytic Systems | |
Solheim et al. | Prothrombotic markers in patients with acute myocardial infarction and left ventricular thrombus formation treated with pci and dual antiplatelet therapy | |
JP4383170B2 (ja) | ヒストン脱アセチル化酵素9 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |