CN108458963B - 一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米‑微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置和方法，该装置的微通道包括：进样通道；主通道；多个出样通道；第一电场分离计数通道具有分离计数正极储液孔，并通过第一检测门与主通道垂直连通；第二电场分离计数通道具有分离计数负极储液孔，并通过第二检测门与主通道垂直连通和流场聚焦通道；分离计数正/负极储液孔内均插有铂电极，直流电源正极与第一电场分离计数通道连接，负极与第二电场分离计数通道连接；本发明能够使得待检测细胞不进入检测门就实现计数且在实现不破坏待分离的细胞的条件下，在介电泳力作用下准确流入不同出样通道。
Description
技术领域
本发明涉及细胞的操控技术领域，具体说是涉及一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置和方法。
背景技术
对混合样品中的不同种细胞进行分离，并对分离后的细胞准确的计数在多个领域具有重要的意义和需求；例如，在海洋环境监测，生物医学研究等领域，对研究确定目标混合物(如细菌、病毒、海洋微生物等)不同种类细胞的数量的便携式细胞快速分离计数的装置或方法，一直有着迫切的需求。
在微流控领域进行DEP分离有直流介电泳和交流介电泳两种类型。然而在直流介电泳中为了产生足够强度的介电泳力往往需要数百伏甚至上千伏的电压，而高电压形成的电场又会产生焦耳热效应，细胞或微生物在这种环境中很容易被杀死或裂解；对于交流介电泳而言，通常需要复杂的微电极阵列或十分精确的微电极结构与微流控通道对齐，这种操作是很难实现的。
对于RPS检测来说，传统的RPS检测时颗粒需进入检测门，其会出现颗粒将检测门堵塞的情况，这会使检测结果出现错误，检测精度大大降低降低。
此外由于传统DEP分离需要高电压，当电压很高时，检测到信号的信噪比会随之增大；随着端电压的增加，***的噪音会变大，所以过高的电压会对颗粒计数的结果产生影响。
目前现有常用的细胞分离的方法包括下述几种：
1)过滤分离法：过滤分离法是目前分离匀项混合物常用的方法，它是一种借助多孔介质构成的障碍场使不同尺寸的细胞进行分离的方法。此方法原理简单，但是需要加工精度很高的多孔介质(如滤膜、滤网)，而且过滤精度不好，不能分离两种体积相近的细胞。
2)密度梯度超离心速率分离法：它是一种利用胶体颗粒在离心场力作用下穿过密度梯度区的速率不同，通过控制离心参数，实现纳米颗粒按照尺寸、密度和团聚状态等差异进行分离的方法。此方法利用颗粒的密度和尺寸对颗粒进行分离，但在超速离心的物理条件下，有的细胞会被破坏，可分离的微小颗粒有一定局限性。
3)场流分级法：它是一种颗粒分离的重要手段，场流分级法是在一个长而窄的隧道中，将场运用于其中的悬浮液或溶液，以垂直(或者其他角度)于流动相的方向进行分离的方法，这种方法能够对尺寸范围较宽的胶体进行持续高分辨分离，但是这种方法不足之处在于样品易损失，主要原因是在样品与分离膜作用的过程中，分离膜会对样品产生吸附，样品的pH值、离子强度等也会发生改变。
4)磁性分离法：磁性分离法是一种利用磁性作用力对细胞进行有效分离的方法，这种方法所需设备体积小、结构简单、维护容易，但是有时为了提高磁场强度，必须选择高磁饱和度的聚磁介质，对聚磁介质的选择具有一定的技术困难，且增加运行的费用。
微流控芯片作为一种新的微型分析平台建立于20世纪90年代，它通过微细加工技术在芯片上构建由储液池、微反应室、微管道等微功能元件构成的微流路***，加载生物样品和反应液后，在压力或电场作用下形成微流路，与芯片进行一种或连续多种的反应，达到对样品快速分析的目的，微流控装置可以将生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离和检测等基本操作集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。它具有液体流动可控、消耗试剂和试样极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点。
最初的分离芯片结构包括一条数百微米宽的主通道和设置与主通道中部并垂直于主通道的电场通道，在电场通道两端利用铂电极与电源连接，由于电场通道与主通道交汇处电场强度很小，为获得良好的分离效果需要很大的电压，当细胞体积很小是需要的电压非常高，这是很难实现的；后来的分离芯片把电场通道与主通道的交汇处做成几微米甚至是纳米级别的流场聚焦通道，这使电场强度在交汇处很大，从而使分离所需电压减小；最新的分离芯片在进样通道下方又加入了一条通道，在所述通道中加入PBS缓冲液，使细胞在缓冲液压力的作用下贴主通道的一侧壁流动，从而经过主通道上电场强度最高的点，这使细胞在一点处所受的介电泳力增加，大大减小了分离所需电压。
此外，由于分离通道和计数通道较为接近，很容易互相形成干扰，影响颗粒的运动与计数的准确程度。
发明内容
鉴于已有技术存在的缺陷，本发明的目的是要提供一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置，该装置能够在计数时使得待检测细胞不需要进入检测门即可实现计数功能且在实现待分离的细胞不会被破坏的条件下，在第一电场分离计数通道的检测门处介电泳力作用下准确流入不同出样通道。由于分离计数通道采用纳米-微米尺寸组合，可以极大的降低所需的电压幅值。
为了实现上述目的，本发明的技术方案：
一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置，该装置包括PDMS微流控芯片、直流电源、信号放大电路以及信号采集与处理单元，所述PDMS微流控芯片为在PDMS基片上凹刻有微通道的一侧与玻璃底片封装为一体，以形成供待测样品流通的微通道的微流控芯片，其特征在于，所述微通道包括：
进样通道，其具有进样储液孔，另一端与主通道的一端相连通；
主通道，其另一端与出样通道相连通；
多个一端分别与所述主通道相连通的出样通道，其另一端具有出样储液孔；
第一电场分离计数通道，其具有分离计数正极储液孔，另一端垂直于所述主通道的通道侧壁中间部分并通过第一检测门与所述主通道相连通；
第二电场分离计数通道，其具有分离计数负极储液孔，另一端垂直于所述主通道的另一侧的通道侧壁中间部分并通过第二检测门与所述主通道相连通；
以及流场聚焦通道，其具有流场聚焦通道储液孔，另一端与主通道的一端相连通；
同时，所述分离计数正极储液孔、分离计数负极储液孔内均插有铂电极，所述直流电源正极与所述第一电场分离计数通道相连接，负极与第二电场分离计数通道相连接；所述直流电源还串联一个参考电阻，所述参考电阻的两端均与所述信号放大元件的输入端连接，所述信号放大元件的输出端与信号采集控制***连接。
进一步的，作为本发明的优选：
所述第一检测门的宽度小于第二检测门的宽度。
进一步的，作为本发明的优选：
所述第一检测门的宽度所对应的数量级为纳米级，所述第二检测门的宽度所对应的数量级为微米级。
进一步的，作为本发明的优选：
所述出样通道的数量为2个。
本发明的另一目的是要提供一种基于所述微流控芯片装置进行细胞分离和计数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、样品滴加：首先在所述微流控芯片装置的各孔中滴加一定量的PBS缓冲液使各个通道润湿后，在所述进样储液孔中滴加一定量的混合样品；
S2、样品输运：接通所述直流电源，使得所述进样储液孔中的混合样品在压力作用下输运至所述主通道，在流场聚焦通道储液孔中PBS缓冲液的作用下沿着主通道的侧壁运动；并在第一检测门或者所述第二检测门附近所形成的不同方向的介电泳力作用下，使得混合样品不进入流场聚焦通道而直接流向不同的出样通道；
S3、信号放大采集分析：通过铂电极采集参考电阻两端电压的脉冲信号，将采集到的信号通过信号放大元件放大后，由信号采集控制***进行记录并显示相应的检测数据，即检测样品的总数；上述混合样品中细胞的个数检测值等于脉冲信号的个数。
与现有计数相比，本发明的有益效果：
1)本发明在进行分离时，其检测时待分离的细胞不会被破坏，并可在介电泳力作用下准确流入不同的出样通道；
2)本发明在计数时，其检测时待分离的细胞不需要进入检测门即可实现计数功能；
3)本发明在进行分离时通过设置了纳米-微米组合通道通过增大电场强度梯度的平方来增强介电泳力，从而有效防止了电压过大造成噪音信号太大引起信噪比降低的问题；
4)本发明操作方便，所采用的纳米通道既可以实现分离又能有效进行计数，从而有效防止了由于两个步骤不连续或操作不当影响检测结果。
附图说明
图1为本发明所述的微流控芯片对应的结构示意例图；
图2为本发明所述的微流控芯片装置对应的结构示意例图。
图中：M、微流控芯片，L、玻璃底片，A、进样储液孔，B、流场聚焦通道储液孔，C、分离计数正极孔，D、分离计数负极孔，E、第一出样孔，F、第二出样孔，1、主通道，2、进样通道，3、流场聚焦通道，4、分离计数正极通道，5、分离计数负极通道，6、第一出样通道，7、第二出样通道，8、第一检测门，9、第二检测门。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
技术背景：由于颗粒流经存在电场的地方时会受到介电泳力的作用，其介电常数的大小往往决定颗粒的受力方向，进而使其流向不同方向；同时在流过存在电场的微孔时会对电场产生明显的扰动，使得相应的微孔两端电压变化而产生电压脉冲信号，因此检测电压脉冲信号的个数，即可实现记录样品的个数。
基于上述设计背景，如图1所示实例，本发明设计了一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置，其主要包括玻璃底片L、PDMS微流控芯片M、信号放大元件以及作为信号采集控制***的计算机；所述PDMS微流控芯片为在PDMS基片上凹刻有微通道的一侧与玻璃底片封装为一体，以形成供待测样品流通的微通道的微流控芯片，其特征在于，所述微通道包括：
进样通道，其具有进样储液孔，另一端与主通道的一端相连通；主通道，其另一端与出样通道相连通；两个一端分别与所述主通道相连通的出样通道即第一出样通道与第二出样通道，其另一端具有出样储液孔；自所述主通道的通道侧壁中间部分分别与主通道垂直的电场分离计数通道；其包括第一电场分离计数通道以及第二电场分离计数通道，第一电场分离计数通道具有分离计数正极储液孔，另一端垂直于所述主通道的通道侧壁中间部分并通过第一检测门与所述主通道相连通；第二电场分离计数通道具有分离计数负极储液孔，另一端垂直于所述主通道的另一侧的通道侧壁中间部分并通过第二检测门与所述主通道相连通；以及流场聚焦通道，其具有流场聚焦通道储液孔，另一端与主通道的一端相连通；同时，所述分离计数正极储液孔、分离计数负极储液孔内均插有铂电极，所述直流电源正极与所述第一电场分离计数通道相连接，负极与第二电场分离计数通道相连接；所述直流电源还串联一个参考电阻，所述参考电阻的两端均与所述信号放大元件的输入端连接，所述信号放大元件的输出端与信号采集控制***连接。对应的所述微流控芯片装置的工作过程：所述待分离混合细胞从进样通道进入主通道，然后经过所述第一/二检测门，在介电泳力的作用下实现分离，同时由于细胞经过所述第一/二检测门时会引起回路电压变化进而引起参考电阻的电压变化，从而实现计数。
进一步的，作为本发明的优选：
所述第一电场分离计数通道、第二电场分离计数通道的通道宽度为0.75μm。
进一步的，作为本发明的优选：
所述第一检测门的宽度小于第二检测门的宽度，优选的，所述第一检测门的宽度所对应的数量级为纳米级，所述第二检测门的宽度所对应的数量级为微米级。设置这样的纳米-微米组合通道结构，很大程度上使电场汇集到一点即使得电场施加在纳米-微米通道组合内，使分离和计数同时进行，不受中间过程的干扰，同时能够提高电场强度平方的梯度，也就是增强了介电泳力，极大地减少分离所需电压来保证细胞不会将检测门堵塞(所述第一/二检测门不需要颗粒进入就可以实现计数，避免了颗粒进入检测门引起的堵塞)，进而提高了计数精度且优化了分离计数效果。另，在所述进样通道与主通道交汇处有滴加PBS培养液的流场聚焦通道以保证颗粒在主通道上靠近上述第一/二检测门的一侧流动。
优选的所述信号方法元件采用差分放大器元件。
本发明的另一目的是要提供一种基于所述微流控芯片装置进行细胞分离和计数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品滴加：首先在所述微流控芯片的各个孔中滴加少量的PBS缓冲液使通道润湿，在所述进样储液孔中滴加一定量的混合样品，在所述流场聚焦通道的储液孔滴加适量的PBS缓冲液；
2)样品输运：接通所述直流电源，使得所述进样通道储液孔中的混合样品在压力作用下输运至所述主通道，并在流场聚焦通道储液孔中PBS的作用下贴主通道靠检测门一侧壁运动，颗粒在经过垂直主通道的第一/二检测门时，由于受电场力和压力的作用，继续沿直线向前运动即混合样品不进入流场聚焦通道。混合样品在第一/二检测门受到不同方向的介电泳力，流向不同的出样通道；
3)信号放大采集分析：通过计数通道两侧的铂电极采集参考电阻两端电压的脉冲信号，采集到的信号通过参考电阻连接信号放大元件放大后，由信号采集控制***进行记录并显示相应的检测数据，即检测样品的总数；上述细胞的个数检测值等于计数通道脉冲信号的个数相等。
下面以聚苯乙烯样品颗粒和荧光聚苯乙烯颗粒为例进行分离和计数，如图2所示：
本实施案例的装置参数：本实施案例所用的芯片进样通道的尺寸40*8μm(宽×高)，主通道的尺寸是120*8μm(宽×高)；流场聚焦通道尺寸为120*8μm(宽×高)；出样通道尺寸为120*8μm(宽×高)；检测门尺寸为0.75*8μm(宽×高)；待操作样品为5.2μm聚苯乙烯颗粒和7μm荧光聚苯乙烯颗粒混合溶液；缓冲液为PBS(1×)溶液；施加于电场聚焦正极孔和电场聚焦负极孔的电压为80V。
该装置包括位于所述PDMS微流控芯片上的进样储液孔A、主通道流场聚焦孔B、分离计数正极孔C、分离计数负极孔D、第一出样孔E、第二出样孔F以及主通道1、进样通道2、流场聚焦通道3、分离计数正极通道4、分离计数负极通道5、第一出样通道6、第二出样通道7，第一检测门8，第二检测门9；其中在分离计数正极孔C和分离计数负极孔D之间分别***两根铂电极提供80V电压；并在80V电压的一路串联一个参考电阻R连接；在参考电阻R两端通过两根导线并联于一差分放大器的两个输入端；差分放大器的输出端连接至数据采集卡并通过计算机显示。
基于上述装置进行分离计数的方法，包括如下步骤：
1)样品滴加：首先在所述微流控芯片的各孔中滴加少量的PBS缓冲液使通道润湿，在所述进样储液孔A中滴加一定量的混合样品，在所述流场聚焦通道储液孔B滴加适量的PBS缓冲液；
2)样品输运：接通所述直流电源，使得所述进样储液孔A中的混合样品在压力作用下输运至所述主通道1，并在流场聚焦通道储液孔B中PBS的作用下贴主通道靠第一检测门8或者第二检测门9一侧壁运动，颗粒在经过垂直主通道的第一检测门8或者第二检测门9时，由于受电场力和压力的作用，继续沿直线向前运动即混合样品不进入流场聚焦通道3；混合样品在第一检测门8或者第二检测门9受到不同方向的介电泳力，流向第一出样通道6或者第二出样通道7；该步骤的原理为：由于纳米-微米组合通道具有极大的尺寸梯度，所以在第一检测门8或者第二检测门9的电场线十分密集，颗粒在流场聚焦口中PBS缓冲液的作用下沿着主通道1靠电场聚焦口一侧壁运动这样可保证颗粒受到的介电泳力最大，分离效果达到最好；当样品经过检测门时，会对计数口两端的电场线产生扰动，从而使电压发生变化，进一步导致电阻R两端的电压变化，产生检测信号，检测信号经过信号放大器后输入至采集卡并在计算机上显示；
3)信号放大采集分析：通过计数通道两侧的铂电极采集参考电阻两端电压的脉冲信号，采集到的信号通过参考电阻连接信号放大元件放大后，由信号采集控制***进行记录并显示相应的检测数据，即检测样品的总数；上述细胞的个数检测值等于计数通道脉冲信号的个数相等。其检测结果：通过计算机可以直接获得实时检测结果，进而分析出颗粒混合液体中各成分的具体含量。
由上述内容可知本发明在分离过程中，使用纳米-微米通道组合保证颗粒在分离时受到的介电泳力达到最大，减小所需电压，防止细胞被破坏；计数过程中，细胞不需要进入检测门，从而防止细胞将检测门堵塞引起计数结果不准确，噪音信号降低，提高了信噪比；同时由于两个过程连续起来，避免了操作不当造成的干扰和误差，从而有效的提高了检测精度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种基于纳米-微米通道组合进行颗粒和细胞顺序分离和计数的微流控芯片装置，该装置包括PDMS微流控芯片、直流电源、信号放大电路以及信号采集与处理单元，所述PDMS微流控芯片为在PDMS基片上凹刻有微通道的一侧与玻璃底片封装为一体，以形成供待测样品流通的微通道的微流控芯片，其特征在于，所述微通道包括：
进样通道，其具有进样储液孔，另一端与主通道的一端相连通；
主通道，其另一端与出样通道相连通；
多个一端分别与所述主通道相连通的出样通道，其另一端具有出样储液孔； 所述出样通道的数量为2个；
第一电场分离计数通道，其具有分离计数正极储液孔，另一端垂直于所述主通道的通道侧壁中间部分并通过第一检测门与所述主通道相连通；
第二电场分离计数通道，其具有分离计数负极储液孔，另一端垂直于所述主通道的另一侧的通道侧壁中间部分并通过第二检测门与所述主通道相连通；
第一检测门的宽度小于第二检测门的宽度；第一检测门的宽度所对应的数量级为纳米级，所述第二检测门的宽度所对应的数量级为微米级；
以及流场聚焦通道，其具有流场聚焦通道储液孔，另一端与主通道的一端相连通； 在所述进样通道与主通道交汇处有滴加PBS培养液的流场聚焦通道以保证颗粒在主通道上靠近所述第一检测门、第二检测门的一侧流动；
同时，所述分离计数正极储液孔、分离计数负极储液孔内均插有铂电极，所述直流电源正极与所述第一电场分离计数通道相连接，负极与第二电场分离计数通道相连接；所述直流电源还串联一个参考电阻，所述参考电阻的两端均与所述信号放大电路的输入端连接，所述信号放大电路的输出端与信号采集控制***连接。
2.一种基于权利要求1所述的微流控芯片装置进行细胞分离和计数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、样品滴加：首先在所述微流控芯片装置的各孔中滴加一定量的PBS缓冲液使各个通道润湿后，在所述进样储液孔中滴加一定量的混合样品；
S2、样品输运：接通所述直流电源，使得所述进样储液孔中的混合样品在压力作用下输运至所述主通道，在流场聚焦通道储液孔中PBS缓冲液的作用下沿着主通道的侧壁运动；并在第一检测门或者所述第二检测门附近所形成的不同方向的介电泳力作用下，使得混合样品不进入流场聚焦通道而直接流向不同的出样通道；
S3、信号放大采集分析：通过铂电极采集参考电阻两端电压的脉冲信号，将采集到的信号通过信号放大元件放大后，由信号采集控制***进行记录并显示相应的检测数据，即检测样品的总数；上述混合样品中细胞的个数检测值等于脉冲信号的个数。
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