CN108465128A - 一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法。本发明中透明质酸细胞支架材料由透明质酸与二硫交联剂经过酰胺化反应，依次经过透析—冷冻干燥获得透明质酸细胞支架。该细胞支架具有丰富的孔隙，较好的机械强度在移植过程中不会破损，良好的生物相容性。该方法具有原料易得、反应条件温和、工艺简单等优点。制得的水凝胶交联网络中含二硫键，在还原性小分子谷胱甘肽存在下可快速裂解成单链。本发明制得的透明质酸支架力学性能、裂解性能、溶胀性能灵活可控，在促进软骨损伤修复、皮肤修复、细胞培养等方面具有应用前景。

Description

一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种还原响应***联透明质酸细胞支架的制备方法。
背景技术
透明质酸是天然存在于人体皮肤中的具有保水功能的粘多糖，是细胞基质和玻璃体的重要组成部分。它是由(1‐β‐4)D‐葡萄糖醛酸(glucosamine)和(1‐β‐3)N‐乙酰基‐D‐葡萄糖(glucuronic)交替连接组成的一种线性聚阴离子粘多糖，以其独特的分子结构和理化性质在体内显示出重要的生理功能。目前透明质酸以其钠盐为主，广泛应用于化妆品、临床医学、食品等领域。其中，高纯度的透明质酸已广泛应用于眼科、骨科及术后防粘连。
透明质酸可显著促进主动脉及毛细血管内皮细胞的增殖和移动，保护肉芽组织免受氧自由基的破坏，能够促进伤口愈合。然而，透明质酸脆弱的机械性能以及在体内较快的降解速率限制了其应用前景。因此，交联、酯化、接枝等修饰方法常用于透明质酸的改性。目前常用的交联包括物理交联如硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠；化学交联如1,4‐丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，1,2,7,8‐二环氧辛烷(DEO)，二乙烯基砜(DVS)等，通过调节交联剂的浓度及交联时间控制交联程度，延长透明质酸在体内的维持时间。以二乙烯基砜和1,4‐丁二醇二缩水甘油醚为交联剂的HA产品已广泛用于骨科关节炎治疗、手术防粘连、软组织修复和美容整形填充，但在组织工程领域还处于研究阶段。
透明质酸以其良好的生物相容性，利于种子细胞的黏附和增殖，常用作组织工程细胞支架。组织工程对支架材料的要求包括良好的生物相容性、适宜的生物降解性、三维多孔结构利于细胞的增殖、一定的机械强度。交联透明质酸支架用于负载细胞进行创面修复时，当种子细胞转移到待修复创面时，理想情况下需要载体材料自行降解。而实际情况中，由于交联后透明质酸的降解时间延长，若不能及时降解或移除，影响治疗效果。此外，载体的移除造成细胞的损失及创面的二次损伤。为解决这些问题，制备了环境响应性的细胞支架，在外界刺激下可实现靶向传送、触发释放且可控降解，在药物传送及组织修复中具有广阔的应用前景。
透明质酸的降解首选方法为生物大分子酶解法，专一性强、反应条件温和且无副产物，然而，透明质酸酶来源有限，且价格昂贵，在很大程度上限制了其应用。二硫键具有良好的刺激响应性能，在还原性条件下二硫键可有效断裂为巯基，因此，将二硫键引入交联透明质酸的结构中。CN101367884及CN103613686报道了通过半胱胺与透明质酸进行酰胺化反应，得到具有巯基的巯基‐透明质酸水凝胶，溶解，通过巯基之间的氧化反应形成二硫键。主要原理为巯基在空气中自氧化形成硫醇自由基，再相互碰撞交联形成稳定的二硫键，但是这一过程非常缓慢，形成二硫键的时间较长。为了加快巯基偶合的速率，CN105969825报道了以巯基透明质酸为原料，以辣根过氧化酶为催化剂，以酪胺盐酸盐为酶催化底物，通过反相乳液法结合辣根过氧化酶催化交联巯基形成含有二硫键的透明质酸凝胶。该方法中有机溶剂的残留及非离子表面活性剂的残留在材料的使用过程中造成一定的毒性。CN104910369报道了用醛基化透明质酸及侧链中含有二硫键的氨基/甲基丙烯酰双功能化透明质酸，光引发聚合得到交联透明质酸凝胶。二硫键在还原性小分子存在下可有效降解，降解得到的巯基透明质酸可被机体快速吸收，是培养体系具有良好的生物相容性。
目前报道的二硫化合物交联透明质酸，常用于在二硫苏糖醇(DTT)存在下制备巯基‐透明质酸，用于关节润滑及软骨修复。而用于皮肤修复的含有二硫键的交联透明质酸细胞支架的制备鲜有报道。
发明内容
组织愈合过程中，细胞迁移至病灶区域，需要透明质酸支架材料逐渐降解，并且维持细胞生长的微环境，此外降解后的透明质酸对细胞增殖有促进作用，无副产物。未交联的透明质酸水凝胶作为细胞支架力学性能差将会造成移植过程中材料断裂，不能有效的负载细胞生长。而交联透明质酸的机械强度随交联程度相应增大，导致载体支架的降解时间也随之增长，细胞迁移后，材料的残留影响皮肤修复。
为了克服现有技术中对透明质酸的降解不可控，本发明的目的是提供一种还原相应***联透明质酸细胞支架材料的制备方法，在还原性小分子存在下，可快速裂解为单链透明质酸被机体快速吸收。为此，本发明采用以下技术方案：
一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法，其特征在于，将透明质酸水溶液调节pH值至5.0～6.0后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌均匀后，再加入胱胺二盐酸盐水溶液，重调反应体系pH值为5.0-6.0，进行反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到交联透明质酸细胞支架。
本发明交联透明质酸细胞支架材料的制备方法，先将透明质酸的羧基进行活化，再进行酰胺化反应。调节透明质酸水溶液pH值为5.0～6.0，通过NHS活化羧基。
本发明交联透明质酸细胞支架的制备方法，胱胺二盐酸盐的加入，是在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)已混合均匀后，再将胱胺二盐酸盐水溶液入反应体系中，与直接加入到反应体系中相比，反应体系更加均匀，更有利于交联反应。胱胺二盐酸盐水溶液优选于通过滴加的方法加入。
本发明的优势是：一步法制备不同可控交联的透明质酸作为细胞支架，该细胞支架含有二硫键，在还原剂存在下，裂解产生的巯基透明质酸能快速被机体吸收，具有良好的黏膜黏附和原位凝胶性质。
进一步地，该细胞支架具有一定的吸水率，并且具有良好的机械强度，包括抗拉强度、抗撕强度、断裂生长率和弹性模量等。在制备、负载、转移和移植过程中不容易发生破裂，可有效作为负载细胞生长的支架。
本发明所选透明质酸为透明质酸金属盐，如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种混合物，优选透明质酸钠。
本发明所述方法，透明质酸中‐COOH与交联剂中‐NH2的摩尔比优选为1:1～1:0.1；与EDC、NHS的摩尔比优选为1:0.1～0.6:0.1～1。
本发明所述的方法，调节pH值所用试剂为碱或酸溶液，碱溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钠溶液等，优选氢氧化钠,更优选0.1M的氢氧化钠溶液。酸溶液包括有机酸或无机酸，优选盐酸，更优选0.1M HCl。
本发明所述方法，加入胱胺二盐酸盐后，反应温度为0～10℃，优选1～4℃。
本发明所述方法，加入胱胺二盐酸盐后，反应时间为24～120h，优选72‐96h。加入方法优选滴加。
本发明所述方法，透析前将透明质酸凝胶切成0.2‐0.5g小块进行透析。
本发明所述方法，透析液选择磷酸盐缓冲液，优选磷酸盐浓度为0.1‐0.2M，pH为7.0‐7.4。
本发明所述方法，透析时间为24～72h，优选48～72h。
本发明所述方法，冷冻干燥程序包括第一阶段预冻，在‐60～‐10℃保持2～5h，第二阶段升华，在‐40～‐25℃保持4～8h，‐20～0℃保持2～10h，第三阶段解析干燥包括，在10～30℃保持3～6h。
本发明所述方法制备的交联透明质酸细胞支架材料，在还原性物质中，三维结构可快速裂解。所选的还原性小分子包括二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)，优选谷胱甘肽。进一步地，所述的还原性小分子浓度在0.1～10mM。
本发明所述方法制备的交联透明质酸细胞支架材料，用途有多种，包括用于软骨修复的组织工程细胞支架、用于皮肤修复的组织工程细胞支架、用于抗癌药物靶向传送。
为了制备适用于皮肤修复用的细胞支架，本发明采用不同分子量的透明质酸与二硫化合物进行交联反应，透析‐冷冻干燥得到多孔细胞支架，有一定的机械强度，在不同浓度的GSH存在下展示出可控的裂解速度，适用于在皮肤修复中，负载种子细胞的生长。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的交联透明质酸细胞支架的制备方法，以含有二硫键的小分子化合物为交联剂，与透明质酸发生酰胺化反应，一步法直接得到含有二硫键的交联透明质酸水凝胶。该方法具有原料易得、反应条件温和、工艺简单等优点。通过酰胺化反应，使透明质酸形成三维网络结构，此外，三维网络之间通过化学键连接在一起，具有良好的力学性能和结构均匀性。该水凝胶通过冷冻干燥得到多孔细胞支架。
本发明提供的交联透明质酸细胞支架，其交联网络中含有还原响应性的二硫键，在外界刺激下发生降解/解离。该交联透明质酸细胞支架具有还原解离机制，具有优异的生物相容性，良好的力学性能和结构稳定性，灵活可控的解离性能等。因此本发明制得的交联透明质酸水凝胶的力学性能及三维体系可有效调控。该交联透明质酸水凝胶可用于组织工程细胞支架体外培养细胞，可满足细胞的移植和组织及软骨修复，在生物医用领域具有广阔的应用前景。
采用本发明制备方法获得的交联透明质酸细胞支架，可以用于组织工程中软骨修复细胞支架，用于人或动物软骨细胞在体外培养的载体支架，如唇腭裂的修复。
采用本发明制备方法获得的交联透明质酸细胞支架，可用于组织工程皮肤修复体外细胞培养支架，可用于制备表皮细胞、黑素细胞及成纤维细胞的组织工程表皮，用于白癜风、烧伤创面的修复。
采用本发明制备方法获得的交联透明质酸细胞支架，可用于抗癌药物的负载，传送及智能释放。
附图说明：
图1为本发明交联透明质酸的制备路线图；
图2为本发明实施例2制备的交联透明质酸细胞支架材料的还原响应性图。
具体实施方法
通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但他们不是对本发明的限定。
一、交联透明质酸细胞支架材料的制备
实施例1
将透明质酸(1g,‐COOH为2.48mmol)(注射级，分子量为90‐110万)溶解于100mL去离子水中，调节pH值为5.0，依次加入0.475g 1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.285g N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h，将胱胺二盐酸盐(0.153g，0.99mmol)溶于5mL水中滴加入反应体系，滴加完毕，重调pH值为5.0～5.5，4℃搅拌反应96h，于pH为7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，在‐50℃预冻3h，在‐30℃维持6h，在‐15℃维持8h，在25℃解析干燥4h，得到交联透明质酸细胞支架(第一组：1‐1)。
实施例2
将透明质酸(1g,‐COOH为2.48mmol)(注射级，分子量为90‐110万)溶解于80mL去离子水中，调节pH值为5.0，依次加入0.380g 1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.228g N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌2.5h，将胱胺二盐酸盐(0.115g，0.74mmol)溶于5mL水中滴加入反应体系，滴加完毕，重调pH值为5.0～5.5，4℃搅拌反应90h，于pH为7.4磷酸盐缓冲液中透析65h，在‐50℃预冻2h，在‐30℃维持5h，在‐15℃维持8h，在25℃解析干燥4h，得到交联透明质酸细胞支架(第二组：1‐2)。
实施例3
将透明质酸(1g,‐COOH为2.48mmol)(注射级，分子量为170～190万)溶解于60mL去离子水中，调节pH值为5.0，依次加入0.285g 1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.171g N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h，将胱胺二盐酸盐(0.076g，0.49mmol)溶于5mL水中滴加入反应体系，滴加完毕，重调pH值为5.0～5.5，4℃搅拌反应85h，于pH为7.4磷酸盐缓冲液中透析60h，在‐50℃预冻3h，在‐30℃维持6h，在‐15℃维持6h，在25℃解析干燥4h，得到交联透明质酸细胞支架(第三组：1‐3)。
实施例4
将透明质酸(1g,‐COOH为2.48mmol)(注射级，分子量为100万)溶解于50mL去离子水中，调节pH值为5.0，依次加入0.190g 1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.114g N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌1.5h，将胱胺二盐酸盐(0.038g，0.25mmol)溶于5mL水中滴加入反应体系，滴加完毕，重调pH值为5.0～5.5，4℃搅拌反应80h，于pH为7.4磷酸盐缓冲液中透析54h，在‐50℃预冻2h，在‐30℃维持4h，在‐15℃维持6h，在25℃解析干燥4h，得到交联透明质酸细胞支架(第四组：1‐4)。
(二)测定交联透明质酸细胞支架的厚度及孔径
方法：将支架材料剪成小块，用游标卡尺测定材料厚度。结果显示，随着交联剂投入量的增加，材料的厚度逐渐增加。当交联剂含量较高时，得到的细胞支架厚度均匀，孔隙均一。但是当交联剂含量太高时，得到的细胞支架孔隙太小，不利于培养细胞时营养物质的交换。当交联剂含量较低时，冷冻干燥后得到的细胞支架厚度不均匀，尤其在支架较薄的地方材料孔隙较大，部分达到400μm以上，导致材料强度较差，支架容易破碎。因此，从材料厚度及孔径得出，当交联剂比例适中，得到的材料孔隙均一，孔径合适，利用细胞的增殖和生长，可以提供细胞生长的微环境。
表1实施例1‐4得到的交联透明质酸细胞支架厚度及孔径
(三)测定交联透明质酸细胞支架的机械强度
方法：将实施例1‐4得到的交联透明质酸支架材料剪成3×3cm的小片，用拉力机测量所得材料的拉伸性能，结果表明，当二硫交联剂比例较高时，所得的支架材料机械强度较高。支架材料在8～9N时发生断裂，保证了用本发明方法制备的交联透明质酸细胞支架在细胞移植过程中转移、裁剪不会导致材料破损、断裂，可作为负载细胞生长的支架，提供细胞生长的微环境。而当交联程度低时，支架材料厚度不均匀，在较厚的地方拉力在4～5N时，材料发生断裂，较薄的地方拉力在3～4N时，材料发生断裂。透明质酸分子量越大，其拉伸强度越大，如样品1‐2和1‐3所示。
表2实施例1‐4得到的交联透明质酸细胞支架的拉伸强度
样品编号 摩尔比(‐COOH:‐NH2) 拉伸强度(N)
1‐1 1:0.8 8.5±0.9
1‐2 1:0.6 7.3±1.2
1‐3 1:0.4 6.8±1.5
1‐4 1:0.2 4.8±1.8
(四)交联透明质酸细胞支架的膨胀率及吸水率
膨胀率方法：将实施例1‐4所制备的交联透明质酸细胞支架剪成3×3cm的小片，加入30mL 0.9％的氯化钠溶液，置于37℃水浴放置2.5h，测量其长和宽，膨胀率即为溶胀后的长乘以宽与溶胀前的百分比。
吸水率方法：将实施例1‐4所制备的交联透明质酸细胞支架剪成2×2cm的小片，称重，记为w1。加入20mL 37℃的0.9％氯化钠溶液，放置10min后用镊子取出，擦干表面多余的水分，称重，记为w2。吸水率即在一定的时间内支架材料吸收水分的重量与其自身重量的比值。
表3实施例1‐4得到的交联透明质酸细胞支架的膨胀率及吸水率
样品编号 摩尔比(‐COOH:‐NH2) 膨胀率(％) 吸水率
1‐1 1:0.8 94.9±4.3 43.2±1.5
1‐2 1:0.6 99.8±2.9 52.3±2.1
1‐3 1:0.4 103.6±1.9 56.7±3.5
1‐4 1:0.2 113.5±6.3 78.4±2.6
(五)交联透明质酸水凝胶还原性能
方法：将交联透明质酸支架材料(1‐2)裁剪成碎片，称取3份，每份10mg，分别加入0.1mM、2mM、10mM GSH的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)。置于37℃恒温水浴磁力搅拌。反应一定的时间，检测裂解后游离透明质酸含量，取1mL上清液稀释进行糖醛酸含量测定。
GSH(谷胱甘肽)在动物细胞内被认为是重要的氧化还原电对，决定着细胞的抗氧化能力。GSH的引入不会引起细胞毒性，使得载体支架的裂解对细胞的生长没有副作用。在GSH的浓度分别为0.1mM,2mM，10mM条件下对交联透明质酸细胞支架裂解的游离透明质酸进行检测，对照组为pH值7.4的磷酸盐缓冲溶液。结果如图2所示，表明在还原条件下交联透明质酸细胞支架可以随着时间的延长逐步裂解，直到变为溶液状态。此外，若还原剂的浓度越大，所得的支架材料三维结构裂解的越快。因此，在组织工程体外细胞培养移植中，细胞转移至创面之后，为支架材料的移除/降解提供了新的途径。
(六)交联透明质酸水凝胶细胞支架材料的细胞毒性
MTT法
按医疗器械生物学评价:第5部分，体外细胞毒性试验，将所制得的交联透明质酸水凝胶细胞支架剪成0.1～0.3×0.1～0.3的碎片，于1mL细胞培养液中加入1g碎片，于37±2℃放置30h，用培养基稀释浸提液，得到一系列浸提稀释液作为供试液。结果：见表5
表5实施例1‐4得到的交联透明质酸细胞支架的细胞毒性实验结果
样品 细胞毒性反应
1‐1 0级
2‐1 0级
3‐1 <1级
4‐1 <1级
以上结果表明，本发明方法制备的交联透明质酸细胞支架材料性能优越，尤其在材料孔径，膨胀率及吸水率，此外得到的交联透明质酸细胞支架生物相容性良好，具有良好的还原响应性。因此，本发明交联透明质酸细胞支架可用于软骨/皮肤修复中体外细胞的培养，也可以用于负载抗癌药物到特殊位点进行抗癌药物的智能释放。
上述实施例仅为说明本发明的原理，而非限制本发明。在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，但都将在本发明的保护之中。

Claims (9)

1.一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法，其特征在于，将透明质酸水溶液调节pH值至5.0～6.0后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌均匀后，再加入胱胺二盐酸盐水溶液，重调反应体系pH值为5.0～6.0，进行反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到交联透明质酸细胞支架。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透明质酸中-COOH与交联剂中-NH2的摩尔比为1:1～1:0.1；与EDC、NHS的摩尔比为1:0.1～0.6:0.1～1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度维持在0～10℃，优选1～4℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间为24～120h，优选72-96h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调节pH值的试剂，碱溶液优选0.1M的氢氧化钠溶液，酸溶液优选0.1M HCl。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将透明质酸凝胶切成0.2-0.5g小块进行透析。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液优选磷酸盐浓度为0.1-0.2M，pH为7.0-7.4。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透析时间为24～72h，优选48～72h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻干燥程序包括第一阶段预冻，在-10～-60℃保持2～5h，第二阶段升华，在-40～-25℃保持4～8h，-20～0℃保持2～10h，第三阶段解析干燥包括，在10～30℃保持3～6h。
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