KR20140108718A

KR20140108718A - 가와사키 질환용 바이오마커

Info

Publication number: KR20140108718A
Application number: KR1020147021229A
Authority: KR
Inventors: 버지니아 엠. 파스쿠알; 자오휘 쉬; 옥타비오 라밀로; 롤란도 치마츠
Original assignee: 베일러 리서치 인스티튜트
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-09-12
Also published as: CN104160039B; CN104160039A; EP2798081A1; JP2015505245A; WO2013101758A1; US20140348818A1; CA2862270A1

Abstract

가와사키 질환(KD)의 바이오마커가 제공된다. 소정 양상에서, KD 바이오마커, 예를 들면, 상승된 PDGFC 발현을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 유사하게, KD의 바이오마커를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 기술되어 있다.

Description

가와사키 질환용 바이오마커{BIOMARKERS FOR KAWASAKI DISEASE}

본 발명의 배경

본 출원은, 본원에 인용에 의해 포함된, 2011년 12월 29일에 제출된 미국 가특허 출원 제61/581,199호에 대한 우선권을 주장한다.

1. 본 발명의 분야

본 발명은, 일반적으로, 의학 및 의료 진단 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 가와사키 질환을 검출하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

가와사키 질환(KD)은, 대부분의 사례가 6개월 내지 4세의 아동에서 발생하는 연령-특이적 분포를 갖는다. 이는, 일본에서, 그리고, 일본인 혈통에서, 5세 연령 미만의 아동 100,000명당 약 112 사례의 연간 발병률로 더욱 일반적이다. 미국에서, 가와사키 질환의 발병률은, 2000년에 중위 연령 2세의 가와사키 질환 관련된 4248명의 입원으로서 최적 추정되었다. KD는, 전형적으로 5일 이상 동안의 고열로 시작하여, 다른 기본적인 특징 및 실험실/임상학적 발견으로 나타난다. 관상 동맥은 거의 항상 부검 사례에 수반되지만, 가와사키 질환은 신체에 걸친 혈관에 관련된 범 전신성 혈관염이다. 동맥류는, 다른 실질외 근육 동맥, 예를 들면, 복강, 장간막, 대퇴부, 장골, 신장, 액와 및 상완 동맥에서 발생할 수 있다.

가와사키 질환의 병인은, 임상학적 및 역학적 특징들이 감염성 원인을 시사하지만, 알려지지 않은 상태로 남아 있다. 호중구의 유입은, 림프구(주로 CD8⁺ T 세포) 및 IgA 혈장 세포와 협력하여 큰 단핵 세포로 신속하게 전이되면서, 초기 단계(발병 후 7 내지 9일)에서 발견된다. 내탄성판의 파괴 및 궁극적으로 섬유아세포 증식은 이 단계에서 발생하고, 또한, IL-1 및 TNF-알파의 순환 수준도 KD 환자에서 상승된다. 활성 염증은 수주 내지 수개월에 걸쳐 반흔 형성과 함께 점진적 섬유증으로 대체된다. 그러나, 상세한 연구에도 불구하고, KD의 진단은 여전히 임상학적 증상을 기초로 하고, 따라서, 치료요법의 적용이 가장 효과적일 수 있는 질환의 초기 단계에 정확한 진단이 이루어질 수 없는 경우가 종종 있다.

본 발명의 요약

제1 실시형태에서, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 생물학적 샘플 중의 EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816, PDGFC 또는 OLFM4 발현 수준을 측정함을 포함하고, 여기서, 기준 수준에 비하여 상승된 발현은, 상기 대상체를 KD의 바이오마커를 갖는 것으로 동정하는, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 KD의 바이오마커를 검출하기 위한 방법이 제공된다.

추가의 실시형태에서, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 생물학적 샘플 중의 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2 또는 TMCC1 발현 수준을 측정함을 포함하고, 여기서, 기준 수준에 비하여 감소된 발현은, 상기 대상체를 KD의 바이오마커를 갖는 것으로 동정하는, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체에서 KD의 바이오마커를 검출하기 위한 방법이 제공된다.

또한, 추가의 실시형태에서, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 생물학적 샘플 중의 PDGFC 발현 수준을 측정함을 포함하고, 여기서, 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현은, 상기 대상체를 KD의 바이오마커를 갖는 것으로 동정하는, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체에서 가와사키 질환(KD)의 바이오마커를 검출하기 위한 방법이 제공된다.

또한, 추가의 실시형태에서, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 상기 대상체에서 바이오마커의 발현을 평가하는 단계; 및 (b) 상기 대상체가 바이오마커를 포함하는 경우에 상기 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여하는 단계를 포함하는, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 몇몇의 양상에서, 상기 바이오마커의 발현을 평가하는 것은, 대상체 유래의 샘플 중의 바이오마커 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 양상에서, 바이오마커의 발현을 평가하는 것은, 대상체 유래의 샘플 중의 바이오마커 발현의 수준을 제공하는 보고서의 분석을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇의 양상에서, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 상기 대상체에서 PDGFC의 발현을 평가하는 단계, 및 (b) 상기 대상체가 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현을 나타내는 경우에 상기 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여하는 단계를 포함하는, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

추가의 실시형태에서, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 상기 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여하는 단계; (b) 상기 대상체에서 PDGFC의 발현을 평가하는 단계; 및 (c) 상기 대상체가 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현을 나타내는 경우에 상기 대상체에게 추가의 항-KD 치료요법을 투여하는 단계를 포함하는, KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 따라서, 소정 양상에서, 당해 실시형태의 방법은 항-KD 치료요법의 유효성을 모니터링하거나 측정하기 위한 방법으로서 정의될 수 있다.

또한, 추가의 실시형태에서, KD 바이오마커를 갖는 것으로 측정된 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여함을 포함하는, KD를 치료하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 소정 양상에서, 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현을 갖는 것으로 측정된 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여함을 포함하는, KD를 치료하는 방법이 제공된다.

실시형태들의 소정 양상들은, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체에 관한 것이다. 예를 들면, 대상체는 하기 증상들: 구강 홍반; 발진; 부은 입술; 갈라진 입술; 손의 종창; 발의 종창; 눈 발적; 포도막염; 무균성 수막염; 림프절 염증; 혈관 염증; 관상 동맥류; 발열(예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5일 이상 동안 진행되는 지속적인 발열); 관절 통증; 관절 종창; 또는 조상(nail bed), 손바닥, 발바닥 및 서혜부에 걸친 피부 박리 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.

몇몇의 양상에서, 대상체는 아동, 예를 들면, 6개월령 내지는 2, 3, 4, 또는 5세 연령의 아동이다. 또한, 추가의 양상에서, 대상체는 사람 대상체, 예를 들면, 아시아(예를 들면, 일본인) 혈통의 대상체이다. 소정 양상에서, 대상체는, KD 바이오마커(예를 들면, 상승된 PDGFC 발현 수준)를 포함하지 않는 대상체일 수 있다.

실시형태들의 소정 양상들은, 대상체 유래의 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액(예를 들면, 혈청), 타액, 뇨, 분변, 또는 조직 샘플에 관한 것이다. 소정 양상에서, 샘플은 대상체로부터 직접적으로(예를 들면, 대상체로부터 채혈함으로써) 수득될 수 있다. 추가의 양상에서, 샘플은 제3자(예를 들면, 의사)에 의해 얻어진 샘플일 수 있거나, 조직 또는 혈액 은행 유래일 수 있다. 몇몇의 양상에서, 샘플은, 예를 들면, 샘플로부터 단백질 또는 핵산(예를 들면, RNA)을 단리하거나 농축시킴으로써 프로세싱될 수 있다. 예를 들면, 샘플은, 단백질 또는 핵산을 정제하거나 부분적으로 정제하기 위해 또는 소정 단백질 또는 핵산을 제거하기 위해(예를 들면, 과도한 글로빈 RNA를 제거하기 위해) 처리될 수 있다.

실시형태들의 양상들은, 샘플 중의 KD 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 발현을 측정하는 것은, 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 바이오마커의 발현은, 예를 들면, RNA 또는 단백질 발현을 검출함으로써 또는 RNA 또는 단백질의 활성을 검출함으로써 측정될 수 있다. 따라서, 소정 양상에서, 바이오마커의 발현을 측정하는 것은, 샘플 중의 RNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 양상에서, 실시형태의 방법은, 샘플 중의 바이오마커의 발현을 (예를 들면, 보고서 또는 전자 보고서로) 보고하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 추가의 양상에서, 실시형태의 방법은, 샘플(또는 대상체)가 KD 바이오마커를 갖는지의 여부를 보고하는 것을 포함할 수 있다.

몇몇의 실시형태에서, 당해 방법은, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준에 관한 데이터에 기초한 진단학적 점수를 측정하거나 계산하는 것을 포함할 것이고, 이는, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준이 상기 점수가 기반으로 하는 하나 이상의 인자들임을 의미한다. 진단학적 점수는 생물학적 샘플에 대한 정보, 예를 들면, 샘플이, KD를 갖는 대상체 유래일 일반적 가능성을 제공할 것이다. 소정 실시형태에서, 가능성 값은, 대상체가 KD를 가질 0% 공산 내지 100% 공산의 가능성을 나타내는 수적 정수로서 나타낸다. 몇몇의 실시형태에서, 가능성 값은, 대상체가 KD를 가질 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 공산의 가능성을 나타내는 수적 정수(또는 이들 내에서 유도가능한 임의의 범위)로서 나타낸다.

실시형태들의 소정 양상들은 샘플 중의 PDGFC의 발현을 측정하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 샘플 중의 PDGFC RNA 및/또는 단백질 발현이 측정될 수 있다. 소정 양상에서, 발현을 측정하는 것은, 활성 PDGFC의 발현(예를 들면, 기능성 단백질을 암호화하는 PDGFC RNA의 발현)을 측정하는 것을 포함한다. 소정 양상에서, PDGFC의 발현을 측정하는 것은, 샘플 중의 RNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

바이오마커의 발현을 측정하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 임의의 이러한 방법은 KD 바이오마커와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 단백질 발현을 검출하는 경우에 사용될 수 있는 방법으로는 질량 분광학, 압타머 결합 검정 또는 항-바이오마커 항체를 사용하는 면역-검출 방법(예를 들면, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 IHC)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바이오마커의 RNA 발현을 측정하는 경우에 사용될 수 있는 방법으로는 핵산 하이브리드화(예를 들면, 노던 블롯 또는 어레이에 대한 하이브리드화), 핵산 서열분석 또는 역 전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시형태들의 소정 양상들은, 샘플 중의 KD 바이오마커의 발현이 상승되는지의 여부를 측정하는 것을 포함한다. 예를 들면, KD 바이오마커(예를 들면, PDGFC)의 발현은, 기준 발현 수준, 예를 들면, 건강한 대상체 또는 KD를 갖지 않는 대상체 유래의 샘플 중의 발현 수준에 대해 비교할 수 있다. 예를 들면, PDGFC의 경우에, RNA 발현의 상승된 수준은, 발현의 기준 수준에 대한 PDGFC RNA 발현의 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 내지 약 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50배 이상의 PDGFC RNA 발현을 포함할 수 있다. 또한, 추가의 양상에서, PDGFC 발현 수준을 측정하는 것은, 활성 PDGFC 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA(예를 들면, 서열번호 1의 서열을 암호화하는 RNA)의 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 소정 양상에서, PDGFC 발현을 측정하는 것은, 활성 PDGFC 폴리펩타이드를 암호화하는 PDGFC RNA의 발현을 측정하는 것, 또는 활성 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 PDGFC RNA에 대한 활성 PDGFC 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA의 발현 비를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 추가의 실시형태는, 샘플 중의 KD 바이오마커의 발현 및 적어도 제2 유전자의 발현을 측정하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 제2 유전자는 제어 유전자일 수 있다. 소정 양상에서, 제어 유전자의 발현은, 샘플 크기 또는 샘플 품질의 차이를 고려하기 위해서, KD 바이오마커의 발현 수준을 표준화하는데 사용할 수 있다. 추가의 양상에서, 제2 유전자는 추가의 바이오마커일 수 있다. 예를 들면, 소정 양상에서, 실시형태들의 방법은, 샘플 중의 PDGFC 발현을 측정하는 것, 및 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 및 OLFM4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 제2 유전자의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 또한, 추가의 양상에서, 샘플 중에서 KD와 관련된 적어도 제2 유전자로부터의 발현이 측정되고, 여기서, 상기 제2 유전자는 TNFα, IL-1, 또는 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 공개 제20110189698호 또는 제20090304680호에 기술되어 있는 유전자들 중 하나이다. 따라서, 소정 양상에서, 방법은, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 샘플 중의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 또는 30개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다.

실시형태들의 추가의 양상들은, KD를 갖거나 KD를 갖는 것으로 진단된 대상체 또는 KD의 바이오마커를 갖는 것으로 측정된 대상체(예를 들면, 상승된 PDGFC 발현을 갖는 것으로 측정된 대상체)의 치료에 관한 것이다. 예를 들면, 대상체는, 적절한 항-KD 치료요법으로, 예를 들면, IgG, 아스피린, 코르티코스테로이드 및/또는 항-TNFα 치료요법의 투여에 의해 치료될 수 있다. 또한, 추가의 양상에서, IgG 투여를 포함하지 않는 항-염증성 치료요법을 투여함을 포함하는, KD의 바이오마커를 갖지 않는 것으로 측정된 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

또한, 추가의 실시형태에서, a) KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 샘플 중의 KD 바이오마커의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하는 단계; 및 b) 기준 수준에 대해 비교한 상대적인 수준의 KD 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 컴퓨터에 의해 실행되는 경우에 컴퓨터가 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드를 포함하는 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체가 제공된다. 예를 들면, a) KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 샘플 중의 PDGFC의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하는 단계; 및 b) 기준 수준에 대해 비교한 상대적인 수준의 PDGFC의 발현을 측정하는 단계[여기서, 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현은 KD의 바이오마커의 존재를 나타낸다]를 포함하는, 컴퓨터가 작업을 수행하도록 할 수 있는 컴퓨터-판독가능한 코드. 소정 양상에서, 컴퓨터-판독가능한 코드는, 추가로, 컴퓨터가 건강한 대상체 유래의 샘플 중의 KD 바이오마커(예를 들면, PDGFC) 발현의 기준 수준에 상응하는 정보를 수득하도록 한다. 추가의 양상에서, 컴퓨터-판독가능한 매체는, 상기 매체에 저장된 기준 수준(예를 들면, PDGFC 기준 수준)을 포함한다.

또한, 추가의 양상에서, 컴퓨터-판독가능한 매체는, 하나 이상의 추가의 작업: 바이오마커 발현, 예를 들면, PDGFCDML 발현의 상대적인 수준에 상응하는 정보를 유형적 데이터 저장 장치에 전송하고/전송하거나 샘플에 대한 진단학적 점수를 계산하는 것을 수행하기 위한 코드를 포함하고, 여기서, 상기 진단학적 점수는, 샘플이 KD를 갖는 대상체 유래의 샘플일 가능성의 지표이다. 또한, 추가의 양상에서, 컴퓨터-판독가능한 매체는, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 샘플 중의 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 또는 OLFM4 중 하나의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하기 위한 코드를 포함한다.

본원에 개시되는 예시 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체에 의해 유도된 작업의 수행시 프로세서 또는 프로세서들을 사용할 수 있다. 대안으로, 프로세서 또는 프로세서들은 하드웨어 제어, 또는 하드웨어 및 소프트웨어 제어의 조합 하에 이들 작업을 수행할 수 있다. 예를 들면, 프로세서는, 이들 하나 이상의 작업을 수행하도록 특이적으로 구성된 프로세서, 예를 들면, 응용 주문형 집적 회로(ASIC) 또는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)일 수 있다. 프로세서 또는 프로세서들의 사용은, 프로세서 또는 프로세서들의 보조 없이 불가능하거나, 프로세서 또는 프로세서들로 달성 가능한 속도 이하의 정보(예를 들면, 데이터)의 프로세싱을 가능하게 한다. 이러한 작업의 수행의 몇몇의 실시형태는, 소정량의 시간, 예를 들면, 1시간 이하, 30분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 1분 이하, 1초 이하, 1초와 1시간 사이의 초 간격으로의 모든 시점 이하를 포함하는, 컴퓨터 시스템, 프로세서 또는 프로세서들을 사용하지 않고 작업을 수행하는데 걸릴 수 있는 시간 미만의 시간량 내에 달성될 수 있다.

본 발명의 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체의 몇몇 실시형태는, 예를 들면, CD-ROM, DVD-ROM, 플래시 드라이브, 하드 드라이브, 또는 임의의 기타 물리적 저장 장치일 수 있다. 본 발명의 방법의 몇몇 실시형태는, 본 발명의 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체와 관련된 것들을 포함하는, 컴퓨터에 의해 실행되는 경우에 컴퓨터가 본원에 개시된 작업들 중 어느 하나를 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드를 갖는 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체를 기록하는 것을 포함할 수 있다. 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체를 기록하는 것은, 예를 들면, 데이터를 CD-ROM 또는 DVD-ROM 상에 버닝하거나(burning), 달리는 물리적 저장 장치에 데이터를 저장시키는 것을 포함할 수 있다. 소정 양상에서, 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체는 실시형태의 키트에 포함될 수 있다.

또한, 개시된 조성물 또는 개시된 방법을 실행하는데 사용되는 조성물을 함유하는 키트도 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 키트를 사용하여 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정할 수 있다. 소정 실시형태에서, 키트는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 그 이상, 또는 임의의 범위, 및 상기 범위 내에서 유도가능한 조합의, 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 RNA 바이오마커에 대해 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 것들을 포함하는, 핵산 프로브를 함유하거나, 적어도 이들을 함유하거나, 최대 이들을 함유한다. 추가의 실시형태에서, 키트 또는 방법은, 핵산 프로브를 포함할 수 있고, 이는, 하기 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816, PDGFC 및 OLFM4 중 하나 이상의 RNA 발현을 특이적으로 검출할 수 있다.

또한, 추가의 실시형태에서, 당해 실시형태의 키트는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 그 이상, 또는 임의의 범위 및 상기 범위 내에서 유도가능한 조합의, 본원에 기술된 바이오마커들에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 키트 또는 방법은 항체를 포함할 수 있고, 이는, 하기 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816, PDGFC 및 OLFM4 중 하나 이상의 단백질 발현을 특이적으로 검출할 수 있다.

또한, 추가의 실시형태에서, 키트는, 적어도, 기능성 PDGFC 단백질(예를 들면, 서열번호 1)을 암호화하는 PDGFC RNA에 대해 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 제1 핵산 프로브, 및 적어도, 기능성 PDGFC 단백질(예를 들면, 서열번호 3)을 암호화하지 않는 PDGFC RNA에 대해 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 제2 핵산 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들면, 당해 실시형태의 키트는, 적어도, 기능성 PDGFC 단백질(예를 들면, 서열번호 1)을 암호화하는 PDGFC RNA 유래의 서열의 분절을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 제1 프라이머 쌍, 및 적어도, 기능성 PDGFC 단백질(예를 들면, 서열번호 3)을 암호화하지 않는 PDGFC RNA 유래의 서열의 분절을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하나의" 또는 "한"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 청구항(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에는 단어 "하나의" 또는 "한"은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

본원에서 논의된 임의의 실시형태는 임의의 개시된 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있음, 또한 그 반대의 경우도 고려된다. 특정 췌장 장애와 관련하여 논의된 임의의 실시형태는, 상이한 췌장 장애와 관련하여 적용되거나 실행될 수 있다. 추가로, 개시된 조성물 및 키트를 사용하여, 개시된 방법을 달성할 수 있다.

특허청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은, 상호 배타적인 선택만을 또는 선택을 말하는 것으로 명확하게 나타내지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시는, 선택만을 그리고 "및/또는"을 나타내는 정의를 시사한다. 본원에 사용된 바와 같은 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 전체에서, 용어 "약"은, 값이, 값을 측정하는데 사용되는 장치, 방법에 대한 오차류의 고유 편차 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 편차를 포함함을 나타내는 것으로 사용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만 예시의 방식으로서만 제공되고, 따라서, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 각종 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 분야 숙련가에게 명백해질 것임이 이해되어야만 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 소정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 나타낸 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: 염증과 관련된 신호전달에 관여하는 유전자의 네트워크의 도식적 표현. KD 혈액에서 구별적으로 조절되는 것으로 발견된 유전자 전사체는 신호전달 네트워크 상에 맵핑되었다. +는, KD에서 상향-조절된 전사체를 나타낸다. (-)는, KD에서 하향-조절된 전사체를 나타낸다.
도 2: 결합 조직 발달과 관련된 신호전달에 관여하는 유전자의 네트워크의 도식적 표현. KD 혈액에서 구별적으로 조절되는 것으로 발견된 유전자 전사체는 신호전달 네트워크 상에 맵핑되었다. +는, KD에서 상향-조절된 전사체를 나타낸다. (-)는, KD에서 하향-조절된 전사체를 나타낸다.
도 3: PDGFC 전사체는 KD 환자의 혈액에서 5 내지 30배 상향-조절된다. 챠트는, 건강한 대조군에 대한 평균 발현에 대한 PDGFC 전사체 발현에서의 배수 변화(FC)를 나타낸다. 그 결과는, PDGFC 전사체의 3개의 영역에서 정량적 RT-PCR에 의해 수득되었다.
도 4: 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 PDGFC 전사체는 KD 환자에서 상향-조절된다. 그래프는, 기능성 단백질을 암호화하는 PDGFC 전사체 대 기능성 PDGFC ORF를 포함하지 않는 전사체의 비를 나타낸다. KD는, KD 환자 유래의 샘플을 나타낸다. H는, 건강한 대상체 유래의 샘플을 나타낸다.
도 5: KD 및 기타 유열성 질환 유래의 전혈 중의 PDGFC 전사체 수준은 정량적 RT-PCR로 평가하였다.
도 6: 마이크로어레이 분석은, PDGFC 전사가 KD 환자에서 상향-조절됨을 나타낸다.

I. 본 발명

가와사키 질환은, 6개월령 내지 4세 사이에서 나타나는 80% 초과의 KD 사례를 갖는 아동에서의 후천성 심장 질환의 주요 원인이다. KD의 원인은 알려져 있지 않고, 감염성 제제는 의심되지만, 유전학 및 환경도 질환에서 역할을 행하는 것으로 나타난다. 현재, KD 진단은, 임상학적 특징의 조합에 의해서만 달성될 수 있고, 따라서, 신속한 진단이 불가능하다. 불행하게도, 지연된 진단(및 결과로 초래된 적절한 치료의 적용 지연)은, 심각한 합병증의 가능성을 증가시킨다. 실제로, 관상 동맥류는 치료되지 DSKG은 환자들의 무려 20%에서 발병하고, 치료된 환자들의 단지 5%만이 이러한 동맥류를 발병한다. 따라서, KD의 신속한 진단 방법이 매우 필요하다.

여기서 설명된 본 연구는, 다른 IL-1 관련 질환 - 신생아 발병 다중 시스템 염증성 질환(NOMID) 및 전신 발병 소아 특발성 관절염(sJIA)과 비교하여 KD 환자의 실험된 유전자 발현 수준을 실험하였다. 이들 3개의 질환에서의 유전자 발현 패턴 전체는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 유전자의 수는, KD의 경우에만 특이적으로 상향- 또는 하향-조절되었음을 확인하였다. 특히, 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC)는, 가와사키 질환에서 특이적으로 상향-조절되지만, NOMID 및 sJIA에서는 상향-조절되지 않는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC)는, 가와사키 환자에서는 특이적으로 상향-조절되지만, 소아 피부근염(JDM), 전신 홍반성 낭창(SLE), 리노바이러스 감염, 에스케리키아 콜라이 감염, 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA) 감염 또는 스태필로코커스 아우레우스(Staph) 감염에서는 상향-조절되지 않는 것으로 밝혀졌다. 추가로, KD 환자는, 기능성 PDGFC 단백질을 암호화한 PDGFC 전사체의 증가된 수준을 우선적으로 발현시켰음이 밝혀졌다.

따라서, 여기서 설명된 본 연구는, 증가된 PDGFC 발현이 KD를 진단하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 입증한다. 예를 들면, KD를 갖는 것으로 의심되는 환자 유래의 혈청 샘플을 분석하여 PDGFC 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 상승된 PDGFC 발현 수준 또는 상승된 활성 PDGFC RNA 이소형 발현을 사용하여 대상체가 KD를 갖는지의 여부를 측정할 수 있다. 이러한 신속한 진단은, 유사하게, 질환의 중증도를 유의하게 감소시키고 관상 동맥류와 같은 합병증을 발병할 가능성을 감소시킬 수 있는 초기 치료학적 중재를 허용할 것이다.

II. PDGFC

PDGFC는 조직 성장 및 기능에 중요하고, 약물-내성 종양과 관련된 섬유아세포를 모집하는 역할을 한다. 우선, 유전자는 유전자의 PDGF/VEGF 계열의 다른 구성원과의 유사성에 의해 동정되었다(Reigstad et al., 2005). 2개의 상이한 mRNA 전사체가 동정되었다. 2개의 PDGFC 암호화 RNA들 중 짧은 것이 PDGFC 단백질(NM_016205.2, 본원에 인용에 의해 포함됨; 서열번호 1)에 대한 기능성 개방 판독 프레임(ORF)을 암호화한다. 보다 긴 전사체는, PDGFC 암호화 영역을 프레임 외부로 위치시키고, 따라서, 기능성 PDGFC 단백질(NR_036641.1, 본원에 인용에 의해 포함됨; 서열번호 3)을 암호화하지 않는, 택일적 스플라이스 사건을 포함한다.

실시형태의 소정 양상은 샘플 중의 PDGFC의 발현을 측정하는 것에 관한 것이다. 몇몇의 양상에서, PDGFC의 발현을 측정하는 것은, 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 RNA, 및 기능성 단백질을 암호화하지 않는 RNA의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 그러나, 소정 양상에서, PDGFC의 발현을 측정하는 것은, 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 RNA의 발현을 측정하는 것, 또는 기능성 단백질을 암호화하지 않는 RNA에 대한 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 RNA의 발현비를 측정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 RNA의 상승된 발현을 갖거나, 기능성 단백질을 암호화하지 않는 RNA에 대한 기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 RNA의 증가된 발현비를 갖는 대상체는, KD의 바이오마커를 갖는 것으로 측정될 수 있다.

당해 분야 숙련가는, 각종 방법들이 PDGFC RNA 발현을 측정하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이고, 기능성 단백질(예를 들면, 서열번호 1)을 암호화하는 RNA와 기능성 단백질(예를 들면, 서열번호 3)을 암호화하지 않는 RNA의 발현을 알아차릴 수 있을 것이다. 예를 들면, 하나의 RNA 또는 다른 RNA에 대해 고유한 서열의 영역만을 하이브리드화하는 하이브리드화 프로브를 사용할 수 있다. 유사하게, 하나의 RNA 또는 다른 RNA 유래의 서열만을 증폭시킬 수 있는 프라이머, 또는 상이한 PDGFC RNA의 경우에 상이한 길이의 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 RT-PCR에 사용할 수 있다. 기능성 대 비-기능성 RNA를 정량할 수 있는 이러한 하나의 검출 방법은 본원에 예시된다.

III . KD 바이오마커의 검출

소정 실시형태는, 생체내에서 또는 샘플에서 KD 바이오마커의 발현을 검출하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, KD 바이오마커(예를 들면, PDGFC)의 발현은, 단백질의 발현 또는 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다. 추가의 양상에서, KD 바이오마커의 발현은, 바이오마커를 암호화하는 RNA의 발현을 측정함으로써 검출될 수 있다.

A. 핵산 검출

몇몇 실시형태에서, KD 바이오마커(예를 들면, PDGFC)의 발현을 평가하는 것은, mRNA 발현을 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 노던 블롯 기술은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 노던 블롯팅은, 표적으로서 RNA를 사용하는 것을 포함한다. 간략하게, 프로브를 사용하여, 적합한 매트릭스(종종 니트로셀룰로스의 필터) 상에 고정화된 RNA 종을 표적으로 한다. 상이한 종들을 공간적으로 분리하여 분석을 용이하게 해야 한다. 이는, 종종, 핵산 종의 겔 전기영동에 의해, 이어서, 필터 상에의 "블롯팅에 의해 달성된다. 후속적으로, 블롯팅된 표적을 변성 및 재하이브리드화를 촉진시키는 조건 하에서 프로브(예를 들면, 표지된 프로브)와 함께 항온배양한다. 프로브는 표적과의 염기 쌍으로 고안되므로, 프로브는 재생 조건 하에 표적 서열의 부분에 결합할 것이다. 이어서, 결합되지 않은 프로브는 제거되고, 검출이 완성된다.

몇몇의 실시형태에서, 핵산은, 겔 분리 및 에티듐 브로마이드로의 염색 및 UV 광 하의 가시화에 따라 정량화된다. 몇몇의 실시형태에서, 통합 방사성- 또는 형광검출-표지된 뉴클레오타이드를 사용한 합성 또는 증폭으로부터 핵산이 얻어지는 경우, 이어서, 생성물은 x-선 필름에 노출되거나 적절한 자극 스펙트럼 하에 가시화되어 분리될 수 있다.

몇몇의 실시형태에서, 가시화는 간접적으로 이루어진다. 핵산의 분리에 따라, 표지된 핵산은 표적 서열과 접촉하게 된다. 프로브는 발색단 또는 방사성 표지에 접합된다. 다른 실시형태에서, 프로브는 결합 파트너, 예를 들면, 항체 또는 비오틴에 접합되고, 결합 쌍의 다른 구성원은 검출가능한 모이어티를 지닌다. 상기의 한 예는, 본원에 인용에 의해 포함된 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있고, 이는 핵산의 자동화된 전기영동 및 이동을 위한 장치 및 방법을 개시한다. 당해 장치는 겔의 외부 조작 없이 전기영동 및 블롯팅을 가능하게 하고, 당해 장치는 본 발명의 실시형태에 따른 방법을 수행하기에 완벽하게 적합하다.

몇몇의 실시형태에서, cDNA에 대한 RNA의 역 전사(RT), 이어서, 상대적 정량적 PCR™(RT-PCR™)을 사용하여 특정 mRNA(예를 들면, PDGFC 암호화 RNA), 또는 심지어 대상체로부터 단리된 특정 mRNA 종(예를 들면, 활성 PDGFC를 암호화하는 mRNA)의 상대적 농도를 측정할 수 있다. 특정 mRNA 또는 mRNA의 종의 농도가 변하는 것을 측정함으로써, 특정 mRNA 종을 암호화하는 유전자가 구별적으로 발현됨이 밝혀진다. 소정 양상에서, mRNA 발현은, 대조군 mRNA, 예를 들면, 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1; NCBI 수탁번호 제NM_000291.3호, 본원에 인용에 의해 포함됨) 또는 TATA 박스 결합 단백질(TBP; NCBI 수탁번호 제NM_003194.4호, 본원에 인용에 의해 포함됨)의 발현에 대하여 정량화될 수 있다.

몇몇의 실시형태에서, 표준 서열 분석 기술을 이용하여 상기 기술된 증폭 생성물을 서열 분석하여 특정 종류의 변이를 동정할 수 있다. 소정 방법을 이용하여, 최적 서열분석을 위해 고안된 프라이머 세트를 이용한 서열 분석에 의해 유전자의 철저한 분석을 행한다. 본 발명의 실시형태는, 이들 유형의 분석들 중 어느 하나 또는 전부가 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 서열을 이용하여, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는, KD 바이오마커 유전자(또는 단백질 암호화 서열)에 걸친 서열의 증폭을 허용하도록 고안할 수 있고, 이는, 이어서, 직접적인 서열분석에 의해 분석될 수 있다. 유사하게, DNA 서열분석을 사용하여 KD 바이오마커 유전자의 발현을 검출하고/검출하거나 정량할 수 있다. 이러한 서열분석 방법으로는 가역적 종결자 방법(예를 들면, Illumina® 및 Helicos® BioSciences에 의해 사용됨), 피로서열분석(예를 들면, Roche로부터의 454 서열분석) 및 라이게이션에 의한 서열분석(예를 들면, Life Technologies™ SOLiD™ 서열분석)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

PCR™에서, 증폭된 표적 DNA의 분자 수는, 몇몇의 시약이 제한될 때까지 반응의 주기마다 2에 근접한 배수만큼 증가한다. 그 후, 증폭 비율은, 주기 사이에 증폭된 표적이 증가하지 않을 때까지 점점 더 감소하게 된다. 주기 수가 X 축 상에 있고, 증폭된 표적 DNA의 농도의 대수가 Y 축 상에 있는 그래프를 플롯팅하는 경우, 플롯팅된 점들을 연결함으로써 특징적인 형태의 곡선이 형성된다. 제1 주기로 시작하여, 선의 기울기는 양의 상수이다. 이는 곡선의 직선부인 것으로 일컬어진다. 시약이 제한된 후, 선의 기울기는 감소하기 시작하고, 결국 0이 된다. 이 시점에서, 증폭된 표적 DNA의 농도는 몇몇의 고정된 값에 대해 점근성(asymptotic)이 된다. 이는 곡선의 편평부(plateau portion)인 것으로 일컬어진다.

PCR™ 증폭의 직선부에서의 표적 DNA의 농도는, 반응이 시작되기 전의 표적의 출발 농도에 대해 정비례한다. 동일한 수의 주기가 완료되고 이들의 직선 범위 내인 PCR™ 반응에서의 표적 DNA의 증폭된 생성물의 농도를 측정함으로써, 본래 DNA 혼합물에서의 특정 표적 서열의 상대적 농도를 측정할 수 있다. DNA 혼합물이, 상이한 조직 또는 세포로부터 단리된 RNA로부터 합성된 cDNA인 경우, 표적 서열이 유도된 특정 mRNA의 상대적 존재량은 각각의 조직 또는 세포에 대해 측정될 수 있다. PCR™ 생성물의 농도와 상대적 mRNA 존재량 사이의 이러한 정비례는 PCR™ 반응의 직선 범위에서만 진실이다.

곡선의 편평부에서의 표적 DNA의 최종 농도는 반응 혼합물에서의 시약의 이용률에 의해 측정되고, 이는 표적 DNA의 본래 농도와 독립적이다. 따라서, mRNA 종의 상대적 존재량이 RNA 집단의 수집을 위한 RT-PCR™에 의해 측정될 수 있기 전에 충족되어야만 하는 제1 조건은, PCR™ 반응이 반응 곡선의 직선부에 존재하는 경우에 증폭된 PCR™ 생성물의 농도가 샘플링되어야만 한다는 것이다.

특정 mRNA 종의 상대적 존재량을 성공적으로 측정하기 위한 RT-PCR™ 실험을 위해 충족되어야만 하는 제2 조건은, 증폭가능한 cDNA의 상대적 농도가 일부 독립적인 표준에 대해 표준화되어야만 한다는 것이다. RT-PCR™의 목표는, 샘플 중의 모든 mRNA 종의 평균 존재량에 대한 특정 mRNA 종의 존재량을 측정하는 것이다.

경쟁적 PCR™을 위한 대부분의 프로토콜은, 대략 표적만큼 풍부한 내부 PCR™ 표준을 사용한다. 이들 전략은, PCR™ 증폭의 생성물이 이들의 직선 페이즈(phase) 동안에 샘플링되는 경우에 효과적이다. 상기 생성물이, 반응이 편평부에 접근할 때에 샘플링되는 경우, 보다 적게 존재하는 생성물이 상대적으로 과도하게 나타나게 된다. 구별적 발현에 대해 RNA 샘플들을 실험하는 경우와 같은, 다수의 상이한 RNA 샘플들에 대해 이루어진 상대적인 존재량의 비교는, 이들이 실제로 존재하는 것보다 적게 나타난 RNA의 상대적 존재량의 차이를 제조하도록 하는 방식으로 왜곡되게 된다. 내부 표준이 표적보다 훨씬 더 풍부한 경우 이는 유의한 문제점이 아니다. 내부 표준이 표적보다 더 풍부한 경우, RNA 샘플들 사이의 직접적인 직선 비교가 이루어질 수 있다.

B. 단백질 바이오마커 검출

몇몇의 양상에서, 실시형태의 방법은, 단백질 바이오마커, 예를 들면, PDGFC의 발현 또는 활성의 검출에 관한 것이다. 예를 들면, 결합, 정제, 제거, 정량화 및/또는 그렇지 않으면 일반적으로 단백질 구성성분(예를 들면, PDGFC)의 검출을 위해 면역 검출 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시형태에 따라 제조된 항체를 사용하여 KD 바이오마커 발현 및/또는 KD 바이오마커 활성화를 검출할 수 있다. 몇몇의 면역 검출 방법으로는 몇몇을 언급하자면 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역검정(RIA), 면역방사계측 검정, 형광 면역 검정, 화학발광성 검정, 생체 발광 검정, 및 웨스턴 블롯이 포함된다. 각종 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학적 문헌, 예를 들면, 각각 본원에 인용에 의해 포함되는, Doolittle MH and Ben-Zeev O, 1999; Gulbis B and Galand P, 1993; De Jager R et al., 1993; 및 Nakamura et al., 1987에 기술되어 있다.

일반적으로, 면역결합 방법은, KD 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드(예를 들면, PDGFC)를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하는 단계, 및 본 발명의 실시형태에 따라 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는데 유효한 조건 하에 상기 샘플을 제1 항-바이오마커 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

이들 방법으로는 야생형 및/또는 돌연변이 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 정제하는 방법이 포함되고, 환자의 샘플로부터 야생형 및/또는 돌연변이 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 정제하고/하거나, 재조합적으로 발현된 야생형 또는 돌연변이 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 이들 예에서, 항체는 샘플로부터 항원성 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 구성성분을 제거한다. 항체는 바람직하게는, 예를 들면, 컬럼 매트릭스 형태로의 고체 지지체에 연결될 것이고, 바이오마커 단백질 항원성 구성성분을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고정화된 항체에 가해질 것이다. 원하지 않는 구성성분은 컬럼으로부터 세척되어, 고정화된 항체에 면역복합체화된 항원이 남고, 이어서, 컬럼으로부터 단백질 및/또는 펩타이드를 제거함으로써 바이오마커 단백질 항원이 수집된다.

면역결합 방법은, 또한, 샘플 중의 KD 바이오마커 또는 활성화된 KD 바이오마커의 양을 검출하고 정량화하는 방법을 포함한다. 여기서, 당해 분야 숙련가는, 바이오마커를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하고, 상기 샘플을 항체와 접촉시키고, 이어서, 특정 조건 하에 형성된 면역 복합체의 양을 정량화할 수 있다.

항원 검출의 관점에서, 분석된 생물학적 샘플은, KD 바이오마커를 발현하는 세포를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 전혈 샘플, 조직 추출물 또는 다른 생물학적 유체일 수 있다.

유효한 조건 하에, 그리고, 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 선택된 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키는 것은, 일반적으로, 간단히, 항체 조성물을 샘플에 첨가하고, 항체가, 존재하는 임의의 바이오마커 단백질 항원과 면역 복합체를 형성하기에, 즉, 존재하는 임의의 바이오마커 단백질 항원에 결합하기에 충분히 긴 시간 동안 혼합물을 항온배양하는 것의 문제이다. 이 시간 후에, 샘플-항체 조성물, 예를 들면, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은, 일반적으로 임의의 비-특이적으로 결합된 항체 종을 제거하기 위해 세척하여 검출되는 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체들 만을 허용할 것이다.

일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 다수의 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법은, 일반적으로, 방사활성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중 어느 하나와 같은 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 미국 특허로는, 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함되고, 이들은 각각 본원에 인용에 의해 포함된다. 물론, 당해 분야 숙련가는, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 2차 결합 리간드, 예를 들면, 2차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 정렬의 사용을 통해 추가의 이점을 발견할 수 있다.

몇몇의 실시형태에서, 검출에 사용된 KD 바이오마커 항체(예를 들면, 항-PDGFC 항체) 자체는 검출가능한 표지에 연결될 수 있고, 여기서, 이어서, 당해 분야 숙련가는, 이러한 표지를 간단히 검출하여 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양이 측정되도록 할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 1차 면역 복합체 내에 결합되는 1차 항체는, 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드의 수단에 의해 검출될 수 있다. 소정 실시형태에서, 제2 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합 리간드 자체는 종종 항체이고, 따라서, 이는 "2차" 항체라고 칭할 수 있다. 1차 면역 복합체는, 유효한 조건 하에, 그리고, 2차 면역 복합체의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안, 표지된 2차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉된다. 이어서, 2차 면역 복합체는, 일반적으로, 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고, 이어서, 2차 면역 복합체 중의 나머지 표지를 검출한다.

추가의 방법은, 2-단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드, 예를 들면, 항체를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 2차 면역 복합체를 다시 유효한 조건 하에, 그리고, 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안, 제3 결합 리간드 또는 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출가능한 표지에 연결되어, 이로써 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이러한 시스템은, 이러한 시스템이 바람직한 경우에 신호 증폭을 제공한다.

하나의 면역검출 방법은 2개의 상이한 항체들을 사용한다. 제1 단계 비오티닐화된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 표적 항원(들)을 검출하고, 이어서, 제2 단계 항체를 사용하여, 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출한다. 이러한 방법에서, 시험되는 샘플은, 우선, 제1 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 항온배양된다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체 중 일부가 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는, 각각의 단계에서 항체/항원 복합체에 추가의 비오틴 부위를 첨가하면서, 스트렙트아비딘(또는 아비딘), 비오티닐화된 DNA, 및/또는 상보적 비오티닐화된 DNA의 연속적 용액 중의 항온배양에 의해 증폭된다. 증폭 단계는, 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복되고, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대해 제2 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 항온배양된다. 이러한 제2 단계 항체는, 예를 들면, 크로모겐 기질을 이용한 조직효소학(histoenzymology)에 의한 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 효소로 표지화된다. 적합한 증폭을 이용하여, 육안으로 보이는 접합체를 생산할 수 있다.

다른 공지의 면역검출 방법은 면역-PCR 방법의 이점을 취한다. PCR™ 방법은, 비오티닐화된 DNA와의 항온배양시의 Cantor 방법과 유사하지만, 다중 횟수의 스트렙트아비딘 및 비오티닐화된 DNA 항온 배양을 이용하는 대신에, 항체를 방출시키는 저 pH 또는 고염 완충액으로 DNA/비오틴/스트렙트아비딘/항체 복합체를 세척한다. 이어서, 얻어진 세척액을 이용하여 적절한 대조군과 적합한 프라이머로 PCR™ 반응을 행한다. 적어도 이론적으로, 막대한 증폭 능력 및 PCR™의 특이성을 이용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.

본 발명의 실시형태의 면역검출 방법은, 각종 형태의 염증성 질환, 예를 들면, KD와 같은 병태의 진단 및 예후에 있어서 분명한 이용성을 갖는다. 여기서, KD 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 돌연변이체를 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 및/또는 임상학적 샘플을 사용한다. 그러나, 이들 실시형태는, 또한, 비-임상학적 샘플에 대해, 예를 들면, 항원 또는 항체 샘플의 적정시에, 예를 들면, 염증의 세포 매개인자의 동정시의 적용을 갖는다.

KD를 갖는 환자의 임상학적 진단 및/또는 모니터링에 있어서, 바이오마커의 검출, 예를 들면, 정상 대상체 유래의 상응하는 생물학적 샘플에서의 수준(즉, 기준 수준)에 비하여 증가된 PDGFC의 발현 또는 활성화는, KD를 지닌 환자의 지표이다. 그러나, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 이러한 임상학적 진단은, 단리에 있어 반드시 이러한 방법에 기초하여 이루어지는 것은 아닐 것이다. 당해 분야 숙련가들은, 바이오마커의 확실한 동정 및/또는 저수준 및/또는 배경 변화를 나타내는, 바이오마커의 유형 및/또는 양에 있어서의 유의한 차이를 구별하는 것이 매우 친숙하다. 실제로, 배경 발현 수준은, 종종, 증가된 검출이 유의한 것 및/또는 양성인 것으로 점수매김되는 것 이상인 "컷-오프"를 형성하기 위해 사용된다. 유사하게, 진단은 2, 3, 또는 그 이상의 바이오마커의 존재에 그리고/또는 KD의 지표인 하나 이상의 임상학적 증상과 관련된 바이오마커의 존재에 기초하여 이루어질 수 있다.

1. ELISA

상기 상세하게 설명된 바와 같이, 면역검정은, 이들의 가장 간단하고/하거나 직접적인 관점에서, 결합 검정이다. 소정의 바람직한 면역검정은, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및/또는 방사성 면역검정(RIA)이다. 또한, 조직 절편을 이용한 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다.

몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 실시형태의 항-바이오마커 항체는, 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면, 예를 들면, 폴리스티렌 미세역가 플레이트의 웰 상에 고정화된다. 이어서, 바이오마커 단백질 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물, 예를 들면, 임상학적 샘플을 상기 웰에 첨가한다. 결합 및/또는 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 바이오마커 단백질 항원을 검출할 수 있다. 검출은, 일반적으로, 검출가능한 표지에 연결된 다른 항-바이오마커 항체의 첨가에 의해 달성된다. 이러한 유형의 ELISA는, 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 또한, 검출은, 제2 항-바이오마커 항체의 첨가에 의해, 이어서, 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 항체의 첨가에 의해, 검출가능한 표지에 연결되는 제3 항체를 이용하여 달성된다.

몇몇의 실시형태에서, 바이오마커 단백질 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면 상에 고정화시키고/고정화시키거나, 이어서, 당해 실시형태의 항-바이오마커 항체와 접촉시킨다. 결합 및/또는 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항-바이오마커 항체를 검출할 수 있다. 여기서, 개시 항-바이오마커 항체는, 검출가능한 표지에 연결되어, 면역 복합체를 직접적으로 검출할 수 있다. 다시, 제1 항-바이오마커 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체를 이용하여, 검출가능한 표지에 연결되는 제2 항체로, 면역 복합체를 검출할 수 있다.

몇몇의 실시형태에서, 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드는 고정화된다. 몇몇의 실시형태에서, ELISA는, 검출시에 항체 경쟁을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 ELISA에서, KD 바이오마커 단백질에 대해 표지화된 항체는 웰에 첨가되어, 결합하고/결합하거나 이들의 표지의 수단에 의해 검출되게 한다. 이어서, 미지의 샘플 중의 야생형 또는 돌연변이 바이오마커 단백질 항원의 양은, 코팅된 웰을 이용한 항온배양 전에 그리고/또는 이러한 항온배양 동안에, 바이오마커에 대해 표지화된 항체와 상기 샘플을 혼합함으로써 측정된다. 샘플 중의 바이오마커 단백질의 존재는, 웰에 결합할 수 있는 야생형 또는 돌연변이 단백질에 대한 항체의 양을 감소시키고, 따라서, 최종 신호를 감소시키도록 작용한다. 또한, 이는, 미지의 샘플 중의 바이오마커 단백질에 대한 항체를 검출하기에 적절하고, 여기서, 비표지화된 항체는 항원-코팅된 웰에 결합하고, 또한, 표지화도니 항체에 결합할 수 있는 항원의 양을 감소시킨다.

사용된 형식에 관계없이, ELISA는 일반적으로, 예를 들면, 코팅, 항온배양 및 결합, 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출에 있어서 소정 특징을 갖는다. 이들은 하기에 기술한다.

항원 또는 항체로 플레이트를 코팅하는데 있어서, 당해 분야 숙련가는, 일반적으로, 밤새 또는 특정 시간 동안에, 항원 또는 항체의 용액을 지닌 플레이트의 웰을 항온배양할 것이다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 흡착된 물질을 불완전하게 제거할 것이다. 이어서, 임의의 남아 있는 이용가능한 웰의 표면을, 시험 항 혈청에 관해서 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카세인 또는 분유 용액을 포함한다. 당해 코팅은, 고정화 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고, 따라서, 표면 상의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.

몇몇의 실시형태에서, 직접적인 절차보다는 오히려 2차 또는 3차 검출 수단을 사용한다. 몇몇의 이러한 실시형태에서, 웰에의 단백질 또는 항체의 결합, 배경을 감소시키기 위한 비-반응성 물질로의 코팅, 및 미결합 물질을 제거하기 위한 세척 후, 고정화 표면을 생물학적 샘플과 접촉시켜 면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하는데 유효한 조건 하에 시험한다. 이어서, 면역 복합체의 검출은, 표지화된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지화된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.

"면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하는데 유효한 조건 하"는, 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 용액, 예를 들면, BSA, TH 감마 글로불린(BGG) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)/Tween으로 희석시키는 것을 포함함을 의미한다. 또한, 이들 첨가된 제제는, 비특이적 배경의 감소를 보조하는 경향이 있다.

또한, "적합한" 조건은, 효과적인 결합을 가능하게 하는데 충분한 온도에서 또는 시간 동안 항온배양이 이루어짐을 의미한다. 항온배양 단계는, 전형적으로, 약 1 내지 2 내지 4시간 등으로부터, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃의 순서의 온도에서 이루어지거나, 약 4℃ 등에서 밤새 이루어질 수 있다.

ELISA에서의 항온배양 단계 이후에, 접촉된 표면은, 비-복합체화된 물질을 제거하도록 세척된다. 바람직한 세척 절차는, PBS/Tween과 같은 용액, 또는 보레이트 완충액을 이용한 세척을 포함한다. 시험 샘플과 처음으로 결합된 물질 사이의 특이적 면역 복합체의 형성, 및 후속적 세척 이후에, 심지어 소량의 면역 복합체의 발생이어도 측정될 수 있다.

검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는, 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 가질 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 이는, 적절한 발색 기질과 항온배양시 색 발현을 생성시키는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 당해 분야 숙련가는, 일정 시간 동안, 그리고, 추가의 면역 복합체 형성을 발달을 지지하는 조건 하에, 제1 및 제2 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제-접합된 항체와 접촉시키거나 항온배양(예를 들면, PBS-함유 용액, 예를 들면, PBS-Tween 중에서 실온에서 2시간 동안 항온배양)하기를 바랄 것이다. 표지화된 항체와의 항온배양, 및 미결합 물질을 제거하기 위한 후속적인 세척 후, 예를 들면, 효소 표지로서의 퍼옥시다제의 경우에는 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플과 같은 발색 기질, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 H₂O₂와의 항온배양에 의해, 표지의 양을 정량화한다. 이어서, 정량화는, 예를 들면, 가시 스펙트럼 분광광도계를 이용하여, 생성된 발색의 정도를 측정함으로써 달성된다.

2. 면역조직화학

본 발명의 실시형태의 항-KD 바이오마커 항체는, 또한, 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된, 신선한-동결된 및/또는 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 조직 블록들 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 이들 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은, 각종 예후 인자의 기존의 IHC 연구에 연속적으로 사용되었고/사용되었거나, 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다((Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).

간략하게, 동결된-절편(예를 들면, 혈관 조직 절편)은, 실온에서 작은 플라스틱 캡슐 내의 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에서, 동결된 "분쇄된" 조직 50ng을 재수화시키고; 원심분리에 의해 입자를 펠렛화하고; 이들을 점성의 삽입 배지(viscous embedding medium)(OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 반전시키고/시키거나 원심분리에 의해 다시 펠렛화하고; 70℃ 이소펜탄 중에서 스냅-동결시키고; 플라스틱 캡슐을 자르고/자르거나 동결된 조직 실린더를 제거하고; 크라이오스태트 마이크로톰 척 상에 상기 조직 실린더를 고정시키고/고정시키거나 20 내지 50개의 일련의 절편을 자름으로써 제조될 수 있다.

플라스틱 원심분리 튜브 중의 50mg 샘플의 재수화; 펠렛화; 4시간의 고정화를 위한 10% 포르말린 중의 재현탁; 세척/펠렛화; 따뜻한 2.5% 한천 중의 재현탁; 펠렛화; 한천을 경화시키기 위한 빙수 중에서의 냉각; 튜브로부터의 조직/한천 블록의 제거; 파라핀 중의 블록의 침윤 및/또는 포매; 및/또는 50개의 영구적 절편으로의 절단을 포함하는 유사한 방법에 의해 영구적-절편을 제조할 수 있다.

3. 면역전자 현미경

본 발명의 실시형태의 항체는, 또한, 세포내 조직 구성성분을 동정하기 위해 전자 현미경과 함께 사용될 수 있다. 간략하게, 전자-고밀도 표지는 항-바이오마커 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 본 발명의 실시형태에 따른 전자-고밀도 표지의 예로는 페리틴 및 금이 있다. 전자-고밀도 표지는 전자를 흡착하고, 전자 현미경에 의해 가시화될 수 있다.

4. 면역검출 키트

몇몇의 양상에서, 본 발명의 실시형태는, 상기 기술된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항-KD 바이오마커 항체는, 일반적으로, 이러한 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 검출하는데 사용되므로, 당해 항체는 바람직하게는 키트 내에 포함될 것이다. 그러나, 이러한 구성성분 둘 다를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 따라서, 면역검출 키트는, 적합한 용기 수단 내에, 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드(예를 들면, 항-PDGFC 항체)에 결합하는 제1 항체, 및/또는 임의로, 면역검출 시약, 및/또는 추가로 임의로, 정제된 또는 재조합 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 포함할 것이다.

몇몇의 실시형태에서, 모노클로날 항체가 사용될 것이다. 소정 실시형태에서, 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드에 결합하는 제1 항체는, 고체 지지체, 예를 들면, 컬럼 매트릭스 및/또는 미세역가 플레이트의 웰에 사전에-결합될 수 있다.

키트의 면역검출 시약은, 주어진 항체와 관련되고/되거나 연결되는 검출가능한 표지를 포함하는, 각종 유형들 중 임의의 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 관련되고/되거나 부착되는 검출가능한 표지도 또한 고려된다. 예시 2차 리간드는 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.

본 발명의 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은, 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체를, 상기 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 항체와 함께 포함하는, 2-구성성분 시약을 포함하고, 제3 항체는 검출가능한 표지에 연결된다. 상기에 나타낸 바와 같이, 예시적 표지의 수는 당해 분야에 공지되어 있고/있거나, 이러한 표지는 본 발명의 실시형태와 관련하여 사용할 수 있다.

본 발명의 실시형태에 따른 키트는, 표지되고/되거나 표지되지 않은, 바이오마커 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 적합하게 분획된 조성물을 추가로 포함할 수 있고, 이를 이용하여 검출 검정을 위한 표준 곡선을 제작할 수 있다. 제공된 키트는, 완전히 접합된 형태로, 중간체 형태로, 그리고/또는 키트 사용자에 의해 접합된 분리물 모이어티로서, 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 키트의 구성성분은 수성 매체 중에 그리고/또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다.

키트의 용기 수단은, 일반적으로, 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 보틀, 시린지 및/또는 기타 용기 수단을 포함할 것이고, 이들 용기에 항체를 넣을 수 있고/있거나, 바람직하게는 적합하게는 분획될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시형태의 키트는, 전형적으로, 시판용 밀폐 수단 내에, 항체, 항원, 및/또는 임의의 다른 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기로는 주사 및/또는 블로우-몰딩된 플라스틱 용기를 포함할 수 있고, 이들 용기에 바람직한 바이알이 함유된다.

IV . 실시예

하기 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 입증하기 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시되어 있는 기술은, 본 발명자에 의해 본 발명의 실행시 우수하게 기능하는 것으로 발견된 기술을 나타낸다는 것은 당해 분야 숙련가에 의해 이해되어야만 한다. 따라서, 이의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당해 분야 숙련가는, 본 발명의 관점에서, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시되어 있는 특정 실시형태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 여전히 유사하거나 동일한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야만 한다.

실시예 1 - KD 바이오마커의 동정

샘플 수집 및 프로세싱

연구는 베일러 리서치 인스티튜트(Baylor Research Institute)의 기관 감사 위원회에 의해 승인되었다. 모든 환자들 및 건강한 공여자들로부터 사전 동의를 얻었다. 환자 및 건강한 대조군으로부터 Tempus™ 튜브(Applied Biosystems, Carlsbad, CA) 또는 PaxGene 튜브(Qiagen, Valencia, CA)에 혈액을 수집하여 베일러 인스티튜트 포 이뮤놀로지 리서치에 전달하였고, -20℃에 저장하였다. KD 혈액 샘플로 사용되는 환자들의 요약은 표 1과 같이 제공된다.

KD 환자 샘플

가와사키 질환	수
총 환자	98
사전 및 24h 후 IVIG 투여된 환자	47
사전 및 2w 또는 4w 후 투여된 환자	13
사전 및 1y 후 투여된 환자	1
사전에만 투여된 환자	15
24h 후 투여된 환자(사전 투여되지 않음)	13
5w 후 투여된 환자(사전 투여되지 않음)	2
미지의 병태를 갖는 환자	7

MagMax™ 총 RNA 추출 키트(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 이용하여 전혈 용해물로부터 총 RNA를 단리하였고, GLOBINclear™ 전혈 글로빈 감소 키트(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 이용하여 글로빈 mRNA를 제거하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Palo Alto, CA)를 이용하여 RNA 완전성 수(RIN: RNA integrity number)를 측정하였다. 6을 초과하는 RIN을 갖는 글로빈-감소된 RNA를 추가로 증폭시켰고, Illumina® TotalPrep™ RNA 증폭 키트(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)로 표지화하였다. cRNA를 사람 HT12 BeadChip 어레이(Illumina®, San Diego, CA)에서 하이브리드화하였고, Illumina® BeadStation 500에 스캐닝하였다. 형광성 하이브리드화 신호는 GenomeStudio® 소프트웨어(Illumina®, San Diego, CA)로 평가하였다.

마이크로어레이 분석

백그라운드 공제 및 평균 표준화 후, GeneSpring® 11.5 소프트웨어(Agilent, Santa Clara, CA)를 이용하여 마이크로어레이 데이터를 분석하였다. 분석 전에, 샘플 중 어느 하나에서도 발현되지 않은 프로브를 여과 제거하였다. 질환 그룹과 이에 상응하는 건강한 대조군 그룹 사이에, 통계학적 분석(벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 다중 시험 보정을 이용한 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험) 및 배수 변화 분석을 행하였다. 각각의 데이터 세트의 건강한 대조군과 비교하여, 가와사키 질환(P<0.05, 벤자미니-호흐베르크 다중 시험 보정을 이용한 만-휘트니 U 시험, 배수 변화>1.5)에서 유의하였지만, NOMID 및 SOJIA 그룹(P>0.5)에서는 유의하지 않았던 프로브를 수득함으로써 유의성 분석을 행하였다. IPA 소프트웨어(Ingenuity System Redwood City, CA)를 이용하여 경로 분석을 행하였다. 모듈식 분석을 위해, 260 전사 모듈의 세트를 기존 분석용 프레임워크로서 사용하였다. 이러한 프레임워크의 작제에 사용되는 접근법은 이미 보고되었다(Chaussabel et al., 2008). 간략하게, 260개의 전사 모듈 프레임워크를 형성하기 위한 다중 횟수의 클리크(clique) 및 파라클리크(paraclique) 클러스터링에서 선택되는 경우에 9개의 전혈 질환 데이터 세트들 내의 또는 9개의 전혈 질환 데이터 세트들에 걸친, 그리고, 각각의 모듈 내의 통합성 발현을 갖는 유전자, 유의한 프로브의 백분율은 T-시험에 의해 평가하였다. KD에서 선택적으로 조절된 유전자를 이용한 유전자 신호전달 경로의 예는 도 1 및 도 2에 나타낸다.

RT-PCR

고용량 역 전사 키트(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 이용하여 전체 mRNA로부터 cDNA를 생성하였다. LightCycler® 480(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)에 대해 TaqMan® 유전자 발현 검정을 이용하여 10μl의 반응 용적으로 정량적 실시간 PCR을 행하였다. 사람 PDGFC 유전자에 대한 Taqman® 검정 ID는 Hs00211916_m1, Hs01053574_m1 및 Hs01044216_m1이다(하기 표 2 참조). PDGFC 유전자에 대한 임계 주기(CT) 값을 내인성 대조군 유전자 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1; NCBI 수탁번호 제NM_000291.3호) 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP; NCBI 수탁번호 제NM_003194.4호)의 평균에 대해 표준화하였다.

분석된 PDGFC 영역

Taqman®검정 ID	앰플리콘 길이	검출된 mRNA	암호화된 PDGFC
Hs00211916_m1	90 뉴클레오타이드	NR_036641.1; NM_016205.2	기능성 PDGFC ORF 및 넌센스 전사체
Hs01053574_m1	94 뉴클레오타이드	NR_036641.1	넌센스 전사체
Hs01044216_m1	98 뉴클레오타이드	NM_016205.2	기능성 PDGFC ORF

결과

1700개 초과의 전사체들이, 건강한 매칭된 대조군과 비교하여 KD 환자 유래의 생체외 혈액 샘플에서 구별적으로 발현되는 것으로 발견되었다. 또한, KD 환자는 적응 면역성과 관련된 전사체의 하향-조절 및 전신성 홍반성 낭창(SLE) 환자에 비하여 염증과 관련된 전사체에서의 극심한 상향-조절을 나타냈다. KD-특이적 전사 프로파일은, 유의성 전략의 분석을 이용하여 KD와 유사한 다른 병태를 갖는 환자에서의 전사체 발현에 비교하는 경우에 특히 분명하였다. 따라서, 염증 및 전신 조직 손상과 함께 나타나는 IL-1-매개된 질환인, 신생아 발병 다중 시스템 염증성 질환(NOMID) 및 전신 발병 소아 특발성 관절염(SoJIA) 둘 다는, 이러한 분석 방법을 이용한 구별적 전사체 발현에 의해 KD로부터 구별될 수 있었다[본원에 인용에 의해 포함되는 문헌(Allantaz et al., 2007)에 기술됨].

KD 환자 유래의 혈액 샘플은, LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2 및 TMCC1 유전자로부터의 전사체의 감소된 발현을 나타냈다. 한편, KD 혈액 샘플은, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816, OLFM4 및 PDGFC 유전자로부터의 전사체의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, 마이크로어레이 및 RT-PCR 둘 다는, 건강한 아동 및 다른 염증성 질환을 앓고 있는 아동에 비하여 KD 환자에서 PDGFC mRNA 수준이 유의하게 상승되었음을 입증하였다. 이어서, KD 특이적 전사체를, 염증(도 1) 및 결합 조직 발달(도 2)에 관여하는 신호전달 경로에서의 상기 KD 특이적 전사체의 역할에 대해 분석하여, 마커들 중 어느 것이 질환에서의 주요 역할을 가질 수 있는지를 측정하였다.

이들 분석으로부터, PDGFC는, 또한, KD에서의 주요 작용인자로서 나타났고, 따라서, 추가의 연구를 행하였다. 정량적 RT-PCR은, PDGFC 전사체가 KD 환자에서 5배 내지 30배 상향-조절되었음을 입증하였다(도 3). 이러한 상승된 발현은, PDGFC 전사체의 3개의 상이한 영역들을 증폭시킨 프라이머 쌍을 이용하여 분명해졌다. 중요하게도, 상승된 발현은, 기능성 PDGFC 단백질을 암호화한 전사체를 증폭시킨 프라이머 쌍에서 가장 명백하였다. 기능성 대 비기능성 PDGFC 단백질을 암호화하는 PDGFC 전사체의 발현의 추가의 비교는, KD 환자가 기능성 PDGFC 전사체를 우선적으로 발현함을 나타냈다(도 4).

KD 및 다른 유열성 질환 유래의 전혈 중의 PDGFC 전사체 수준은 정량적 RT-PCR로 평가하였다(Taqman 검정 Hs00211916_ml)(도 5). PDGFC의 발현값은 소아 피부근염(JDM), 전신 홍반성 낭창(SLE), 리노바이러스, 이.콜라이, 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA), 스태필로코커스 아우레우스(Staph) 및 신생아 발병 다발 시스템 염증성 질환(NOMID)을 지닌 환자에서 유의하게 변화되지 않았다(도 5). PDGFC의 상승된 발현은 5 내지 30배 증가를 지닌 KD 환자에서 발견되었다(도 5).

마이크로어레이 분석은, PDGFC 전사가 2명의 독립적 코호트의 KD 샘플(n=66 및 n=19)에서 KD 환자에서 상향-조절됨을 시사하였다(도 6).

* * *

본원에 개시되고 주장된 방법들 전부는, 본 개시의 관점에서 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본원에 기술된 방법에 및 본원에 기술된 방법의 단계에 적용될 수 있거나 본원에 기술된 방법의 단계의 순서로 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘 다 관련된 소정 제제는, 본원에 기술된 제제에 대해 치환될 수 있지만, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있다. 당해 분야 숙련가에게 명백한 이러한 유사한 치환체 및 변형 전부는, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내인 것으로 생각된다.

참조문헌

하기 참조문헌은, 본원에 제시된 것들을 보충하는 예시적인 절차 또는 다른 상세설명을 제공하는 정도로, 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다.

미국 특허 제3,817,837호

미국 특허 제3,850,752호

미국 특허 제3,939,350호

미국 특허 제3,996,345호

미국 특허 제4,275,149호

미국 특허 제4,277,437호

미국 특허 제4,366,241호

미국 특허 제5,279,721호

미국 특허 공개 제20090304680호

미국 특허 공개 제20110189698호

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guauucacag cccaagguuu ccucauacuu auccaagaaa uacggucuug guauggagau 720 uaguagcagu agaggaaaau guauggauac aacuuacguu ugaugaaaga uuugggcuug 780 aagacccaga agaugacaua ugcaaguaug auuuuguaga aguugaggaa cccagugaug 840 gaacuauauu agggcgcugg ugugguucug guacuguacc aggaaaacag auuucuaaag 900 gaaaucaaau uaggauaaga uuuguaucug augaauauuu uccuucugaa ccaggguucu 960 gcauccacua caacauuguc augccacaau ucacagaagc ugugaguccu ucagugcuac 1020 ccccuucagc uuugccacug gaccugcuua auaaugcuau aacugccuuu aguaccuugg 1080 aagaccuuau ucgauaucuu gaaccagaga gauggcaguu ggacuuagaa gaucuauaua 1140 ggccaacuug gcaacuucuu ggcaaggcuu uuguuuuugg aagaaaaucc agaguggugg 1200 aucugaaccu ucuaacagag gagguaagau uauacagcug cacaccucgu aacuucucag 1260 uguccauaag ggaagaacua aagagaaccg auaccauuuu cuggccaggu ugucuccugg 1320 uuaaacgcug uggugggaac ugugccuguu gucuccacaa uugcaaugaa ugucaaugug 1380 ucccaagcaa aguuacuaaa aaauaccacg agguccuuca guugagacca aagaccggug 1440 ucaggggauu gcacaaauca cucaccgacg uggcccugga gcaccaugag gagugugacu 1500 gugugugcag 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gaucaacuau uuuuagcuug guaaauuuuu cuaaacacaa uuguuauagc 2400 cagaggaaca aagaugauau aaaauauugu ugcucugaca aaaauacaug uauuucauuc 2460 ucguauggug cuagaguuag auuaaucugc auuuuaaaaa acugaauugg aauagaauug 2520 guaaguugca aagacuuuuu gaaaauaauu aaauuaucau aucuuccauu ccuguuauug 2580 gagaugaaaa uaaaaagcaa cuuaugaaag uagacauuca gauccagcca uuacuaaccu 2640 auuccuuuuu uggggaaauc ugagccuagc ucagaaaaac auaaagcacc uugaaaaaga 2700 cuuggcagcu uccugauaaa gcgugcugug cugugcagua ggaacacauc cuauuuauug 2760 ugauguugug guuuuauuau cuuaaacucu guuccauaca cuuguauaaa uacauggaua 2820 uuuuuaugua cagaaguaug ucucuuaacc aguucacuua uuguacucug gcaauuuaaa 2880 agaaaaucag uaaaauauuu ugcuuguaaa augcuuaaua ucgugccuag guuauguggu 2940 gacuauuuga aucaaaaaug uauugaauca ucaaauaaaa gaauguggcu auuuugggga 3000 gaaaauuaaa aaaaaaaa 3018 <210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln 1 5 10 15 Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe 20 25 30 Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg 35 40 45 Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro 50 55 60 His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val 65 70 75 80 Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu 100 105 110 Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe 130 135 140 Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr 145 150 155 160 Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala 180 185 190 Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp 195 200 205 Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly 210 215 220 Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu 225 230 235 240 Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser 245 250 255 Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro 260 265 270 Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu 275 280 285 His Asn Cys Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys 290 295 300 Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu 305 310 315 320 His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp 325 330 335 Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly 340 345 <210> 3 <211> 3079 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcccggagag ccgcaucuau uggcagcuuu guuauugauc agaaacugcu cgccgccgac 60 uuggcuucca gucuggcugc gggcaacccu ugaguuuucg ccucuguccu gucccccgaa 120 cugacaggug cucccagcaa cuugcugggg acuucucgcc gcucccccgc guccccaccc 180 ccucauuccu cccucgccuu cacccccacc cccaccacuu cgccacagcu caggauuugu 240 uuaaaccuug ggaaacuggu ucagguccag guuuugcuuu gauccuuuuc aaaaacugga 300 gacacagaag agggcucuag gaaaaaguuu uggaugggau uauguggaaa cuacccugcg 360 auucucugcu gccagagcag gcucggcgcu 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gaagaaaauc cagaguggug 1260 gaucugaacc uucuaacaga ggagguaaga uuauacagcu gcacaccucg uaacuucuca 1320 guguccauaa gggaagaacu aaagagaacc gauaccauuu ucuggccagg uugucuccug 1380 guuaaacgcu guggugggaa cugugccugu ugucuccaca auugcaauga augucaaugu 1440 gucccaagca aaguuacuaa aaaauaccac gagguccuuc aguugagacc aaagaccggu 1500 gucaggggau ugcacaaauc acucaccgac guggcccugg agcaccauga ggagugugac 1560 ugugugugca gagggagcac aggaggauag ccgcaucacc accagcagcu cuugcccaga 1620 gcugugcagu gcaguggcug auucuauuag agaacguaug cguuaucucc auccuuaauc 1680 ucaguuguuu gcuucaagga ccuuucaucu ucaggauuua cagugcauuc ugaaagagga 1740 gacaucaaac agaauuagga guugugcaac agcucuuuug agaggaggcc uaaaggacag 1800 gagaaaaggu cuucaaucgu ggaaagaaaa uuaaauguug uauuaaauag aucaccagcu 1860 aguuucagag uuaccaugua cguauuccac uagcuggguu cuguauuuca guucuuucga 1920 uacggcuuag gguaauguca guacaggaaa aaaacugugc aagugagcac cugauuccgu 1980 ugccuugcuu aacucuaaag cuccaugucc ugggccuaaa aucguauaaa aucuggauuu 2040 uuuuuuuuuu uuuugcucau auucacauau guaaaccaga acauucuaug uacuacaaac 2100 cugguuuuua aaaaggaacu auguugcuau gaauuaaacu ugugucgugc ugauaggaca 2160 gacuggauuu uucauauuuc uuauuaaaau uucugccauu uagaagaaga gaacuacauu 2220 caugguuugg aagagauaaa ccugaaaaga agaguggccu uaucuucacu uuaucgauaa 2280 gucaguuuau uuguuucauu guguacauuu uuauauucuc cuuuugacau uauaacuguu 2340 ggcuuuucua aucuuguuaa auauaucuau uuuuaccaaa gguauuuaau auucuuuuuu 2400 augacaacuu agaucaacua uuuuuagcuu gguaaauuuu ucuaaacaca auuguuauag 2460 ccagaggaac aaagaugaua uaaaauauug uugcucugac aaaaauacau guauuucauu 2520 cucguauggu gcuagaguua gauuaaucug cauuuuaaaa aacugaauug gaauagaauu 2580 gguaaguugc aaagacuuuu ugaaaauaau uaaauuauca uaucuuccau uccuguuauu 2640 ggagaugaaa auaaaaagca acuuaugaaa guagacauuc agauccagcc auuacuaacc 2700 uauuccuuuu uuggggaaau cugagccuag cucagaaaaa cauaaagcac cuugaaaaag 2760 acuuggcagc uuccugauaa agcgugcugu gcugugcagu aggaacacau ccuauuuauu 2820 gugauguugu gguuuuauua ucuuaaacuc uguuccauac acuuguauaa auacauggau 2880 auuuuuaugu acagaaguau gucucuuaac caguucacuu auuguacucu ggcaauuuaa 2940 aagaaaauca guaaaauauu uugcuuguaa aaugcuuaau aucgugccua gguuaugugg 3000 ugacuauuug aaucaaaaau guauugaauc aucaaauaaa agaauguggc uauuuugggg 3060 agaaaauuaa aaaaaaaaa 3079

Claims

가와사키 질환(KD)을 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체에서 가와사키 질환(KD)의 바이오마커를 검출하기 위한 방법으로서,
상기 방법은, 가와사키 질환(KD)을 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 생물학적 샘플 중의 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC) 발현 수준을 측정함을 포함하고,
여기서, 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현은, 상기 대상체를 KD의 바이오마커를 갖는 것으로 동정하는,
가와사키 질환(KD)을 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체에서 가와사키 질환(KD)의 바이오마커를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈청 샘플인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 KD를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체가, 하기 증상들: 구강 홍반; 발진; 부은 입술; 갈라진 입술; 손의 종창; 발의 종창; 눈 발적; 포도막염; 무균성 수막염; 림프절 염증; 혈관 염증; 관상 동맥류; 발열; 관절 통증; 관절 종창; 또는 조상(nail bed), 손바닥, 발바닥 및 서혜부에 걸친 피부 박리 중 하나 이상을 나타내는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 KD를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체가 아시아 혈통인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 채취함을 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 PDGFC 발현 수준이, 상기 샘플 중의 PDGFC RNA 발현을 측정함으로써 측정되는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 PDGFC RNA 발현을 측정하는 것이, 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 PDGFC RNA의 발현을 측정함을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 PDGFC RNA 발현을 측정하는 것이, 핵산 하이브리드화 또는 핵산 서열분석을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 PDGFC RNA 발현을 측정하는 것이 RT-PCR을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 상승된 PDGFC 발현이, 기준 수준에 비하여 약 3 내지 약 50배 큰 PDGFC RNA 발현인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 기준 수준이, KD를 갖지 않는 대상체로부터의 PDGFC 발현 수준을 나타내는, 방법.
제1항에 있어서, 샘플 중의 적어도 제2 유전자의 발현 수준을 측정함을 추가로 포함하는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 제2 유전자가 제어 유전자인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 제2 유전자가, LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 및 OLFM4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 샘플 중의 PDGFC 발현을 보고함을 추가로 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 PDGFC 발현이 보고서(written report)로 보고되는, 방법.
제1항에 있어서, 기준 수준에 대해 샘플 중의 PDGFC 발현 수준을 비교함으로써, 상기 대상체가 KD의 바이오마커를 갖는지의 여부를 측정함을 추가로 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 대상체가 KD의 바이오마커를 갖는지의 여부를 보고함을 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 대상체가, 상승된 수준의 PDGFC 발현을 갖지 않는, 방법.
가와사키 질환(KD)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서,
(a) 상기 대상체에서 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC)의 발현을 평가하는 단계; 및
(b) 상기 대상체가 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현을 나타내는 경우에 상기 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여하는 단계
를 포함하는, 가와사키 질환(KD)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법.
제20항에 있어서, 상기 항-KD 치료요법이 IgG 투여를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 항-KD 치료요법이 아스피린, 코르티코스테로이드 또는 항-TNFα 치료요법의 투여를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 항-KD 치료요법이 상기 평가 전에 상기 대상체에게 투여된, 방법.
제20항에 있어서, 상기 대상체가 하기 증상들: 구강 홍반; 발진; 부은 입술; 갈라진 입술; 손의 종창; 발의 종창; 눈 발적; 포도막염; 무균성 수막염; 림프절 염증; 혈관 염증; 관상 동맥류; 발열; 관절 통증; 관절 종창; 또는 조상, 손바닥, 발바닥 및 서혜부에 걸친 피부 박리 중 하나 이상을 나타내는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 PDGFC 발현이 PDGFC RNA 발현인, 방법.
제25항에 있어서, 상기 PDGFC RNA 발현이, 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 PDGFC RNA의 발현인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 PDGFC의 발현을 평가하는 것이, PDGFC 발현을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 상승된 PDGFC 발현이, 기준 수준에 비하여 약 3 내지 약 50배 큰 PDGFC RNA 발현인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 기준 수준이, KD를 갖지 않는 대상체로부터의 PDGFC 발현 수준을 나타내는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 제2 유전자의 발현 수준을 평가함을 추가로 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 적어도 제2 유전자의 발현을 평가하는 것이, 적어도 제2 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 제2 유전자가 제어 유전자인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 제2 유전자가, LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 및 OLFM4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
가와사키 질환(KD)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서,
(a) 상기 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여하는 단계;
(b) 상기 대상체에서 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC)의 발현을 평가하는 단계; 및
(c) 상기 대상체가 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현을 나타내는 경우에 상기 대상체에게 추가의 항-KD 치료요법을 투여하는 단계
를 포함하는, 가와사키 질환(KD)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법.
가와사키 질환(KD)을 치료하기 위한 방법으로서,
기준 수준에 비하여 상승된 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC) 발현을 갖는 것으로 측정된 대상체에게 항-KD 치료요법을 투여함을 포함하는, 가와사키 질환(KD)을 치료하기 위한 방법.
제35항에 있어서, 상기 항-KD 치료요법이 IgG 투여를 포함하는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 항-KD 치료요법이 아스피린, 코르티코스테로이드 또는 항-TNFα 치료요법의 투여를 포함하는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 대상체가 하기 증상들: 구강 홍반; 발진; 부은 입술; 갈라진 입술; 손의 종창; 발의 종창; 눈 발적; 포도막염; 무균성 수막염; 림프절 염증; 혈관 염증; 관상 동맥류; 발열; 관절 통증; 관절 종창; 또는 조상, 손바닥, 발바닥 및 서혜부에 걸친 피부 박리 중 하나 이상을 나타내는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 상승된 PDGFC 발현 수준이, 상승된 PDGFC RNA 발현 수준인, 방법.
제39항에 있어서, 상기 상승된 PDGFC RNA 발현이, 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 PDGFC RNA의 상승된 발현인, 방법.
제39항에 있어서, 상기 상승된 PDGFC 발현이, 기준 수준에 비하여 약 3 내지 약 50배 큰 PDGFC RNA 발현인, 방법.
제35항에 있어서, 상기 기준 수준이, KD를 갖지 않는 대상체로부터의 PDGFC 발현 수준을 나타내는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 대상체가, 기준 수준에 비하여 상승된 EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 또는 OLFM4 발현을 갖는 것으로 측정되는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 대상체가, 기준 수준에 비하여 감소된 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2 또는 TMCC1 발현을 갖는 것으로 측정되는, 방법.
컴퓨터에 의해 실행되는 경우에 컴퓨터가 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드를 포함하는 유형적(tangible) 컴퓨터-판독가능한 매체로서,
a) KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 유래의 샘플 중의 혈소판-유도된 성장 인자 C(PDGFC)의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하는 단계; 및
b) 기준 수준에 대해 비교한 상대적인 수준의 PDGFC 발현을 측정하는 단계[여기서, 기준 수준에 비하여 상승된 PDGFC 발현은 KD의 바이오마커의 존재를 나타낸다]
를 포함하는, 컴퓨터에 의해 실행되는 경우에 컴퓨터가 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드를 포함하는 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체.
제45항에 있어서, 건강한 대상체로부터의 샘플 중의 PDGFC의 발현의 기준 수준에 상응하는 정보를 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제45항에 있어서, 상기 기준 수준이, 상기 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체에 저장되는, 방법.
제45항에 있어서, 상기 정보를 수득하는 것이, 유형적 데이터 저장 장치로부터, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플 중의 PDGFC의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하는 것을 포함하는, 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체.
제45항에 있어서, 컴퓨터에 의해 실행되는 경우에 컴퓨터가 하나 이상의 추가의 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드를 추가로 포함하고, PDGFC의 발현의 상대적인 수준에 상응하는 정보를 유형적 데이터 저장 장치에 전송함을 포함하는, 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체.
제45항에 있어서, 상기 정보를 수득하는 것이, KD를 갖거나 KD를 가질 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플 중의 LOC641518, C21orf57, UBB, FBXO7, LOC731777, BTF3, C13orf15, SFRS2B, HEMGN, HPS1, IFT52, FAM10A7, IFT52, LOC441714, IMMP2L, TMEM57, IFRD2, LOC646784, PYROXD1, MIR155HG, ZNF138, TCC39B, OR7E156P, FANCD2, XPOT, AZIN1, BLOC152, CDK2, MYL5, HRASLS2, TMCC1, EPSTI1, OASL, CEBPA, C9orf167, FHOD1, ALDH3B1, LRSAM1, SIGLEC7, SLC24A4, GAA, RRBP1, DAB2, HIST2H3C, LGALS9, GPR177, CMTM4, FBXO30, WSB2, PAPSS1, SERPINB2, ACTA2, LOC729417, ABCD1, GNB4, MITF, C1QC, CCDC24, PGM5, LOC729816 또는 OLFM4 중 하나 이상의 발현 수준에 상응하는 정보를 수득하는 것을 추가로 포함하는, 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체.
제45항에 있어서, 컴퓨터에 의해 실행되는 경우에, 컴퓨터가 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-판독가능한 코드가, c) 샘플에 대해, 샘플이 KD를 갖는 대상체 유래일 가능성의 지표인 진단학적 점수를 계산하는 것을 추가로 포함하는, 유형적 컴퓨터-판독가능한 매체.